cellmembranet: en välsignelse och en förbannelse

cellmembranet omsluter en cytosol som kryllar av organeller, instabila molekyler, enzymer och genetisk information – allt som krävs för metabolism och replikering. Men det håller också ut allt som skulle destabilisera den känsliga, dynamiska jämvikten i livet.

medan membranet är väsentligt för cellen, är det ofta också ett besvär för biologiska ingenjörer. Att förbereda celler för att acceptera främmande DNA, få DNA över cellmembranet och integrera den nya instruktionsuppsättningen i organismens genom är tidskrävande och mödosamma uppgifter. Och forskare är alltmer intresserade av att utöka vår repertoar av värdorganismer till mer exotiska arter, som saknar strömlinjeformade transformationsprotokoll.

de flesta processerna för proteinproduktion och metabolism har inget grundläggande krav för inkapsling. Om ingen cell krävs för din ansökan, varför bry sig?

cellfria uttryckssystem, som tar uttrycksmaskiner ut ur cellen och in i ett provrör, är en lösning på detta till synes otänkbara problem.

dessa system kan användas för att svara på grundläggande biologiska frågor, såsom att studera uttryck i ”protocells”. De är lika användbara för att snabbt prototypa genetiska och metaboliska system: till exempel snabbt optimera metaboliska vägar för att maximera produkttitrar. De kan även användas som on-demand biosensing och biomanufacturing plattformar. Om du är intresserad av att lära dig mer om vad cellfria system är, varför de är användbara och hur du kan komma igång, läs vidare!

att sätta ihop allt (tillbaka)

vilka komponenter krävs för att översättning ska ske utanför cellen? Alla cellfria proteinuttryckssystem innehåller åtminstone dessa tre delar.

1. Translational machinery. Detta inkluderar ribosomer och tRNA, såväl som initiering, töjning och frisättningsfaktorer som krävs för översättning, och aminoacyl-tRNA-syntetaser för att ladda tRNA med deras besläktade aminosyror.
2. energi. GTP och ATP för att driva translationell töjning och tRNA-laddning. Sockerarter, fosforylerade glykolytiska mellanprodukter eller andra fosforylerade föreningar används som energikällor för att säkerställa att höga koncentrationer av nukleotidtrifosfater bibehålls under reaktionens gång, vilket kan ta upp till flera timmar.
3. ett budbärar-RNA som ska översättas. Detta kan produceras utanför den cellfria reaktionen via in vitro T7-transkription, eller inom den cellfria reaktionen genom att lägga till en DNA-mall och NTPs och använda antingen T7 RNA-polymeras eller ett nativt polymeras närvarande i celllysatet.

cellfria system rekapitulerar översättning, och ofta transkription och central metabolism, utanför cellen. Det är dock viktigt att komma ihåg de tre huvudskillnaderna mellan cellfria och cellbaserade system.

1. avdelning och rumslig organisation. Cellfria uttryckssystem saknar en barriär mellan ett biokemiskt reaktionssystem och den omgivande miljön, liksom barriärer mellan funktionellt distinkta fack. Alla biokemiska reaktioner i cellfria system sker i en homogen miljö.
2. utspädning. Cellfria system är en storleksordning mer utspädd, vad gäller deras makromolekylära innehåll, än celler. Inte bara är koncentrationerna av genuttrycksmaskiner lägre, men graden av makromolekylär trängsel är också lägre, vilket kan påverka biokemiska reaktionshastigheter och jämvikter.
3. ett genom. Kromosomalt DNA smälts eller renas ur cellfria system. Eftersom cellfria system saknar ett genom för att programmera beteende är de enda instruktionerna som reaktionen kommer att utföra de som du tillhandahåller.

varför ska du gå cellfri?

eftersom cellfria system saknar cellmembran har de flera fördelar jämfört med celluttryck.

• snabbare – det finns inga långa dagar av transformation och celltillväxt i ett cellfritt experiment. En typisk cellfri reaktion tar timmar att slutföra, inte dagar. Skillnaden i hastighet mellan cell-och cellfri blir ännu större när man arbetar i organismer med komplexa eller ooptimerade transformationsprotokoll eller längre odlingstider. Cellfri kan vara ett bra sätt att prototypa genetiska delar för nya värdorganismer, genetiska kretsar och till och med hela metaboliska vägar utan att behöva integrera någon genetisk information i en otänkbar värd.biokemiskt Flexibel-de intracellulära koncentrationerna av små molekyler, metaboliter och enzymer är alla starkt reglerade. Det kan vara svårt att ställa in deras koncentrationer för optimal avkastning eller genetisk systemprestanda, eller till och med för att övervaka vad dessa koncentrationer är. Du har mycket mer kontroll över den biomolekylära kompositionen i ett cellfritt system. Du kan lägga till nya cosoluter, eller till och med använda lipidmiceller för att inkapsla genuttrycksmaskiner för att undersöka hur dessa modifieringar påverkar genuttryck.
• Open – öppenheten hos cellfria system är till hjälp vid modifiering av systemkemi, men den är särskilt användbar för applikationer som kräver kommunikation med en yttre miljö, såsom avkänning. Det är för närvarande svårt att konstruera cellulära avkänningsplattformar som svarar på molekyler som inte kan korsa cellmembranet, som nukleinsyror. I ett cellfritt avkänningssystem existerar inte den barriären, vilket möjliggör enkel detektering av molekyler som viralt RNA.

… och varför skulle du inte?

skillnaderna mellan de cellulära och cellfria miljöerna kan leda till skillnader i det experimentella tillvägagångssättet mellan de två uttrycksplattformarna.

• inte (ännu) hög genomströmning – hög genomströmningsflödescytometri och ngs-baserade genetiska karakteriseringsexperiment är väletablerade för cellulära plattformar, som bekvämt paketerar genetiska instruktioner tillsammans med deras produktion. Tiotusentals genetiska varianter kan screenas för funktion med hjälp av flödescytometri och / eller NGS. Antalet varianter som kan screenas i ett traditionellt singelcellfritt experiment är flera storleksordningar mindre än i hög genomströmning in vivo-analyser.
• In Vivo är inte (nödvändigtvis) lika in vitro – var medveten om att cellfria resultat inte nödvändigtvis direkt mappas till in vivo-systemprestanda, eller till och med till andra cellfria system. På grund av skillnader i koncentrationerna av systemkomponenter tenderar cellfri produktion mellan system att vara jämförbar men inte identisk.
• Det är inte ekonomiskt för storskaliga proteinpreparat. Medan utbyten på upp till 2.3 g / L protein har rapporterats för cellfria system, vilket gör det konkurrenskraftigt med cellbaserat uttryck, du skulle behöva en odlingsvolym på ~1000x volymen av den cellfria reaktionsvolymen. Det betyder att det inte är ett ekonomiskt system för att skapa stora mängder rekombinant protein.

välja ett System

prokaryot eller eukaryot, hembryggt eller kommersiellt, råextraktbaserat eller rekonstituerat? Valet av system beror på dina specifika behov och begränsningar.

vilken art? Om du inte prototyper genetiska delar i eller behöver uttrycksmaskineriet för en specifik organism, bör ett E. coli-baserat cellfritt system vara ditt första val. Den äldsta och mest använda familjen av cellfria system, E. coli-system har optimerats för tillförlitligt genuttryck och proteinproduktion med hög avkastning.

gå kommersiellt? Att producera ditt eget cellextrakt kräver utrustning och expertis för att odla och lysera stora volymer celler. En handfull leverantörer säljer sina egna cellfria system, härledda från modellorganismer och arbetshästcellinjer, men de är inte billiga. Räkna med att betala minst $ 7 per reaktion, kontra cent per reaktion för ett homebrewed system.

rå eller rekonstituerad? De flesta cellfria uttryckssystem är gjorda med råcelllysat, som innehåller många fler enzymer än kärngenuttrycksmaskinen. Detta kan vara bra—moderna E. coli-lysatbaserade system innehåller chaperoner och det mesta av central metabolism, vilket ökar proteinutbytet och produkttitrar. Om du behöver helt avlägsna aktiviteten hos ett visst enzym kan ett rekonstituerat system som kallas rent (proteinsyntes med rekombinanta element) vara det rätta alternativet. I PURE renas varje protein som krävs för genuttryck och läggs till reaktionen, vilket ger dig maximal kontroll över reaktionskompositionen. Strömlinjeformade protokoll har nyligen publicerats för att ekonomiskt producera båda typerna av system, men du kan också köpa ett kit.

för att sammanfatta det

cellfria system är oinkapslade biosyntetiska system som är användbara för snabb genetisk systemutveckling och bioproduktsyntes. Om du vill påskynda utvecklingen av en ny biosyntetisk väg, undersöka en biokemisk process i ett enklare system, eller vill ha ett enklare sätt att använda uttrycksmaskineriet från en genetiskt otänkbar värd, kan det vara rätt för dig att gå cellfritt.

Vidare läsning

Dudley QM, Karim som& Jewett MC. Cellfri metabolisk teknik: Biomanufacturing bortom cellen. Bioteknol J. (2015) 10(1): 69-82. DOI: 10.1002 / biot.201400330

Garamella J, Marshall R, Rustad M& Noireaux V. All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: en plattform för cellfri syntetisk biologi. ACS syntetisk biologi (2016) 5(4):344-355. DOI: 10.1021/acssynbio.5b00296

Thermo Fisher vetenskaplig. Översikt över proteinuttryck. Proteinbiologi Resursbibliotek.

Shimizu Y, Kanamori T, Ueda T. proteinsyntes av rena översättningssystem. Sätt. (2005) 36(3):299-304. DOI: 10.1016/j.ymeth.2005.04.006

Shoba. En introduktion till cellfri proteinsyntes. Bitesize Bio. 2 mars 2009.

Shoab. Löst: låga utbyten i cellfri proteinsyntes. Bitesize Bio. 21 April 2009.