La Membrana Celular: Una Bendición y una Maldición

La membrana celular envuelve un citosol lleno de orgánulos, moléculas inestables, enzimas e información genética, todo lo necesario para el metabolismo y la replicación. Pero también mantiene fuera cualquier cosa que desestabilice el equilibrio delicado y dinámico de la vida.

Mientras que la membrana es esencial para la célula, a menudo también es un inconveniente para los ingenieros biológicos. Preparar a las células para aceptar ADN extraño, hacer que el ADN atraviese la membrana celular e integrar el nuevo conjunto de instrucciones en el genoma del organismo son tareas laboriosas y que requieren mucho tiempo. Y los investigadores están cada vez más interesados en expandir nuestro repertorio de organismos huéspedes a especies más exóticas, que carecen de protocolos de transformación simplificados.

La mayoría de los procesos de producción y metabolismo de proteínas no tienen ningún requisito fundamental para la encapsulación. Si no se requiere una celda para su aplicación, ¿por qué molestarse?

Los sistemas de expresión sin células, que sacan la maquinaria de expresión de la célula hacia un tubo de ensayo, son una solución a este problema aparentemente intratable.

Estos sistemas se pueden utilizar para responder a preguntas biológicas fundamentales, como estudiar la expresión en «protocélulas». Son igualmente útiles para crear rápidamente prototipos de sistemas genéticos y metabólicos: por ejemplo, optimizar rápidamente las vías metabólicas para maximizar los títulos de los productos. Incluso se pueden utilizar como plataformas de biosensor y biomanufacturación bajo demanda. Si está interesado en obtener más información sobre qué son los sistemas libres de células, por qué son útiles y cómo puede comenzar, ¡siga leyendo!

Volver a juntarlo todo

¿Qué componentes se requieren para que la traducción ocurra fuera de la celda? Todos los sistemas de expresión de proteínas libres de células contienen al menos estas tres partes.

1. Maquinaria de traducción. Esto incluye ribosomas y ARNt, así como factores de iniciación, elongación y liberación necesarios para la traducción, y aminoacil ARNt sintetasas para cargar ARNt con sus aminoácidos afines.
2. Energía. GTP y ATP para impulsar la elongación traslacional y la carga de ARNt. Los azúcares, los intermedios glicolíticos fosforilados u otros compuestos fosforilados se utilizan como fuentes de energía para garantizar que se mantengan altas concentraciones de trifosfatos de nucleótidos durante el transcurso de la reacción, que puede durar hasta varias horas.
3. Un ARN mensajero a traducir. Esto se puede producir fuera de la reacción libre de células a través de la transcripción T7 in vitro, o dentro de la reacción libre de células agregando una plantilla de ADN y NTPs y utilizando ARN polimerasa T7 o una polimerasa nativa presente en el lisado celular.

Los sistemas libres de células recapitulan la traducción, y a menudo la transcripción y el metabolismo central, fuera de la célula. Sin embargo, es importante recordar las tres diferencias principales entre los sistemas libres de células y los basados en células.

1. Compartimentación y organización espacial. Los sistemas de expresión sin células carecen de una barrera entre un sistema de reacción bioquímica y el entorno circundante, así como barreras entre compartimentos funcionalmente distintos. Todas las reacciones bioquímicas en sistemas libres de células tienen lugar en un entorno homogéneo.
2. Dilución. Los sistemas libres de células son un orden de magnitud más diluidos, en términos de su contenido macromolecular, que las células. No solo las concentraciones de la maquinaria de expresión génica son más bajas, sino que el grado de aglomeración macromolecular también es más bajo, lo que puede influir en las tasas de reacción bioquímica y los equilibrios.
3. Un genoma. El ADN cromosómico se digiere o purifica a partir de sistemas libres de células. Debido a que los sistemas libres de células carecen de un genoma para programar el comportamiento, las únicas instrucciones que la reacción llevará a cabo son las que usted proporcione.

¿Por Qué Deberías Ir Sin Celulares?

Debido a que los sistemas libres de células carecen de membrana celular, tienen varias ventajas sobre la expresión celular.

• Más rápido-No hay largos días de transformación y crecimiento celular en un experimento sin células. Una reacción típica sin células tarda horas en completarse, no días. La diferencia de velocidad entre células dentro y libres de células es aún mayor cuando se trabaja en organismos con protocolos de transformación complejos o no optimizados, o tiempos de cultivo más largos. La ausencia de células puede ser una excelente manera de crear prototipos de partes genéticas para nuevos organismos huésped, circuitos genéticos e incluso vías metabólicas completas sin tener que integrar ninguna información genética en un huésped intratable.
• Bioquímicamente flexible: Las concentraciones intracelulares de moléculas pequeñas, metabolitos y enzimas están altamente reguladas. Puede ser difícil ajustar sus concentraciones para obtener un rendimiento óptimo o un rendimiento del sistema genético, o incluso controlar cuáles son esas concentraciones. Usted tiene mucho más control sobre la composición biomolecular en un sistema libre de células. Puede agregar cosolutos novedosos, o incluso usar micelas lipídicas para volver a encapsular la maquinaria de expresión génica, para investigar cómo afectan estas modificaciones a la expresión génica.
• Abierto: La apertura de los sistemas libres de células es útil al modificar la química del sistema, pero es especialmente útil para aplicaciones que requieren comunicación con un entorno exterior, como la detección. Actualmente es difícil diseñar plataformas de detección celular que respondan a moléculas que no pueden cruzar la membrana celular, como los ácidos nucleicos. En un sistema de detección libre de células, esa barrera no existe, lo que permite la detección simple de moléculas como el ARN viral.

…¿y Por Qué No Debería Hacerlo?

Las diferencias entre el entorno celular y el libre de células pueden dar lugar a diferencias en el enfoque experimental entre las dos plataformas de expresión.

• No (todavía) de alto rendimiento: Los experimentos de caracterización genética basados en citometría de flujo de alto rendimiento y NGS están bien establecidos para plataformas celulares, que empaquetan convenientemente instrucciones genéticas junto con sus resultados. Se pueden examinar decenas de miles de variantes genéticas para determinar su función mediante citometría de flujo y / o NGS. El número de variantes que se pueden examinar en un experimento tradicional sin células individuales es varios órdenes de magnitud menor que en ensayos in vivo de alto rendimiento.
• In vivo no equivale (necesariamente) a in vitro: tenga en cuenta que los resultados sin células no necesariamente se corresponden directamente con el rendimiento del sistema in vivo, o incluso con otros sistemas sin células. Debido a las diferencias en las concentraciones de los componentes del sistema, la salida libre de células entre sistemas tiende a ser comparable, pero no idéntica.
• No es económico para preparaciones de proteínas a gran escala. Mientras que rendimientos de hasta 2.se han reportado 3 g/L de proteína para sistemas libres de células, lo que lo hace competitivo con la expresión basada en células, necesitaría un volumen de cultivo de ~1000 veces el volumen del volumen de reacción libre de células. Esto significa que no es un sistema económico para crear grandes cantidades de proteína recombinante.

Elegir un sistema

Procariótico o eucariótico, de fabricación casera o comercial, a base de extracto crudo o reconstituido? La elección del sistema depende de sus necesidades y limitaciones específicas.

Qué especies? A menos que esté creando prototipos de partes genéticas o necesite la maquinaria de expresión de un organismo específico, su primera opción debe ser un sistema libre de células a base de E. coli. Los sistemas de E. coli, la familia de sistemas libres de células más antigua y más utilizada, se han optimizado para una expresión génica confiable y una producción de proteínas de alto rendimiento.

Va comercial? Producir su propio extracto celular requiere equipo y experiencia para cultivar y lisar grandes volúmenes de células. Un puñado de proveedores venden sus propios sistemas libres de células, derivados de organismos modelo y líneas celulares de caballo de batalla, pero no son baratos. Espere pagar al menos 7 7 por reacción, en comparación con centavos por reacción para un sistema casero.

Crudo o reconstituida? La mayoría de los sistemas de expresión sin células están hechos con lisado celular crudo, que contiene muchas más enzimas que la maquinaria de expresión génica central. Esto puede ser algo bueno: los sistemas modernos basados en lisato de E. coli contienen chaperonas y la mayor parte del metabolismo central, lo que aumenta el rendimiento de proteínas y los títulos de los productos. Si necesita eliminar por completo la actividad de una determinada enzima, un sistema reconstituido conocido como PURO (Síntesis de proteínas Utilizando Elementos Recombinantes) puede ser la opción correcta. En PURE, cada proteína requerida para la expresión génica se purifica y se agrega a la reacción, lo que le brinda el máximo control sobre la composición de la reacción. Recientemente se han publicado protocolos simplificados para producir de forma económica ambos tipos de sistemas, pero también puede comprar un kit.

Para resumirlo

Los sistemas libres de células son sistemas biosintéticos no encapsulados que son útiles para el rápido desarrollo del sistema genético y la síntesis de bioproductos. Si está buscando acelerar el desarrollo de una nueva vía biosintética, investigar un proceso bioquímico en un sistema más simple, o desea una forma más simple de usar la maquinaria de expresión de un huésped genéticamente intratable, liberarse de células podría ser adecuado para usted.

Lectura adicional

Dudley QM, Karim AS & Jewett MC. Ingeniería Metabólica Libre de Células: Biomanufacturación más allá de la célula. Biotechnol J. (2015) 10(1): 69-82. DOI: 10.1002 / biot.201400330

Garamella J, Marshall R, Rustad M& Noireaux V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: Una Plataforma para Biología Sintética sin Células. Biología Sintética de ACS (2016) 5(4):344-355. DOI: 10.1021 / acssynbio.5b00296

Thermo Fisher Scientific. Resumen de la Expresión de Proteínas. Biblioteca de Recursos de Biología de Proteínas.

Shimizu Y, Kanamori T, Ueda T. Síntesis de proteínas por sistemas de traducción pura. Método. (2005) 36(3):299-304. DOI: 10.1016 / j. ymeth.2005.04.006

Shoba. Una introducción a la síntesis de Proteínas libres de células. Bitesize Bio. 2 de marzo de 2009.

Shoab. Solucionado: Bajo Rendimiento en la Síntesis de Proteínas Libres de Células. Bitesize Bio. 21 de abril de 2009.