Die Zellmembran: Ein Segen und ein Fluch

Die Zellmembran umhüllt ein Zytosol voller Organellen, instabiler Moleküle, Enzyme und genetischer Informationen – alles, was für den Stoffwechsel und die Replikation erforderlich ist. Aber es hält auch alles fern, was das empfindliche, dynamische Gleichgewicht des Lebens destabilisieren würde.

Während die Membran für die Zelle essentiell ist, ist sie oft auch eine Unannehmlichkeit für biologische Ingenieure. Die Vorbereitung von Zellen auf die Aufnahme fremder DNA, die Übertragung der DNA über die Zellmembran und die Integration des neuen Befehlssatzes in das Genom des Organismus sind zeitaufwändige und mühsame Aufgaben. Und Forscher sind zunehmend daran interessiert, unser Repertoire an Wirtsorganismen auf exotischere Arten auszudehnen, denen optimierte Transformationsprotokolle fehlen.

Die meisten Prozesse der Proteinproduktion und des Stoffwechsels haben keine grundlegende Voraussetzung für die Verkapselung. Wenn für Ihre Anwendung keine Zelle erforderlich ist, warum dann?Zellfreie Expressionssysteme, die Expressionsmaschinen aus der Zelle in ein Reagenzglas bringen, sind eine Lösung für dieses scheinbar unlösbare Problem.

Diese Systeme können verwendet werden, um grundlegende biologische Fragen zu beantworten, z. B. die Expression in „Protozellen“ zu untersuchen. Sie sind gleichermaßen nützlich für das schnelle Prototyping genetischer und metabolischer Systeme: zum Beispiel die schnelle Optimierung von Stoffwechselwegen zur Maximierung der Produkttiter. Sie können sogar als On-Demand-Plattformen für Biosensorik und Biomanufacturing eingesetzt werden. Wenn Sie mehr darüber erfahren möchten, was zellfreie Systeme sind, warum sie nützlich sind und wie Sie beginnen können, lesen Sie weiter!

Alles (wieder) zusammenfügen

Welche Komponenten sind erforderlich, damit die Übersetzung außerhalb der Zelle stattfindet? Alle zellfreien Proteinexpressionssysteme enthalten mindestens diese drei Teile.

1. Translationale Maschinerie. Dazu gehören Ribosomen und tRNAs sowie Initiations-, Dehn- und Freisetzungsfaktoren, die für die Translation erforderlich sind, und Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, um tRNAs mit ihren verwandten Aminosäuren zu laden.
2. Energie. GTP und ATP zur Translationsverlängerung und tRNA-Aufladung. Zucker, phosphorylierte glykolytische Zwischenprodukte oder andere phosphorylierte Verbindungen werden als Energiequellen verwendet, um sicherzustellen, dass im Verlauf der Reaktion hohe Konzentrationen an Nukleotidtriphosphaten aufrechterhalten werden, die bis zu mehreren Stunden dauern können.
3. Eine zu übersetzende Boten-RNA. Dies kann außerhalb der zellfreien Reaktion durch in vitro T7-Transkription oder innerhalb der zellfreien Reaktion durch Zugabe einer DNA-Schablone und NTPs und Verwendung entweder von T7-RNA-Polymerase oder einer im Zelllysat vorhandenen nativen Polymerase hergestellt werden.

Zellfreie Systeme rekapitulieren die Translation und oft die Transkription und den zentralen Metabolismus außerhalb der Zelle. Es ist jedoch wichtig, sich an die drei Hauptunterschiede zwischen zellfreien und zellbasierten Systemen zu erinnern.

1. Kompartimentierung und räumliche Organisation. Zellfreien Expressionssystemen fehlt eine Barriere zwischen einem biochemischen Reaktionssystem und der Umgebung sowie eine Barriere zwischen funktionell unterschiedlichen Kompartimenten. Alle biochemischen Reaktionen in zellfreien Systemen finden in einer homogenen Umgebung statt.
2. Verdünnung. Zellfreie Systeme sind in Bezug auf ihren makromolekularen Gehalt um eine Größenordnung verdünnter als Zellen. Nicht nur sind die Konzentrationen der Genexpressionsmaschinerie niedriger, sondern auch der Grad der makromolekularen Verdrängung ist niedriger, was biochemische Reaktionsgeschwindigkeiten und Gleichgewichte beeinflussen kann.
3. Ein Genom. Chromosomale DNA wird aus zellfreien Systemen verdaut oder gereinigt. Da zellfreien Systemen ein Genom fehlt, um Verhalten zu programmieren, sind die einzigen Anweisungen, die die Reaktion ausführen wird, diejenigen, die Sie bereitstellen.

Warum sollten Sie zellfrei gehen?

Da zellfreien Systemen eine Zellmembran fehlt, haben sie mehrere Vorteile gegenüber der zellulären Expression.

• Schneller – Es gibt keine langen Tage der Transformation und des Zellwachstums in einem zellfreien Experiment. Eine typische zellfreie Reaktion dauert Stunden, nicht Tage. Der Geschwindigkeitsunterschied zwischen In-cell und zellfrei wird noch größer, wenn in Organismen mit komplexen oder nicht optimierten Transformationsprotokollen oder längeren Kulturzeiten gearbeitet wird. Zellfrei kann eine großartige Möglichkeit sein, genetische Teile für neuartige Wirtsorganismen, genetische Schaltkreise und sogar ganze Stoffwechselwege zu prototypisieren, ohne genetische Informationen in einen hartnäckigen Wirt integrieren zu müssen.Biochemisch flexibel – Die intrazellulären Konzentrationen von kleinen Molekülen, Metaboliten und Enzymen sind alle stark reguliert. Es kann schwierig sein, ihre Konzentrationen auf optimale Ausbeute oder genetische Systemleistung abzustimmen oder sogar zu überwachen, wie hoch diese Konzentrationen sind. Sie haben viel mehr Kontrolle über die biomolekulare Zusammensetzung in einem zellfreien System. Sie können neuartige Cosolute hinzufügen oder sogar Lipidmizellen verwenden, um die Genexpressionsmaschinerie neu zu kapseln, um zu untersuchen, wie sich diese Modifikationen auf die Genexpression auswirken.
• Open – Die Offenheit zellfreier Systeme ist hilfreich bei der Modifizierung der Systemchemie, aber besonders nützlich für Anwendungen, die eine Kommunikation mit einer externen Umgebung erfordern, wie z. B. Sensorik. Es ist derzeit schwierig, zelluläre Sensorplattformen zu entwickeln, die auf Moleküle reagieren, die die Zellmembran nicht durchqueren können, wie Nukleinsäuren. In einem zellfreien Sensorsystem existiert diese Barriere nicht, was einen einfachen Nachweis von Molekülen wie viraler RNA ermöglicht.

…und warum nicht?

Die Unterschiede zwischen der zellulären und der zellfreien Umgebung können zu Unterschieden im experimentellen Ansatz zwischen den beiden Expressionsplattformen führen.

• (noch) nicht High-Throughput – High-Throughput-Durchflusszytometrie und NGS-basierte genetische Charakterisierungsexperimente sind für zelluläre Plattformen etabliert, die genetische Anweisungen bequem zusammen mit ihrem Output verpacken. Zehntausende von genetischen Varianten können mittels Durchflusszytometrie und / oder NGS auf Funktion untersucht werden. Die Anzahl der Varianten, die in einem traditionellen einzelzellfreien Experiment gescreent werden können, ist um einige Größenordnungen geringer als bei In-vivo-Assays mit hohem Durchsatz.
• In vivo ist nicht (notwendigerweise) gleich in vitro – Beachten Sie, dass zellfreie Ergebnisse nicht unbedingt direkt auf die In-vivo-Systemleistung oder sogar auf andere zellfreie Systeme zurückzuführen sind. Aufgrund von Unterschieden in den Konzentrationen von Systemkomponenten ist die zellfreie Leistung zwischen Systemen tendenziell vergleichbar, aber nicht identisch.
• Es ist nicht wirtschaftlich für große Proteinpräparate. Während Erträge von bis zu 2.3 g / l Protein wurden für zellfreie Systeme berichtet, was es mit zellbasierter Expression wettbewerbsfähig macht, Sie würden ein Kulturvolumen von ~ 1000x dem Volumen des zellfreien Reaktionsvolumens benötigen. Dies bedeutet, dass es kein wirtschaftliches System zur Herstellung großer Mengen rekombinanten Proteins ist.

Auswahl eines Systems

Prokaryotisch oder eukaryotisch, selbstgebraut oder kommerziell, auf Rohextraktbasis oder rekonstituiert? Die Wahl des Systems hängt von Ihren spezifischen Bedürfnissen und Einschränkungen ab.

Welche Arten? Sofern Sie keine genetischen Teile in einem bestimmten Organismus prototypisieren oder die Expressionsmaschinerie eines bestimmten Organismus benötigen, sollte ein E. coli-basiertes zellfreies System Ihre erste Wahl sein. E. coli-Systeme, die älteste und am weitesten verbreitete Familie zellfreier Systeme, wurden für eine zuverlässige Genexpression und eine ertragreiche Proteinproduktion optimiert.

Kommerziell werden? Die Herstellung Ihres eigenen Zellextrakts erfordert Ausrüstung und Fachwissen, um große Zellmengen zu kultivieren und zu lysieren. Eine Handvoll Anbieter verkaufen ihre eigenen zellfreien Systeme, abgeleitet von Modellorganismen und Arbeitspferdzelllinien, aber sie sind nicht billig. Erwarten Sie, mindestens 7 US-Dollar pro Reaktion zu zahlen, im Vergleich zu Cent pro Reaktion für ein selbstgebrautes System.

Roh oder rekonstituiert? Die meisten zellfreien Expressionssysteme werden mit rohem Zelllysat hergestellt, das viel mehr Enzyme enthält als die Kerngenexpressionsmaschinerie. Dies kann eine gute Sache sein — moderne E. coli-Lysat-basierte Systeme enthalten Chaperone und den größten Teil des zentralen Stoffwechsels, was die Proteinausbeute und die Produkttiter erhöht. Wenn Sie die Aktivität eines bestimmten Enzyms vollständig entfernen müssen, kann ein rekonstituiertes System, das als PURE (Proteinsynthese unter Verwendung rekombinanter Elemente) bekannt ist, die richtige Option sein. In PURE wird jedes Protein, das für die Genexpression benötigt wird, gereinigt und der Reaktion zugesetzt, wodurch Sie die maximale Kontrolle über die Reaktionszusammensetzung haben. Kürzlich wurden optimierte Protokolle veröffentlicht, um beide Arten von Systemen wirtschaftlich herzustellen.

Um es zusammenzufassen

Zellfreie Systeme sind unverkapselte biosynthetische Systeme, die für die schnelle Entwicklung genetischer Systeme und die Synthese von Bioprodukten nützlich sind. Wenn Sie die Entwicklung eines neuen Biosynthesewegs beschleunigen, einen biochemischen Prozess in einem einfacheren System untersuchen oder eine einfachere Möglichkeit suchen, die Expressionsmaschinerie eines genetisch unlösbaren Wirts zu nutzen, ist die Zellfreiheit möglicherweise das Richtige für Sie.

Weiterführende Literatur

Dudley QM, Karim ALS & Jewett MC. Zellfreies Metabolic Engineering: Biomanufacturing jenseits der Zelle. Biotechnol J. (2015) 10(1): 69-82. DOI: 10.1002/Biozoll.201400330

Garamella J, Marshall R, Rustad M & Noireaux V. Die All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: Eine Plattform für zellfreie synthetische Biologie. ACS Synthetische Biologie (2016) 5(4):344-355. DOI: 10.1021/acssynbio.5b00296

Thermo Fisher Scientific. Überblick über die Proteinexpression. In: Protein Biology Resource Library.

Shimizu Y, Kanamori T, Ueda T. Proteinsynthese durch reine Translationssysteme. Methoden. (2005) 36(3):299-304. DOI: 10.1016/j.ymeth.2005.04.006

Shoba. Eine Einführung in die zellfreie Proteinsynthese. In: Bitesize Bio. 2. März 2009.

Schoab. Gelöst: Geringe Ausbeuten bei der zellfreien Proteinsynthese. In: Bitesize Bio. 21. April 2009.