Um completo entendimento da função de moléculas de RNA requer o conhecimento de suas estruturas de ordem superior (2D e 3D), bem como as características de sua sequência principal. A estrutura do RNA é importante para muitas funções, incluindo a regulação da transcrição e tradução, catálise, transporte de proteínas através das membranas e a regulação dos vírus ARN. As compreensões dessas funções são importantes para a biologia básica, bem como para o desenvolvimento de drogas que podem intervir nos casos em que a funcionalidade patológica dessas moléculas ocorre.o nosso grupo faz investigação e desenvolvimento de metodologias para melhorar as técnicas de dobragem e análise do ARN para ajudar a compreender melhor as propriedades funcionais destas moléculas. Além disso, estamos focando no campo emergente da nanobiologia RNA. RNA representa um material molecular relativamente novo para o desenvolvimento de dispositivos nano biologicamente orientados. É um material interessante por causa de suas funcionalidades naturais, sua capacidade de dobrar em estruturas complexas e auto-montar. Desenvolvemos metodologias computacionais e experimentais que permitem o design de nanopartículas baseadas em RNA que potencialmente têm uma variedade de usos. Assim, a nossa investigação sobre o ARN abrange cinco áreas de investigação altamente relacionadas e integradas:
- Investigação em algoritmos para a predição e análise da estrutura secundária do ARN;
- biologia do ARN e a sua relação com as características de dobragem da sequência e estrutura secundária;Research in algorithms for RNA 3D structure prediction and analysis and their application to RNA biology;
- Research in algorithms for the design and analysis of RNA nanoparticles;
- Experimental design, synthesis and delivery of RNA-based nanoparticles.
O que se aprende numa área é aplicado a outras áreas, melhorando a nossa compreensão da estrutura, função e nanobiologia e auto-montagem do ARN.
Biologia Computacional paralela e estrutura RNA mudanças revolucionárias em paradigmas computacionais são necessárias para manter o poder computacional necessário para resolver problemas em biologia molecular. Não se podia esperar que metodologias baseadas em arquitecturas de computadores sequenciais acompanhassem continuamente as velocidades computacionais necessárias. A fim de acomodar as altas velocidades que são necessárias, técnicas computacionais altamente paralelas são agora empregadas. Nosso grupo foi um dos pioneiros na área de Biologia Computacional e o uso de arquiteturas de computador paralelas de alto desempenho para este empreendimento.
técnicas computacionais para ARN Previsão e Análise de estrutura secundária
Nós fomos os primeiros a desenvolver uma técnica de dobragem de RNA que usa conceitos de Algoritmos Genéticos. Nosso algoritmo, MPGAfold, foi originalmente desenvolvido para executar em um supercomputador SIMD massivamente paralelo, um MP-2 MasPar com 16384 processadores. Este algoritmo foi modificado e agora é executado em clusters paralelos de alto desempenho Linux. Características de escala excepcionais são obtidas com a capacidade de executar o algoritmo com centenas de milhares de elementos da população. A predição de RNA pseudoknot é parte do algoritmo genético, resultando em sua capacidade de prever interações terciárias. Outras características incluem simulação de dobragem Co-transcritional, a capacidade de incorporar diferentes regras de energia, e a inibição forçada e incorporação de caules helicoidais desejados. Além disso, STRUCTURELAB, nosso trabalho heterogêneo de análise Bioinformática de RNA, pode ser usado em conjunto com MPGAfold e RNA2D3D para produzir coordenadas atômicas 3D previstas das estruturas de RNA, juntamente com a visualização dessas estruturas. Além disso, desenvolvemos uma nova metodologia de visualização interativa que faz parte do STRUCTURELAB. Esta técnica permite a comparação e análise de sequências múltiplas de RNA dobras a partir de um ponto de vista filogenético, permitindo assim a melhoria dos resultados estruturais previstos através de uma família de sequências.
nós desenvolvemos KNetFold, um novo e poderoso algoritmo para a predição da estrutura de RNA a partir de alinhamentos de sequência. O algoritmo usa uma rede de classificação hierárquica única baseada em informação mútua, termodinâmica e Watson-Crick base-pairedalentre para prever estruturas. Além disso, desenvolvemos uma aplicação baseada na web, CorreLogo, que usa informação mútua derivada de alinhamentos de sequência de RNA para determinar covariações entre posições emparelhadas de base. O algoritmo inclui uma medida de erro única e retrata resultados em 3D.nós desenvolvemos, CyloFold, um algoritmo único para prever, a partir de uma única sequência, estruturas secundárias RNA que podem incluir pseudoknots. Este algoritmo utiliza uma nova técnica que se aproxima do potencial para confrontos estéricos 3D nas estruturas previstas, filtrando assim essas estruturas de consideração. The algorithm has been shown to have high accuracy when compared to other algorithms of its type.
We developed web software based on a Bayesian statistical approach that estimates the accuracy of base pair formation from data derived from SHAPE (Selective 2′ – Hydroxyl Acilation analyzed by Primer Extension) experiments. Os resultados estatísticos / probabilísticos foram derivados pela análise de estruturas conhecidas RNA 3D com vários tipos de interações de base conhecidas, e correlacionando-as com valores de forma. It was shown that low SHAPE values correlate well with Watson-Crick base emparelhing and stacking interactions while high SHAPE values indicate single stranded regions. As melhorias poderiam ser vistas se um contexto de base 2 ou 3 também fosse tido em conta. Também mostramos que outros tipos de interações conhecidas não se correlacionaram bem. Este tipo de informação é útil na determinação final da estrutura secundária das RNAs.estudos computacionais de Rna Folding Pathways estão provando ser bastante importantes na determinação da função RNA. Estudos indicam que o RNA pode entrar em Estados conformacionais intermediários que são fundamentais para sua funcionalidade. Estes estados podem ter um impacto significativo na expressão genética. Sabe-se que os Estados biologicamente funcionais das moléculas de RNA podem não corresponder ao seu estado energético mínimo, que as barreiras cinéticas podem existir que aprisionam a molécula num mínimo local, que a dobragem ocorre frequentemente durante a transcrição, e que existem casos em que uma molécula irá transitar entre uma ou mais conformações funcionais antes de atingir o seu estado nativo. Assim, métodos para simular as vias de dobragem de uma molécula de RNA, incluindo dobragem Co-transcritional, e localizar estados intermediários significativos são importantes para a previsão da estrutura de RNA e sua função associada. Várias vias biológicas de dobragem do ARN foram estudadas com sucesso usando MPGAfold e STRUCTURELAB. Exemplos incluem o vírus do tubérculo da batateira, o mecanismo de matar hospedeiros do plasmídeo R1 da Escherichia coli, o vírus da hepatite delta, o VIH e o vírus da dengue. Estes resultados computacionais são consistentes com aqueles derivados de experimentos biológicos. Além disso, foram previstas novas interacções estruturais e importantes estados funcionais intermédios e nativos. Estes conduziram a mais experiências confirmatórias bem sucedidas.
Previsão computacional de Rna Interaction Networks
We have also developed programs CovaRna and CovStat to explore long-range co-varying RNA interaction networks using whole genome alinhments. Esta nova metodologia, que foi aplicada aos genomas de Drosophila, está actualmente a ser aplicada a outros genomas. Uma versão paralela do programa foi concebida para acelerar o processamento e os algoritmos também dependem de esquemas de indexação rápida e métodos estatísticos conservadores para determinar interações altamente significativas. A metodologia encontrou interações interessantes que estão relacionadas com siRNAs endógenas, transporte de genes e genes relacionados com a morfogênese.alguns elementos estruturais de moléculas de RNA foram estudados usando mecânica molecular e simulações de dinâmica molecular. As estruturas examinadas incluem um tetraloop RNA onde a desnaturação dependente da temperatura do tetraloop e o subsequente refluxo para a estrutura cristalina original foram realizados. Foi explorada uma junção de três vias a partir do domínio central central da subunidade ribossómica 30 da Thermus thermophilus. Foi determinado experimentalmente que as interações intermoleculares entre a junção de três vias e a proteína S15 ribossómica iniciam o processo de montagem da subunidade ribossómica 30. Usando simulações de dinâmica molecular, obtivemos insights sobre as transições conformacionais da junção associada com a ligação de S15. Determinamos usando simulações de Dinâmica molecular, os efeitos estruturais da utilização de novos tipos de nucleótidos RNA modificados contendo açúcares carbocíclicos que são condicionados a conformações norte ou sul (C2′ ou C3′ exo). Além disso, nós mostramos usando simulações de Dinâmica molecular, como íons e bases de flanco desempenham um papel muito importante no vírus da imunodeficiência humana (HIV) beijando loop monomer conformations. Estes resultados correlacionam-se bem e podem explicar em detalhes, estudos experimentais que indicam a importância dos íons para a dimerização do HIV-1.
também examinamos o domínio pseudoknot da telomerase. Modelagem Molecular e dinâmica molecular do domínio pseudoknot, incluindo seu laço de gancho, foram realizadas. Resultados indicaram como a dinâmica do laço hairpin afetou a abertura e fechamento dos pares de base U-U não canônicos encontrados no tronco. The opening suggested nucleation points for the formation of the pseudoknot. Também examinamos o efeito das mutações diskeratosis congenita (DKC) no ciclo e como elas reduziram a propensão para a abertura da haste, formando uma rede de ligação de hidrogênio relativamente estável no laço do gancho de cabelo. Nós modelamos o próprio pseudoknot usando nosso software RNA2D3D combinado com análise filogenética. Nós estudamos o impacto dinâmico das mutações DKC no pseudoknot com o resultado de que o pseudoknot se tornou instável enquanto a forma hairpin se tornou mais estável.
nós descobrimos e elucidamos as estruturas 3D de novos tipos de realçadores translacionais que são encontrados nos 3 ‘ UTRs do vírus nabo-Ruga (o primeiro do seu tipo encontrado) e o vírus mosaico da ervilha. A descoberta destes elementos estruturais trouxe à luz novos mecanismos de melhoria translacional nos vírus vegetais eucarióticos que podem ter implicações mais amplas para a compreensão dos mecanismos translacionais em geral. Isso foi conseguido com o uso combinado de MPGAfold, nosso software de modelagem molecular 3D RNA2D3D, e interações próximas com nossos colaboradores experimentais. Também modelamos um novo pseudoknot encontrado no mRNA CCR5. Este pseudoknot está envolvido em frameshifting e parece ser estabilizado por um microRNA, uma função nova para um microRNA.
In addition, we have employed methods based on elastic network interpolation to reduce the computational costs related to RNA 3D dynamics. Trajetórias dinâmicas tridimensionais podem ser determinadas usando uma representação atômica reduzida e dados Estados conformacionais. O tempo de cálculo pode ser reduzido de semanas para horas usando esta abordagem.Nanobiologia Rna computacional representa uma nova modalidade para o desenvolvimento de nanodevices que têm o potencial de uso em várias áreas, incluindo a terapêutica. Com base em nossa experiência como descrito acima, desenvolvemos várias técnicas computacionais e experimentais (ver abaixo) que fornecem um meio para determinar um conjunto de sequências de nucleótidos que podem se reunir em complexos nano desejados. Uma dessas ferramentas é um banco de dados relacional chamado RNAJunction. O banco de dados contém informações de estrutura e sequência para junções helicoidais de ARN conhecidas e interações de laço de beijo. Estes motivos podem ser pesquisados de várias maneiras, fornecendo uma fonte para os blocos de construção RNA nano. Outra ferramenta computacional, Nanotler, permite que um usuário construa formas Nano-escalas específicas baseadas em RNA. NanoTiler fornece uma visão gráfica 3D dos objetos que estão sendo projetados e fornece os meios para trabalhar interativamente ou com scripts de computador no processo de projeto, mesmo que as seqüências precisas de RNA ainda não podem ser especificadas, e um modelo All-atom não está disponível. NanoTiler pode usar os motivos 3D encontrados na base de dados RNAJunction com aqueles derivados de padrões de estrutura secundária de RNA especificados para construir uma forma nano definida de RNA. Além disso, uma pesquisa combinatória pode ser aplicada para enumerar estruturas que normalmente não seriam consideradas.
outra ferramenta de software baseada na web para o design de nanoestrutura RNA é NanoFolder, que é uma das poucas ferramentas de software que são capazes de prever a estrutura e atributos de sequência de construções de RNA multi-encalhadas. Com este software é possível especificar os motivos de estrutura secundária desejados e ter o software predizer o conjunto de sequências que geram estes motivos desejados com as características corretas de dobragem intra e inter – strand.com base nas abordagens computacionais acima descritas para NANODESIGN do ARN, demonstrámos a capacidade de auto-montagem experimental e funcionalizar várias nanopartículas baseadas no ARN. Isto foi realizado com interações estreitas entre as abordagens experimental e computacional levando a melhorias em ambos os conjuntos de metodologias. Exemplos incluem a auto-montagem de 6 e 10 cubos de cadeia; a auto-montagem de anéis hexagonais de vários tamanhos e anéis duplos utilizando um motivo RNA extraído da natureza; the modification of sequences in the motif to improve yield while also maintaining appropriate geometries; and the self-assembly of triangular structures. Também desenvolvemos técnicas que definem protocolos de auto-montagem e que permitem a montagem co-transcritional de construções que também podem incluir bases modificadas para aumentar a estabilidade química dessas nanopartículas. Além disso, nós funcionalizamos essas partículas com até seis siRNAs diferentes para permitir estequiometria controlada e silenciamento de genes, e mostrou que essas partículas de fato silenciam os genes designados quando transfectados em várias linhas celulares.
também temos explorado outro paradigma baseado no uso de nanoconstruções híbridas RNA/DNA contendo funcionalidades divididas. Isto permite, por exemplo, a divisão de um siRNA Diceable em dois componentes híbridos de DNA/RNA com moldes de DNA, que quando transfectados em células se reagrupam em um duplex de DNA e um siRNA Diceable. Esta abordagem híbrida foi incorporada nos nossos nanorings hexagonais e nanocubos. A utilidade desta abordagem permite, entre outras coisas, ativação controlada de funcionalidades, incorporação de beacons moleculares nas cadeias de DNA sem intefering com funcionalidade RNA e resistência à degradação nuclease. Esta abordagem tem sido tentada com sucesso em culturas celulares e modelos de ratos tumorais de xenógrafo.muitos dos sistemas computacionais foram adaptados a outros ambientes dentro e fora do nosso laboratório e do NIH e são acessíveis através do nosso site em http://www-CCRNP.ncifcrf.gov/~bshapiro.
