o înțelegere completă a funcției moleculelor de ARN necesită cunoașterea structurilor lor de ordin superior (2D și 3D), precum și caracteristicile secvenței lor primare. Structura ARN este importantă pentru multe funcții, inclusiv reglarea transcripției și translației, cataliza, transportul proteinelor prin membrane și reglarea virusurilor ARN. Înțelegerile acestor funcții sunt importante pentru biologia de bază, precum și pentru dezvoltarea medicamentelor care pot interveni în cazurile în care apare funcționalitatea patologică a acestor molecule.

grupul nostru face cercetare și dezvoltare de metodologii pentru îmbunătățirea tehnicilor de pliere și analiză a ARN-ului pentru a ajuta la înțelegerea în continuare a proprietăților funcționale ale acestor molecule. În plus, ne concentrăm pe domeniul emergent al nanobiologiei ARN. ARN reprezintă un material molecular relativ nou pentru dezvoltarea nano-dispozitivelor orientate biologic. Este un material interesant datorită funcționalităților sale naturale, capacității sale de a se plia în structuri complexe și de a se auto-asambla. Am dezvoltat metodologii computaționale și experimentale care permit proiectarea nanoparticulelor pe bază de ARN care pot avea o varietate de utilizări. Astfel, cercetarea noastră privind ARN acoperă cinci domenii de cercetare foarte legate și integrate:

1. cercetare în algoritmi pentru predicția și analiza structurii secundare a ARN;
2. biologia ARN și relația sa cu caracteristicile de pliere a secvenței și a structurii secundare;
3. cercetare în algoritmi pentru predicția și analiza structurii ARN 3D și aplicarea lor în biologia ARN;
4. cercetare în algoritmi pentru proiectarea și analiza nanoparticulelor ARN;
5. proiectare experimentală, sinteză și livrare de nanoparticule pe bază de ARN.

ceea ce se învață într-o zonă se aplică celorlalte zone, sporind înțelegerea structurii, funcției și nanobiologiei ARN și auto-asamblării.

Biologia computațională paralelă și structura ARN
schimbările revoluționare în paradigmele computaționale sunt necesare pentru a menține puterea de calcul necesară pentru a rezolva problemele din biologia moleculară. Metodologiile bazate pe arhitecturi computerizate secvențiale nu ar putea fi de așteptat să țină pasul continuu cu vitezele de calcul necesare. Pentru a se potrivi vitezelor mari care sunt necesare, se folosesc acum tehnici de calcul extrem de paralele. Grupul nostru a fost unul dintre pionierii în domeniul biologiei computaționale și al utilizării arhitecturilor computerizate paralele de înaltă performanță pentru acest demers.

tehnici de calcul pentru predicția și analiza structurii secundare a ARN
Am fost primii care au dezvoltat o tehnică de pliere a ARN care utilizează concepte din algoritmi genetici. Algoritmul nostru, MPGAfold, a fost inițial dezvoltat pentru a rula pe un supercomputer SIMD masiv paralel, un MasPar MP-2 cu procesoare 16384. Acest algoritm a fost modificat și acum rulează pe clustere Linux paralele de înaltă performanță. Caracteristicile excepționale de scalare sunt obținute cu capacitatea de a rula algoritmul cu sute de mii de elemente de populație. Predicția ARN pseudoknot face parte din algoritmul genetic, rezultând capacitatea sa de a prezice interacțiunile terțiare. Alte caracteristici includ simularea plierii co-transcripționale, capacitatea de a încorpora diferite reguli energetice și inhibarea forțată și încorporarea tulpinilor elicoidale dorite. În plus, STRUCTURELAB, banca noastră de lucru eterogenă pentru analiza ARN bioinformatică, poate fi utilizată împreună cu MPGAfold și ARNA2D3D pentru a produce coordonate atomice 3D prezise ale structurilor ARN împreună cu vizualizarea acestor structuri. De asemenea, am dezvoltat o nouă metodologie de vizualizare interactivă care face parte din STRUCTURELAB. Această tehnică permite compararea și analiza pliurilor ARN de secvență multiplă din punct de vedere filogenetic, permițând astfel îmbunătățirea rezultatelor structurale prezise într-o familie de secvențe.am dezvoltat KNetFold, un algoritm nou și puternic pentru predicția structurii ARN din aliniamentele secvenței. Algoritmul folosește o rețea unică de clasificare ierarhică bazată pe informații reciproce, termodinamică și perechi de bază Watson-Crick pentru a prezice structurile. În plus, am dezvoltat o aplicație bazată pe web, CorreLogo, care utilizează informații reciproce derivate din aliniamentele secvenței ARN pentru a determina covariațiile între pozițiile pereche de bază. Algoritmul include o măsură unică de eroare și descrie rezultatele în 3D.am dezvoltat, CyloFold, un algoritm unic pentru prezicerea, dintr-o singură secvență, a structurilor secundare ARN care pot include pseudoknots. Acest algoritm utilizează o tehnică nouă care aproximează potențialul ciocnirilor sterice 3D în structurile prezise, filtrând astfel acele structuri din considerație. Algoritmul s-a dovedit a avea o precizie ridicată în comparație cu alți algoritmi de tipul său.
am dezvoltat un software web bazat pe o abordare statistică Bayesiană care estimează acuratețea formării perechilor de baze din datele derivate din experimentele de formă (acilare selectivă 2′ – hidroxil analizată prin extensia primerului). Rezultatele statistice / probabilistice au fost obținute prin analizarea structurilor ARN 3D cunoscute având diferite tipuri de interacțiuni de bază cunoscute și corelarea acestora cu valorile formei. S-a demonstrat că valorile scăzute ale formei se corelează bine cu interacțiunile de asociere și stivuire a bazelor Watson-Crick, în timp ce valorile ridicate ale formei indică regiuni cu un singur catenar. S-ar putea observa îmbunătățiri dacă s-ar lua în considerare și un context de bază 2 sau 3. De asemenea, am arătat că alte tipuri de interacțiuni cunoscute nu s-au corelat bine. Acest tip de informații este util în determinarea în cele din urmă a structurii secundare a ARN-urilor.

studiile computaționale ale căilor de pliere ARN
căile de pliere ARN se dovedesc a fi destul de importante în determinarea funcției ARN. Studiile indică faptul că ARN-ul poate intra în stări conformaționale intermediare care sunt esențiale pentru funcționalitatea sa. Aceste stări pot avea un impact semnificativ asupra expresiei genelor. Se știe că stările funcționale biologic ale moleculelor de ARN pot să nu corespundă stării lor minime de energie, că pot exista bariere cinetice care prind molecula într-un minim local, că plierea apare adesea în timpul transcrierii și există cazuri în care o moleculă va trece între una sau mai multe conformații funcționale înainte de a ajunge la starea sa nativă. Astfel, metodele de simulare a căilor de pliere ale unei molecule de ARN, inclusiv plierea co-transcripțională și localizarea stărilor intermediare semnificative sunt importante pentru predicția structurii ARN și a funcției sale asociate. Mai multe căi biologice de pliere a ARN au fost studiate cu succes folosind MPGAfold și STRUCTURELAB. Exemplele includ viroidul tuberculului axului cartofului, mecanismul de ucidere a gazdei Escherichia coli plasmida R1, virusul hepatitei Delta, HIV și virusul dengue. Aceste rezultate computaționale sunt în concordanță cu cele derivate din experimentele biologice. În plus, au fost prezise interacțiuni structurale noi și stări funcționale intermediare și native importante. Acestea au dus la alte experimente de confirmare de succes.

Predicția computațională a rețelelor de interacțiune ARN
am dezvoltat, de asemenea, programe CovaRna și CovStat pentru a explora rețelele de interacțiune ARN co-variabile pe distanțe lungi folosind alinierea genomului întreg. Această nouă metodologie, care a fost aplicată genomilor Drosophila, este în prezent aplicată altor genomi. O versiune paralelă a programului a fost concepută pentru a accelera procesarea, iar algoritmii se bazează, de asemenea, pe scheme de indexare rapidă și metode statistice conservatoare pentru a determina interacțiuni extrem de semnificative. Metodologia a găsit interacțiuni interesante care sunt legate de sirn-urile endogene, transportul genelor și genele legate de morfogeneză.

studii computaționale ale structurilor tridimensionale de ARN
unele elemente structurale ale moleculelor de ARN au fost studiate folosind mecanica moleculară și simulări de dinamică moleculară. Structurile examinate includ un tetraloop ARN în care s-au efectuat denaturarea dependentă de temperatură a tetraloopului și refoldarea ulterioară la structura cristalină originală. A fost explorată o joncțiune cu trei căi din domeniul Central Central al subunității ribozomale 30S din Thermus thermophilus. S-a stabilit experimental că interacțiunile intermoleculare dintre joncțiunea cu trei căi și proteina ribozomală S15 inițiază procesul de asamblare a subunității ribozomale 30S. Prin utilizarea simulărilor dinamicii moleculare am obținut informații despre tranzițiile conformaționale ale joncțiunii asociate cu legarea S15. Am determinat folosind simulări de dinamică moleculară efectele structurale ale utilizării de noi tipuri de nucleotide ARN modificate care conțin zaharuri carbociclice care sunt constrânse la conformațiile nord sau sud (C2′ sau C3′ exo). În plus, am arătat folosind simulări de dinamică moleculară, modul în care ionii și bazele flancante joacă un rol foarte important în conformațiile monomerului buclei de sărutare a virusului imunodeficienței umane (HIV). Aceste rezultate se corelează bine și pot explica în detaliu, studii experimentale care indică importanța ionilor pentru dimerizarea HIV-1.

am examinat, de asemenea, domeniul pseudoknot al telomerazei. Au fost efectuate modelarea moleculară și dinamica moleculară a domeniului pseudoknot, inclusiv bucla acului de păr. Rezultatele au indicat modul în care dinamica buclei acului de păr a afectat deschiderea și închiderea perechilor de baze u-U necanonice găsite în tulpină. Deschiderea a sugerat puncte de nucleație pentru formarea pseudoknotului. Am examinat, de asemenea, efectul mutațiilor diskeratosis congenita (DKC) în buclă și modul în care acestea au redus tendința de deschidere a tulpinii prin formarea unei rețele de legături de hidrogen relativ stabile în bucla acului. Am modelat pseudoknotul în sine folosind software-ul nostru RNA2D3D combinat cu analiza filogenetică. Am studiat impactul dinamic al mutațiilor DKC asupra pseudoknotului cu rezultatul că pseudoknotul a devenit instabil în timp ce forma acului a devenit mai stabilă.

am descoperit și elucidat structurile 3D ale noilor tipuri de amplificatori de translație care se găsesc în cele 3′ UTR-uri ale virusului Nap Crinkle (primul de acest fel găsit) și virusul mozaicului Enation Pea. Descoperirea acestor elemente structurale a adus la lumină noi mecanisme de îmbunătățire a translației în virusurile plantelor eucariote care pot avea implicații mai largi pentru înțelegerea mecanismelor de translație în general. Acest lucru a fost realizat cu utilizarea combinată a MPGAfold, software-ul nostru de modelare moleculară 3D RNA2D3D și interacțiuni strânse cu colaboratorii noștri experimentali. De asemenea, am modelat un pseudoknot nou găsit în ARNm CCR5. Acest pseudoknot este implicat în schimbarea cadrelor și pare să fie stabilizat de un microARN, o funcție nouă pentru un microARN.
În plus, am folosit metode bazate pe interpolarea rețelei elastice pentru a reduce costurile de calcul legate de dinamica ARN 3D. Traiectoriile dinamice tridimensionale pot fi determinate folosind o reprezentare redusă a atomului și stări conformaționale date. Timpul de calcul poate fi redus de la săptămâni la ore folosind această abordare.
Nanobiologia ARN computațională
nanobiologia ARN reprezintă o nouă modalitate de dezvoltare a nanodispozitivelor care au potențialul de utilizare într-o serie de domenii, inclusiv terapeutice. Bazându-ne pe experiența noastră așa cum s-a subliniat mai sus, am dezvoltat mai multe tehnici computaționale și experimentale (vezi mai jos) care oferă un mijloc de a determina un set de secvențe de nucleotide care se pot asambla în nano complexe dorite. Unul dintre aceste instrumente este o bază de date relațională numită RNAJunction. Baza de date conține informații despre structură și secvență pentru joncțiuni elicoidale ARN cunoscute și interacțiuni cu buclă de sărut. Aceste motive pot fi căutate într-o varietate de moduri, oferind o sursă pentru blocurile de ARN nano. Un alt instrument de calcul, NanoTiler, permite unui utilizator să construiască forme nanometrice pe bază de ARN specificate. NanoTiler oferă o vizualizare grafică 3D a obiectelor proiectate și oferă mijloacele de a lucra interactiv sau cu scripturi de computer pe procesul de proiectare, chiar dacă secvențele precise de ARN nu pot fi încă specificate și un model all-atom nu este disponibil. NanoTiler poate utiliza motivele 3D găsite în baza de date RNAJunction cu cele derivate din modelele de structură secundară ARN specificate pentru a construi o formă nano ARN definită. De asemenea, o căutare combinatorie poate fi aplicată pentru a enumera structuri care nu ar fi luate în considerare în mod normal.

Un alt instrument software bazat pe web pentru proiectarea nanostructurii ARN este NanoFolder, care este unul dintre puținele instrumente software care sunt capabile să prezică structura și atributele secvenței constructelor ARN multi-catenare. Cu acest software este posibil să se specifice motivele de structură secundară dorite și software – ul să prezică setul de secvențe care generează aceste motive dorite cu caracteristicile corecte de pliere intra și inter-strand.

nanobiologie ARN experimentală
pe baza abordărilor computaționale descrise mai sus pentru nanodesignarea ARN, am demonstrat capacitatea de auto-asamblare și funcționalizare experimentală a mai multor nanoparticule pe bază de ARN. Acest lucru a fost realizat cu interacțiuni strânse între abordările experimentale și computaționale care au dus la îmbunătățiri ale ambelor seturi de metodologii. Exemplele includ auto-asamblarea a 6 și 10 cuburi catenare; auto-asamblarea inelelor hexagonale de diferite dimensiuni și inele duble utilizând un motiv ARN extras din natură; modificarea secvențelor din motiv pentru a îmbunătăți randamentul, menținând în același timp geometrii adecvate; și auto-asamblarea structurilor triunghiulare. De asemenea, am dezvoltat tehnici care definesc protocoalele de auto-asamblare și care permit asamblarea co-transcripțională a construcțiilor care pot include și baze modificate pentru a crește stabilitatea chimică a acestor nanoparticule. În plus, am funcționalizat aceste particule cu până la șase sirn-uri diferite pentru a permite stoichiometria controlată și tăcerea genelor și am arătat că aceste particule într-adevăr reduc la tăcere genele desemnate atunci când sunt transfectate în diferite linii celulare.

am explorat, de asemenea, o altă paradigmă bazată pe utilizarea nanoconstructelor hibride ARN / ADN care conțin funcționalități divizate. Acest lucru permite, de exemplu, împărțirea unui siARN Diceable în două componente hibride ADN/ARN cu toehold-uri ADN, care atunci când sunt transfectate în celule se reasamblează într-un duplex ADN și un siARN Diceable. Această abordare hibridă a fost încorporată în nanoringurile și nanocuburile noastre hexagonale. Utilitatea acestei abordări permite, printre altele, activarea controlată a funcționalităților, încorporarea balizelor moleculare pe catenele ADN fără a afecta funcționalitatea ARN și rezistența la degradarea nucleazei. Această abordare a fost încercată cu succes în culturile celulare și în modelele de șoarece tumoral xenograf.
multe dintre sistemele de calcul au fost adaptate la alte medii din interiorul și din afara laboratorului nostru și NIH și sunt accesibile prin intermediul site-ului nostru web la http://www-CCRNP.ncifcrf.gov/~bshapiro.