La Membrane cellulaire: Une Bénédiction et une Malédiction

La membrane cellulaire enveloppe un cytosol regorgeant d’organites, de molécules instables, d’enzymes et d’informations génétiques – tout ce qui est nécessaire au métabolisme et à la réplication. Mais elle empêche aussi tout ce qui pourrait déstabiliser l’équilibre délicat et dynamique de la vie.

Si la membrane est essentielle pour la cellule, elle est souvent aussi un inconvénient pour les ingénieurs en biologie. Préparer les cellules à accepter l’ADN étranger, faire passer l’ADN à travers la membrane cellulaire et intégrer le nouvel ensemble d’instructions dans le génome de l’organisme sont des tâches longues et laborieuses. Et les chercheurs sont de plus en plus intéressés à élargir notre répertoire d’organismes hôtes à des espèces plus exotiques, qui n’ont pas de protocoles de transformation simplifiés.

La plupart des processus de production et de métabolisme des protéines n’ont aucune exigence fondamentale pour l’encapsulation. Si aucune cellule n’est requise pour votre application, pourquoi s’embêter?

Les systèmes d’expression sans cellule, qui font sortir la machinerie d’expression de la cellule pour la placer dans un tube à essai, sont une solution à ce problème apparemment insoluble.

Ces systèmes peuvent être utilisés pour répondre à des questions biologiques fondamentales, telles que l’étude de l’expression dans les « protocellules ». Ils sont également utiles pour prototyper rapidement des systèmes génétiques et métaboliques: par exemple, optimiser rapidement les voies métaboliques pour maximiser les titres de produits. Ils peuvent même être utilisés comme plateformes de biocaptage et de biofabrication à la demande. Si vous souhaitez en savoir plus sur ce que sont les systèmes sans cellules, pourquoi ils sont utiles et comment vous pouvez commencer, lisez la suite!

Tout rassembler

Quels composants sont nécessaires pour que la traduction se produise en dehors de la cellule? Tous les systèmes d’expression protéique sans cellules contiennent au moins ces trois parties.

1. Machines de traduction. Cela inclut les ribosomes et les ARNT, ainsi que les facteurs d’initiation, d’élongation et de libération requis pour la traduction, et les aminoacyl ARNt synthétases pour charger les ARNT avec leurs acides aminés apparentés.
2. Énergie. GTP et ATP pour alimenter l’allongement en translation et la charge de l’ARNt. Les sucres, les intermédiaires glycolytiques phosphorylés ou d’autres composés phosphorylés sont utilisés comme sources d’énergie pour s’assurer que des concentrations élevées de triphosphates nucléotidiques sont maintenues au cours de la réaction, qui peut durer jusqu’à plusieurs heures.
3. Un ARN messager à traduire. Ceci peut être produit en dehors de la réaction sans cellules via la transcription in vitro de T7, ou dans la réaction sans cellules en ajoutant un modèle d’ADN et des NTPs et en utilisant soit l’ARN polymérase T7, soit une polymérase native présente dans le lysat cellulaire.

Les systèmes sans cellules récapitulent la traduction, et souvent la transcription et le métabolisme central, à l’extérieur de la cellule. Cependant, il est important de se rappeler les trois principales différences entre les systèmes sans cellules et les systèmes basés sur des cellules.

1. Compartimentation et organisation spatiale. Les systèmes d’expression sans cellules n’ont pas de barrière entre un système de réaction biochimique et l’environnement environnant, ainsi que des barrières entre des compartiments fonctionnellement distincts. Toutes les réactions biochimiques dans les systèmes sans cellules se déroulent dans un environnement homogène.
2. Dilution. Les systèmes sans cellules sont d’un ordre de grandeur plus dilués, en termes de contenu macromoléculaire, que les cellules. Non seulement les concentrations de machines d’expression génique sont plus faibles, mais le degré d’encombrement macromoléculaire est également plus faible, ce qui peut influencer les taux de réaction biochimiques et les équilibres.
3. Un génome. L’ADN chromosomique est digéré ou purifié à partir de systèmes exempts de cellules. Parce que les systèmes sans cellules n’ont pas de génome pour programmer le comportement, les seules instructions que la réaction exécutera sont celles que vous fournissez.

Pourquoi Devriez-Vous Aller Sans Cellule?

Comme les systèmes sans cellules n’ont pas de membrane cellulaire, ils présentent plusieurs avantages par rapport à l’expression cellulaire.

• Plus rapide – Il n’y a pas de longues journées de transformation et de croissance cellulaire dans une expérience sans cellules. Une réaction typique sans cellules prend des heures, pas des jours. La différence de vitesse entre la cellule interne et la cellule libre devient encore plus grande lorsque l’on travaille dans des organismes avec des protocoles de transformation complexes ou non optimisés, ou des temps de culture plus longs. Sans cellules peut être un excellent moyen de prototyper des parties génétiques pour de nouveaux organismes hôtes, des circuits génétiques et même des voies métaboliques entières sans avoir à intégrer aucune information génétique dans un hôte intraitable.
• Biochimiquement flexible – Les concentrations intracellulaires de petites molécules, de métabolites et d’enzymes sont toutes hautement régulées. Il peut être difficile d’ajuster leurs concentrations pour un rendement optimal ou une performance du système génétique, ou même de surveiller quelles sont ces concentrations. Vous avez beaucoup plus de contrôle sur la composition biomoléculaire dans un système sans cellules. Vous pouvez ajouter de nouveaux cosolutes, ou même utiliser des micelles lipidiques pour ré-encapsuler la machinerie d’expression génique, afin d’étudier l’impact de ces modifications sur l’expression génique.
• Ouvert – L’ouverture des systèmes sans cellules est utile lors de la modification de la chimie du système, mais elle est particulièrement utile pour les applications nécessitant une communication avec un environnement extérieur, comme la détection. Il est actuellement difficile de concevoir des plates-formes de détection cellulaires qui répondent à des molécules qui ne peuvent pas traverser la membrane cellulaire, comme les acides nucléiques. Dans un système de détection sans cellules, cette barrière n’existe pas, permettant une détection simple de molécules comme l’ARN viral.

Whyet Pourquoi Pas ?

Les différences entre les environnements cellulaires et sans cellules peuvent conduire à des différences dans l’approche expérimentale entre les deux plates-formes d’expression.

• Pas (encore) haut débit – Les expériences de cytométrie en flux à haut débit et de caractérisation génétique basées sur les NGS sont bien établies pour les plates-formes cellulaires, qui regroupent commodément les instructions génétiques avec leur sortie. Des dizaines de milliers de variantes génétiques peuvent être dépistées pour la fonction en utilisant la cytométrie en flux et / ou la NGS. Le nombre de variantes pouvant être criblées dans une expérience traditionnelle sans cellule unique est inférieur de plusieurs ordres de grandeur à celui des essais in vivo à haut débit.
• In vivo n’est pas (nécessairement) égal à in vitro – Sachez que les résultats sans cellules ne correspondent pas nécessairement directement aux performances du système in vivo, ni même à d’autres systèmes sans cellules. En raison des différences dans les concentrations des composants du système, la production sans cellules entre les systèmes a tendance à être comparable, mais pas identique.
• Ce n’est pas économique pour les préparations protéinées à grande échelle. Alors que les rendements jusqu’à 2.3 g / L de protéines ont été rapportés pour des systèmes sans cellules, ce qui le rend compétitif avec l’expression à base de cellules, vous auriez besoin d’un volume de culture de ~ 1000x le volume du volume de réaction sans cellules. Cela signifie que ce n’est pas un système économique pour créer de grandes quantités de protéines recombinantes.

Choisir un système

Procaryote ou eucaryote, brassé à la maison ou commercial, à base d’extrait brut ou reconstitué? Le choix du système dépend de vos besoins et contraintes spécifiques.

Quelle espèce ? À moins que vous ne prototypiez des parties génétiques ou que vous ayez besoin de la machinerie d’expression d’un organisme spécifique, un système sans cellules à base d’E. coli devrait être votre premier choix. Famille de systèmes sans cellules la plus ancienne et la plus utilisée, les systèmes E. coli ont été optimisés pour une expression génique fiable et une production de protéines à haut rendement.

Devenir commercial ? La production de votre propre extrait cellulaire nécessite de l’équipement et de l’expertise pour cultiver et lyser de grands volumes de cellules. Une poignée de fournisseurs vendent leurs propres systèmes sans cellules, dérivés d’organismes modèles et de lignées cellulaires de pointe, mais ils ne sont pas bon marché. Attendez-vous à payer au moins 7 $ par réaction, contre des cents par réaction pour un système de brassage à domicile.

Brut ou reconstitué ? La plupart des systèmes d’expression sans cellules sont fabriqués avec du lysat cellulaire brut, qui contient beaucoup plus d’enzymes que la machine d’expression génique de base. Cela peut être une bonne chose — les systèmes modernes à base de lysat d’E. coli contiennent des chaperons et la majeure partie du métabolisme central, ce qui augmente les rendements en protéines et les titres de produits. Si vous devez supprimer complètement l’activité d’une certaine enzyme, un système reconstitué appelé PUR (synthèse protéique à l’aide d’éléments recombinants) peut être la bonne option. En version PURE, chaque protéine nécessaire à l’expression des gènes est purifiée et ajoutée à la réaction, ce qui vous permet de contrôler au maximum la composition de la réaction. Des protocoles rationalisés ont récemment été publiés pour produire économiquement les deux types de systèmes, mais vous pouvez également acheter un kit.

Pour résumer

Les systèmes sans cellules sont des systèmes biosynthétiques non encapsulés qui sont utiles pour le développement rapide du système génétique et la synthèse de bioproduits. Si vous cherchez à accélérer le développement d’une nouvelle voie biosynthétique, à étudier un processus biochimique dans un système plus simple, ou si vous souhaitez utiliser plus simplement la machinerie d’expression d’un hôte génétiquement intraitable, aller sans cellules pourrait vous convenir.

Pour en savoir plus

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Shoba. Une introduction à la synthèse protéique sans cellules. Bio de Bitesize. 2 Mars 2009.

Shoab. Résolu: Faibles rendements en Synthèse Protéique sans Cellules. Bio de Bitesize. 21 avril 2009.