Bruce A. Shapiro, pH. d.

az RNS molekulák működésének teljes megértéséhez ismerni kell a magasabb rendű struktúrákat (2D és 3D), valamint az elsődleges szekvenciájuk jellemzőit. Az RNS szerkezete számos funkció szempontjából fontos, beleértve a transzkripció és transzláció szabályozását, a katalízist, a fehérjék membránokon keresztüli szállítását és az RNS vírusok szabályozását. Ezeknek a funkcióknak a megértése fontos az alapvető biológia, valamint az olyan gyógyszerek kifejlesztése szempontjából, amelyek beavatkozhatnak olyan esetekben, amikor ezen molekulák kóros funkcionalitása bekövetkezik.

csoportunk kutatásokat és módszereket fejleszt az RNS hajtogatásának és elemzési technikáinak javítására, hogy elősegítse ezen molekulák funkcionális tulajdonságainak megértését. Ezen felül az RNS nanobiológia feltörekvő területére összpontosítunk. Az RNS viszonylag új molekuláris anyagot jelent a biológiailag orientált nanoeszközök kifejlesztéséhez. Ez egy érdekes anyag, mert a természetes funkciók, a képességét, hogy összehajtható összetett struktúrák és önálló össze. Olyan számítási és kísérleti módszereket dolgoztunk ki, amelyek lehetővé teszik az RNS-alapú nanorészecskék tervezését, amelyek potenciálisan sokféle felhasználással rendelkeznek. Így az RNS-re vonatkozó kutatásunk öt nagyon kapcsolódó és integrált kutatási területet fed le:

  1. kutatás az RNS másodlagos szerkezetének előrejelzésére és elemzésére szolgáló algoritmusokban;
  2. az RNS biológiája és kapcsolata a szekvencia és a másodlagos struktúra hajtogatási jellemzőivel;
  3. kutatás algoritmusok RNS 3D szerkezet előrejelzése és elemzése és azok alkalmazása RNS biológia;
  4. kutatás algoritmusok tervezése és elemzése RNS nanorészecskék;
  5. kísérleti tervezése, szintézise és szállítása RNS-alapú nanorészecskék.

az egyik területen tanultak a többi területre is vonatkoznak, javítva az RNS szerkezetének, funkciójának, valamint az RNS nanobiológiájának és önszerelésének megértését.

párhuzamos számítási biológia és RNS szerkezet
forradalmi változások számítási paradigmák van szükség, hogy fenntartsák a szükséges számítási teljesítmény, hogy megoldja a problémákat a molekuláris biológia. A szekvenciális számítógépes architektúrákon alapuló módszertanoktól nem várható el, hogy folyamatosan lépést tartsanak a szükséges számítási sebességgel. A szükséges nagy sebességek kielégítése érdekében most nagyon párhuzamos számítási technikákat alkalmaznak. Csoportunk az egyik úttörője volt a számításbiológiának és a párhuzamos nagy teljesítményű számítógépes architektúrák használatának ebben a törekvésben.

számítási technikák az RNS másodlagos szerkezet előrejelzéséhez és elemzéséhez
elsőként dolgoztunk ki olyan RNS hajtogatási technikát, amely genetikai algoritmusok fogalmait használja. Algoritmusunkat, az MPGAfold-ot eredetileg egy masszívan párhuzamos SIMD szuperszámítógépen, egy MasPar MP-2-n futtattuk 16384 processzorokkal. Ezt az algoritmust módosították, és most párhuzamos nagy teljesítményű Linux klasztereken fut. Kivételes méretezési jellemzőket kapunk azzal a képességgel, hogy az algoritmust több százezer populációs elemmel futtassuk. Az RNS pseudoknot predikció a genetikai algoritmus része, amelynek eredményeként képes megjósolni a tercier kölcsönhatásokat. Egyéb jellemzők közé tartozik a kotranszkripciós hajtogatás szimulációja, a különböző energiaszabályok beépítésének képessége, valamint a kívánt spirális szárak kényszerített gátlása és beágyazása. Ezenkívül a structurelab, a heterogén bioinformatikai RNS analízis workbench, az MPGAfold és az RNA2D3D együtt használható az RNS struktúrák előrejelzett 3D atomi koordinátáinak előállítására, ezen struktúrák megjelenítésével együtt. Emellett kifejlesztettünk egy új interaktív vizualizációs módszertant, amely a STRUCTURELAB része. Ez a technika lehetővé teszi a többszörös szekvencia RNS redők összehasonlítását és elemzését filogenetikai szempontból, ezáltal lehetővé téve az előre jelzett szerkezeti eredmények javítását a szekvenciák családjában.
kifejlesztettük a KNetFold-ot, egy új és hatékony algoritmust az RNS szerkezetének előrejelzésére a szekvenciaillesztésekből. Az algoritmus egy egyedi hierarchikus osztályozási hálózatot használ, amely kölcsönös információkon, termodinamikán és Watson-Crick bázispárosításon alapul a struktúrák előrejelzéséhez. Ezenkívül kifejlesztettünk egy webalapú alkalmazást, a CorreLogo-t, amely az RNS-szekvencia-igazításokból származó kölcsönös információkat használja a kovariációk meghatározására az alappárosított pozíciók között. Az algoritmus egyedi hibamérést tartalmaz, és az eredményeket 3D-ben ábrázolja.
kifejlesztettünk, CyloFold, egy egyedi algoritmus előrejelzésére, egyetlen szekvencia, RNS másodlagos struktúrák, amelyek tartalmazhatnak pseudoknots. Ez az algoritmus egy új technikát alkalmaz, amely megközelíti a 3D-s szterikus ütközések lehetőségét az előre jelzett struktúrákban, így kiszűrve ezeket a struktúrákat a megfontolásból. Kimutatták, hogy az algoritmus nagy pontossággal rendelkezik, összehasonlítva más típusú algoritmusokkal.
Olyan bayesi statisztikai megközelítésen alapuló webes szoftvert fejlesztettünk ki, amely becsüli a bázispár képződésének pontosságát az alakból származó adatokból (szelektív 2′ – hidroxil-acilezés Primer kiterjesztéssel elemezve) kísérletek. A statisztikai / valószínűségi eredményeket az ismert RNS 3D struktúrák elemzésével nyertük, amelyek különböző típusú ismert bázis kölcsönhatásokkal rendelkeznek, és korrelálják őket az ALAKÉRTÉKEKKEL. Kimutatták, hogy az alacsony ALAKÉRTÉKEK jól korrelálnak a Watson-Crick bázispárosítással és egymásra rakással, míg a magas ALAKÉRTÉKEK egyszálú régiókat jeleznek. Javulást lehetett látni, ha egy 2 vagy 3 bázis kontextust is figyelembe vettek. Azt is megmutattuk, hogy más típusú ismert kölcsönhatások nem korrelálnak jól. Ez a fajta információ hasznos az RNS-ek másodlagos szerkezetének végső meghatározásában.

az RNS hajtogatási utak számítási vizsgálata
az RNS hajtogatási utak nagyon fontosnak bizonyulnak az RNS funkció meghatározásában. A vizsgálatok azt mutatják, hogy az RNS beléphet köztes konformációs állapotokba, amelyek kulcsfontosságúak a funkcionalitásához. Ezek az állapotok jelentős hatással lehetnek a génexpresszióra. Ismeretes, hogy az RNS-molekulák biológiailag funkcionális állapotai nem feltétlenül felelnek meg minimális energiaállapotuknak, hogy kinetikai akadályok létezhetnek, amelyek a molekulát helyi minimumban csapdába ejtik, hogy a hajtogatás gyakran előfordul a transzkripció során, és vannak olyan esetek, amikor egy molekula egy vagy több funkcionális konformáció között áttér, mielőtt elérné natív állapotát. Így az RNS-molekula hajtogatási útvonalainak szimulálására szolgáló módszerek, beleértve a Ko-transzkripciós hajtogatást és a jelentős köztes állapotok lokalizálását, fontosak az RNS szerkezetének és a kapcsolódó funkciójának előrejelzéséhez. Számos biológiai RNS hajtogatási útvonalat sikeresen tanulmányoztak az MPGAfold és a STRUCTURELAB alkalmazásával. Ilyenek például a burgonya orsógumó viroid, az Escherichia coli R1 plazmid gazdaölő mechanizmusa, a hepatitis delta vírus, a HIV és a dengue vírus. Ezek a számítási eredmények összhangban vannak a biológiai kísérletekből származó eredményekkel. Ezenkívül új szerkezeti kölcsönhatásokat, valamint fontos funkcionális köztes és natív állapotokat jósoltak. Ezek további sikeres megerősítő kísérletekhez vezettek.

az RNS interakciós hálózatok számítási előrejelzése
A CovaRna és a CovStat programokat is kifejlesztettük a nagy hatótávolságú Ko-változó RNS interakciós hálózatok feltárására teljes genom-igazítások felhasználásával. Ezt az új módszertant, amelyet a Drosophila genomokra alkalmaztak, jelenleg más genomokra is alkalmazzák. A program párhuzamos változatát a feldolgozás felgyorsítására fejlesztették ki, és az algoritmusok gyors indexelési sémákra és konzervatív statisztikai módszerekre támaszkodnak a rendkívül jelentős kölcsönhatások meghatározásához. A módszertan érdekes kölcsönhatásokat talált, amelyek az endogén siRNS-ekhez, a géntranszporthoz és a morfogenezishez kapcsolódó génekhez kapcsolódnak.

háromdimenziós RNS-struktúrák számítási vizsgálata
az RNS-molekulák egyes szerkezeti elemeit molekuláris mechanikával és molekuláris dinamikai szimulációkkal tanulmányozták. A vizsgált struktúrák közé tartozik egy RNS-tetraloop, ahol a tetraloop hőmérsékletfüggő denaturálását, majd az azt követő újracsomagolást az eredeti kristályszerkezetre végeztük. Háromutas csomópontot fedeztek fel a Thermus thermophilus 30S riboszomális alegységének központi központi doménjéből. Kísérletileg megállapították, hogy a háromutas csomópont és az S15 riboszomális fehérje közötti intermolekuláris kölcsönhatások elindítják a 30S riboszomális alegység összeszerelésének folyamatát. Molekuláris dinamikai szimulációk segítségével betekintést nyertünk az S15 kötésével összefüggő csomópont konformációs átmeneteibe. Molekuláris dinamikai szimulációk segítségével meghatároztuk az északi vagy déli konformációkra (C2′ vagy C3′ exo) korlátozott karbociklusos cukrokat tartalmazó új típusú módosított RNS nukleotidok felhasználásának szerkezeti hatásait. Ezen kívül molekuláris dinamikai szimulációk segítségével megmutattuk, hogy az ionok és a kísérő bázisok nagyon fontos szerepet játszanak a humán immundeficiencia vírus (HIV) csókoló hurok monomer konformációiban. Ezek az eredmények jól korrelálnak, és részletesen megmagyarázhatják azokat a kísérleti vizsgálatokat, amelyek jelzik az ionok fontosságát a HIV-1 dimerizációban.

megvizsgáltuk a telomeráz pszeudoknot doménjét is. A pszeudoknot domén molekuláris modellezését és molekuláris dinamikáját, beleértve a hajtűhurkot is, elvégeztük. Az eredmények azt mutatták, hogy a hajtűhurok dinamikája hogyan befolyásolta a szárban található nem kanonikus U-U bázispárok nyitását és zárását. A nyílás nukleációs pontokat javasolt a pszeudoknot kialakulásához. Megvizsgáltuk a dyskeratosis congenita (DKC) mutációk hatását a hurokban, valamint azt is, hogy ezek hogyan csökkentették a szár nyitási hajlamát egy viszonylag stabil hidrogénkötési hálózat kialakításával a hajtűhurokban. Magát a pszeudoknotot modelleztük az RNA2D3D szoftverünk segítségével filogenetikai elemzéssel kombinálva. Megvizsgáltuk a DKC mutációk dinamikus hatását a pszeudoknotra, amelynek eredményeként a pszeudoknot instabillá vált, míg a hajtű formája stabilabbá vált.

felfedeztük és tisztáztuk az új típusú transzlációs fokozók 3D-s struktúráit, amelyek megtalálhatók a fehérrépa ráncos vírus (az első ilyen fajta) és a borsó enation Mosaic vírus 3′ UTR-jében. Ezeknek a szerkezeti elemeknek a felfedezése új mechanizmusokat tárt fel az eukarióta növényi vírusok transzlációs fokozására, amelyek szélesebb körű következményekkel járhatnak a transzlációs mechanizmusok megértésében általában. Ezt az MPGAfold, a 3D molekuláris modellező szoftverünk, az RNA2D3D együttes használatával, valamint a kísérleti munkatársainkkal való szoros interakcióval valósítottuk meg. Modelleztünk egy új pszeudoknotot is, amelyet a CCR5 mRNS-ben találtunk. Ez a pszeudoknot részt vesz a kereteltolódásban, és úgy tűnik, hogy egy mikroRNS stabilizálja, ami egy mikroRNS új funkciója.ezenkívül rugalmas hálózati interpoláción alapuló módszereket alkalmaztunk az RNS 3D dinamikájához kapcsolódó számítási költségek csökkentésére. A háromdimenziós dinamikai pályák meghatározhatók redukált atomábrázolással és konformációs állapotokkal. A számítási idő hetekről órákra csökkenthető ezzel a megközelítéssel.
számítási RNS Nanobiológia
az RNS nanobiológia új modalitást jelent a nanoeszközök kifejlesztéséhez, amelyek számos területen alkalmazhatók, beleértve a terápiákat is. A fent vázolt tapasztalatainkra építve számos számítási és kísérleti technikát fejlesztettünk ki (lásd alább), amelyek lehetővé teszik a nukleotidszekvenciák halmazának meghatározását, amelyek a kívánt nano komplexekké összeállhatnak. Ezen eszközök egyike az RNAJunction nevű relációs adatbázis. Az adatbázis az ismert RNS spirális csomópontokra és a csókhurok kölcsönhatásokra vonatkozó szerkezeti és szekvenciainformációkat tartalmazza. Ezeket a motívumokat különféle módon lehet keresni, forrást biztosítva az RNS nano építőelemeihez. Egy másik számítási eszköz, a NanoTiler lehetővé teszi a felhasználó számára, hogy meghatározott RNS-alapú nanoméretű alakzatokat készítsen. A NanoTiler 3D-s grafikus képet nyújt a tervezett objektumokról, és biztosítja az eszközöket interaktívan vagy számítógépes szkriptekkel való munkavégzéshez a tervezési folyamatban, annak ellenére, hogy a pontos RNS-szekvenciák még nem adhatók meg, és egy all-atom modell nem áll rendelkezésre. A NanoTiler felhasználhatja az RNAJunction adatbázisban található 3D-s motívumokat a meghatározott RNS másodlagos szerkezeti mintákból származó motívumokkal egy meghatározott RNS nano alak felépítéséhez. Kombinatorikus keresés is alkalmazható olyan struktúrák felsorolására, amelyeket általában nem vennének figyelembe.

egy másik webalapú szoftvereszköz az RNS nanostruktúra tervezéséhez a NanoFolder, amely egyike azon kevés szoftvereszközöknek, amelyek képesek megjósolni a többszálú RNS-konstrukciók szerkezetét és szekvenciatulajdonságait. Ezzel a szoftverrel meg lehet határozni a kívánt másodlagos szerkezeti motívumokat, és a szoftver megjósolhatja azokat a szekvenciákat, amelyek ezeket a kívánt motívumokat generálják a megfelelő intra – és Inter-szál hajtogatási jellemzőkkel.

kísérleti RNS Nanobiológia
Az RNS nanodesign fent leírt számítási megközelítései alapján bebizonyítottuk, hogy képesek kísérletileg több RNS-alapú nanorészecskét összeállítani és funkcionalizálni. Ezt a kísérleti és számítási megközelítések közötti szoros kölcsönhatásokkal valósították meg, ami mindkét módszertan továbbfejlesztéséhez vezetett. Ilyenek például a 6 és 10 sodrott kocka önszerelése; különböző méretű hatszögletű gyűrűk és kettős gyűrűk önszerelése a természetből kivont RNS-motívum felhasználásával; a motívum szekvenciáinak módosítása a hozam javítása érdekében, miközben fenntartja a megfelelő geometriákat; valamint háromszög alakú szerkezetek önszerelése. Olyan technikákat is kifejlesztettünk, amelyek meghatározzák az önszerelési protokollokat, és lehetővé teszik olyan konstrukciók együttes transzkripciós összeszerelését, amelyek módosított bázisokat is tartalmazhatnak ezen nanorészecskék kémiai stabilitásának növelése érdekében. Ezenkívül ezeket a részecskéket akár hat különböző siRNS-sel is funkcionalizáltuk, hogy lehetővé tegyük az ellenőrzött sztöchiometriát és a géncsendesítést, és megmutattuk, hogy ezek a részecskék valóban elhallgattatják a kijelölt géneket, amikor különböző sejtvonalakba transzfektálják őket.

egy másik paradigmát is kutattunk, amely az osztott funkciókat tartalmazó RNS/DNS hibrid nanokonstrukciók használatán alapul. Ez lehetővé teszi például a Diceable siRNS felosztását két DNS/RNS hibrid komponensre DNS toeholdokkal, amelyek a sejtekbe történő transzfektálás során újra összeállnak egy DNS duplex és egy Diceable siRNS. Ezt a hibrid megközelítést beépítették a hatszögletű nanoringjainkba és nanokockáinkba. Ennek a megközelítésnek a hasznossága lehetővé teszi többek között a funkcionalitások ellenőrzött aktiválását, a molekuláris jelzőfények beépülését a DNS-szálakba anélkül, hogy az RNS funkcionalitással inteferálna, valamint a nukleáz lebontásával szembeni rezisztenciát. Ezt a megközelítést sikeresen kipróbálták sejttenyészetekben és xenográf tumor egér modellekben.
számos számítási rendszert adaptáltunk más környezetekhez laboratóriumunkban és az NIH-n belül és kívül, és Weboldalunkon keresztül elérhetők a http://www-CCRNP.ncifcrf.gov/~bshapiro címen.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.