cellemembranen: en velsignelse og en forbandelse

cellemembranen omslutter en cytosol, der vrimler af organeller, ustabile molekyler og genetisk information-alt hvad der kræves til metabolisme og replikation. Men det holder også alt, hvad der ville destabilisere livets sarte, dynamiske ligevægt.

mens membranen er afgørende for cellen, er det ofte også en ulempe for biologiske ingeniører. Forberedelse af celler til at acceptere fremmed DNA, at få DNA ‘ et over cellemembranen og integrere den nye instruktion i organismens genom er tidskrævende og besværlige opgaver. Og forskere er i stigende grad interesseret i at udvide vores repertoire af værtsorganismer til mere eksotiske arter, der mangler strømlinede transformationsprotokoller.

de fleste af processerne for proteinproduktion og metabolisme har ikke noget grundlæggende krav til indkapsling. Hvis der ikke kræves nogen celle til din ansøgning, så hvorfor gider?cellefrie ekspressionssystemer, der tager ekspressionsmaskiner ud af cellen og ind i et reagensglas, er en løsning på dette tilsyneladende uhåndterlige problem.

disse systemer kan bruges til at besvare grundlæggende biologiske spørgsmål, såsom at studere udtryk i “protoceller”. De er lige så nyttige til hurtig prototyping af genetiske og metaboliske systemer: for eksempel hurtigt optimering af metaboliske veje for at maksimere produkttitere. De kan endda bruges som on-demand biosensing og biomanufacturing platforme. Hvis du er interesseret i at lære mere om, hvad cellefrie systemer er, hvorfor de er nyttige, og hvordan du kan komme i gang, læs videre!

at sætte det hele sammen

hvilke komponenter er nødvendige for, at translation kan forekomme uden for cellen? Alle cellefrie proteinekspressionssystemer indeholder mindst disse tre dele.

1. translationelle maskiner. Dette inkluderer ribosomer og tRNA ‘er såvel som initiering, forlængelse og frigivelsesfaktorer, der kræves til translation, og aminoacyl-tRNA-syntetaser til at oplade tRNA’ er med deres beslægtede aminosyrer.
2. energi. GTP og ATP til at drive translationel forlængelse og tRNA opladning. Sukkerarter, phosphorylerede glycolytiske mellemprodukter eller andre phosphorylerede forbindelser anvendes som energikilder for at sikre, at høje koncentrationer af nukleotidtriphosphater opretholdes i løbet af reaktionen, hvilket kan vare op til flere timer.
3. et messenger-RNA, der skal oversættes. Dette kan produceres uden for den cellefrie reaktion via in vitro T7-transkription eller inden for den cellefrie reaktion ved at tilføje en DNA-skabelon og NTPs og bruge enten T7 RNA-polymerase eller en nativ polymerase til stede i cellelysatet.

cellefrie systemer rekapitulerer translation og ofte transkription og central metabolisme uden for cellen. Det er dog vigtigt at huske de tre vigtigste forskelle mellem cellefrie og cellebaserede systemer.

1. opdeling og rumlig organisation. Cellefrie ekspressionssystemer mangler en barriere mellem et biokemisk reaktionssystem og det omgivende miljø samt barrierer mellem funktionelt forskellige rum. Alle biokemiske reaktioner i cellefrie systemer finder sted i et homogent miljø.
2. fortynding. Cellefrie systemer er en størrelsesorden mere fortyndet med hensyn til deres makromolekylære indhold end celler. Ikke kun er koncentrationerne af genekspressionsmaskiner lavere, men graden af makromolekylær trængsel er også lavere, hvilket kan påvirke biokemiske reaktionshastigheder og ligevægte.
3. et genom. Kromosomalt DNA fordøjes eller renses ud af cellefrie systemer. Fordi cellefrie systemer mangler et genom til at programmere adfærd, er de eneste instruktioner, som reaktionen vil udføre, dem, du giver.

hvorfor skal du gå cellefri?

fordi cellefrie systemer mangler en cellemembran, har de flere fordele i forhold til cellulær ekspression.

• hurtigere – der er ingen lange dage med transformation og cellevækst i et cellefrit eksperiment. En typisk cellefri reaktion tager timer at gennemføre, ikke dage. Forskellen i hastighed mellem in-Celle og cellefri bliver endnu større, når man arbejder i organismer med komplekse eller uoptimerede transformationsprotokoller eller længere kulturtider. Cellefri kan være en fantastisk måde at prototype genetiske dele til nye værtsorganismer, genetiske kredsløb og endda hele metaboliske veje uden at skulle integrere nogen genetisk information i en uhåndterlig vært.biokemisk fleksibel-de intracellulære koncentrationer af små molekyler, metabolitter og metameter er alle stærkt regulerede. Det kan være svært at indstille deres koncentrationer for optimalt udbytte eller genetisk systemydelse eller endda at overvåge, hvad disse koncentrationer er. Du har meget mere kontrol over den biomolekylære sammensætning i et cellefrit system. Du kan tilføje nye cosolutes eller endda bruge lipidmiceller til at indkapsle genekspressionsmaskiner for at undersøge, hvordan disse ændringer påvirker genekspression.
• Open-åbenheden i cellefrie systemer er nyttig, når man ændrer systemkemi, men det er især nyttigt til applikationer, der kræver kommunikation med et udefrakommende miljø, såsom sensing. Det er i øjeblikket svært at konstruere cellulære sensing platforme, der reagerer på molekyler, der ikke kan krydse cellemembranen, som nukleinsyrer. I et cellefrit sensorsystem eksisterer denne barriere ikke, hvilket muliggør simpel påvisning af molekyler som viralt RNA.

… og hvorfor skulle du ikke?

forskellene mellem de cellulære og cellefrie miljøer kan føre til forskelle i den eksperimentelle tilgang mellem de to ekspressionsplatforme.

• ikke (endnu) high-throughput – high-throughput strøm-cytometri og NGS-baserede genetiske karakteriseringseksperimenter er veletablerede for cellulære platforme, som bekvemt pakker genetiske instruktioner sammen med deres output. Titusinder af genetiske varianter kan screenes for funktion ved hjælp af strømningscytometri og / eller NGS. Antallet af varianter, der kan screenes i et traditionelt enkeltcellefrit eksperiment, er flere størrelsesordener mindre end i in vivo-analyser med høj kapacitet.
• In vivo svarer ikke (nødvendigvis) til in vitro – Vær opmærksom på, at cellefrie resultater ikke nødvendigvis direkte kortlægges til in vivo-systemets ydeevne eller endda til andre cellefrie systemer. På grund af forskelle i koncentrationerne af systemkomponenter har cellefri output mellem systemer tendens til at være sammenlignelig, men ikke identisk.
• det er ikke økonomisk for store proteinpræparater. Mens udbytter på op til 2.3 g / L protein er rapporteret for cellefrie systemer, hvilket gør det konkurrencedygtigt med cellebaseret ekspression, du har brug for et kulturvolumen på ~1000 gange volumenet af det cellefrie reaktionsvolumen. Dette betyder, at det ikke er et økonomisk system til at skabe store mængder rekombinant protein.

valg af System

prokaryot eller eukaryot, hjemmebrygget eller kommercielt, råekstraktionsbaseret eller rekonstitueret? Valget af system afhænger af dine specifikke behov og begrænsninger.

hvilken art? Medmindre du prototyper genetiske dele i eller har brug for ekspressionsmaskineriet for en bestemt organisme, bør et E. coli-baseret cellefrit system være dit første valg. Den ældste og mest anvendte familie af cellefrie systemer, E. coli-systemer er optimeret til pålidelig genekspression og proteinproduktion med højt udbytte.

går kommerciel? Produktion af din egen celle ekstrakt kræver udstyr og ekspertise til kultur og lyse store mængder af celler. En håndfuld leverandører sælger deres egne cellefrie systemer, afledt af modelorganismer og arbejdshestcellelinjer, men de er ikke billige. Forvent at betale mindst $ 7 pr.reaktion, versus cent pr. reaktion for et hjemmebrygget system.

rå eller rekonstitueret? De fleste cellefrie ekspressionssystemer er lavet med rå cellelysat, som indeholder mange flere end kernegenekspressionsmaskineriet. Dette kan være en god ting—moderne E. coli lysatbaserede systemer indeholder chaperoner og det meste af central metabolisme, hvilket øger proteinudbyttet og produkttitere. Hvis du har brug for at fjerne aktiviteten af et bestemt ferment, kan et rekonstitueret system kendt som PURE (proteinsyntese ved hjælp af rekombinante elementer) være den rigtige mulighed. I PURE renses hvert protein, der kræves til genekspression, og tilsættes til reaktionen, hvilket giver dig maksimal kontrol over reaktionssammensætningen. Strømlinede protokoller er for nylig blevet offentliggjort for økonomisk at producere begge typer systemer, men du kan også købe et kit.

for at opsummere det

cellefrie systemer er uindkapslede biosyntetiske systemer, som er nyttige til hurtig genetisk systemudvikling og bioproduktsyntese. Hvis du ønsker at fremskynde udviklingen af en ny biosyntetisk vej, undersøge en biokemisk proces i et enklere system eller gerne vil have en enklere måde at bruge ekspressionsmaskineriet fra en genetisk uhåndterlig vært, kan det være rigtigt for dig at gå cellefri.

yderligere læsning

Dudley km, Karim som& Jøde MC. Cellefri metabolisk teknik: Biomanufacturing ud over cellen. Biotechnol J. (2015) 10(1): 69-82. DOI: 10.1002 / biot.201400330

Garamella J, Marshall R, Rustad m & Noireauks V. Alle E. coli TL værktøjskasse 2.0: en Platform for cellefri syntetisk biologi. ACS Synthetic Biology (2016) 5(4):344-355. DOI: 10.1021 / acssynbio.5b00296

Thermo Fisher Scientific. Oversigt over proteinekspression. Protein Biologi Ressource Bibliotek.proteinsyntese af rene translationssystemer. Metode. (2005) 36(3):299-304. DOI: 10.1016 / j. ymeth.2005.04.006

Shoba. En introduktion til cellefri proteinsyntese. Bites Størrelse Bio. 2. marts 2009.

Shoab. Løst: lave udbytter i cellefri proteinsyntese. Bites Størrelse Bio. 21. April 2009.