Bruce A. Shapiro, Ph. D.

een volledig begrip van de functie van RNA-moleculen vereist kennis van hun hogere ordestructuren (2D en 3D) en de kenmerken van hun primaire sequentie. De structuur van RNA is belangrijk voor vele functies, met inbegrip van verordening van transcriptie en vertaling, katalyse, Vervoer van proteã nen over membranen en de verordening van de virussen van RNA. Het begrip van deze functies is belangrijk voor de basisbiologie en voor de ontwikkeling van geneesmiddelen die kunnen ingrijpen in gevallen waarin pathologische functionaliteit van deze moleculen optreedt.

onze groep doet onderzoek en ontwikkeling van methodologieën voor het verbeteren van RNA-vouw-en analysetechnieken om ons inzicht in de functionele eigenschappen van deze moleculen te bevorderen. Daarnaast richten we ons op het opkomende gebied van RNA nanobiologie. RNA vertegenwoordigt een vrij nieuw moleculair materiaal voor de ontwikkeling van biologisch georiënteerde Nano-apparaten. Het is een interessant materiaal vanwege zijn natuurlijke functionaliteiten, zijn vermogen om in complexe structuren te vouwen en zelf te monteren. We hebben computationele en experimentele methodologieën ontwikkeld die het mogelijk maken om op RNA gebaseerde nanodeeltjes te ontwerpen die mogelijk een verscheidenheid aan toepassingen hebben. Ons onderzoek naar RNA bestrijkt dus vijf sterk verwante en geïntegreerde onderzoeksgebieden:

  1. onderzoek in algoritmen voor de voorspelling en analyse van de secundaire structuur van RNA;
  2. RNA-biologie en de relatie met de sequentie en secundaire structuur-vouweigenschappen;
  3. onderzoek in algoritmen voor RNA 3D structuur voorspelling en analyse en hun toepassing op RNA biologie;
  4. onderzoek in algoritmen voor het ontwerp en de analyse van RNA nanodeeltjes;
  5. experimenteel ontwerp, synthese en levering van RNA-gebaseerde nanodeeltjes.

wat op het ene gebied wordt geleerd, wordt toegepast op de andere gebieden, waardoor ons begrip van RNA-structuur, functie, en RNA-nanobiologie en zelfassemblage wordt verbeterd.parallelle computationele biologie en RNA-structuur revolutionaire veranderingen in computationele paradigma ‘ s zijn nodig om het noodzakelijke computationele vermogen te behouden om problemen in de moleculaire biologie op te lossen. Van methodologieën gebaseerd op sequentiële computerarchitecturen kon niet worden verwacht dat zij voortdurend gelijke tred zouden houden met de benodigde computationele snelheden. Om tegemoet te komen aan de hoge snelheden die nodig zijn, worden nu zeer parallelle computationele technieken toegepast. Onze groep was een van de pioniers op het gebied van computationele biologie en het gebruik van parallelle high performance computerarchitecturen voor dit streven.

computationele technieken voor de voorspelling en analyse van de secundaire structuur van RNA
We waren de eersten die een RNA-vouwtechniek ontwikkelden die concepten uit genetische algoritmen gebruikt. Ons algoritme, MPGAfold, werd oorspronkelijk ontwikkeld om te draaien op een massaal parallelle SIMD supercomputer, een MasPar MP-2 met 16384 processoren. Dit algoritme werd gewijzigd en draait nu op parallelle high performance Linux clusters. Uitzonderlijke schaalkenmerken worden verkregen met de mogelijkheid om het algoritme uit te voeren met honderdduizenden bevolkingselementen. De voorspelling van de PSEUDOKNOT van RNA maakt deel uit van het genetische algoritme, resulterend in zijn capaciteit om tertiaire interactie te voorspellen. Andere kenmerken omvatten simulatie van co-transcriptional vouwen, de mogelijkheid om verschillende energie regels op te nemen, en de gedwongen remming en inbedding van gewenste spiraalvormige stengels. Bovendien kan STRUCTURELAB, onze heterogene bioinformatical de analyseswerkbank van RNA, in combinatie met MPGAfold en RNA2D3D worden gebruikt om voorspelde 3D atomaire coördinaten van RNA-structuren samen met de visualisatie van deze structuren te produceren. Ook ontwikkelden we een nieuwe interactieve visualisatiemethodologie die deel uitmaakt van STRUCTURELAB. Deze techniek laat de vergelijking en de analyse van veelvoudige vouwen van opeenvolgingsrna van een phylogenetic standpunt toe, waarbij verbetering van voorspelde structurele resultaten over een familie van opeenvolgingen wordt toegestaan.We ontwikkelden KNetFold, een nieuw en krachtig algoritme voor de voorspelling van RNA-structuur op basis van sequentieuitlijningen. Het algoritme maakt gebruik van een uniek hiërarchisch classificatienetwerk gebaseerd op wederzijdse informatie, thermodynamica en Watson-Crick basis-pairedness om structuren te voorspellen. Daarnaast hebben we een web-based applicatie ontwikkeld, CorreLogo, die Wederzijdse informatie gebruikt die is afgeleid van RNA-sequentieuitlijningen om covariaties te bepalen tussen base-gepaarde posities. Het algoritme bevat een unieke foutmeter en toont resultaten in 3D.We ontwikkelden CyloFold, een uniek algoritme voor het voorspellen van, uit een enkele sequentie, RNA secundaire structuren die pseudoknots kunnen bevatten. Dit algoritme gebruikt een nieuwe techniek die het potentieel voor 3D sterische botsingen in de voorspelde structuren benadert, waarbij die structuren uit overweging worden gefilterd. Het algoritme is aangetoond dat het een hoge nauwkeurigheid heeft in vergelijking met andere algoritmen van zijn type.
We ontwikkelden web software gebaseerd op een Bayesiaanse statistische benadering die de nauwkeurigheid van basispaarvorming schat op basis van data afgeleid van SHAPE (selectieve 2′ – Hydroxyl Acylatie geanalyseerd door Primer Extension) experimenten. De statistische / probabilistische resultaten werden afgeleid door bekende 3D structuren van RNA te analyseren die diverse types van bekende basisinteractie hebben, en hen met VORMWAARDEN te correleren. Men toonde aan dat de lage VORMWAARDEN goed correleren met Watson-Crick-basis die en het stapelen interactie in paren rangschikken terwijl de hoge VORMWAARDEN enige vastgelopen gebieden aangeven. Verbeteringen konden worden waargenomen als ook rekening werd gehouden met een 2 of 3-basiscontext. We toonden ook aan dat andere soorten bekende interacties niet goed correleerden. Dit type informatie is nuttig in uiteindelijk het bepalen van de secundaire structuur van RNAs.

computationele Studies van RNA-Vouwroutes
RNA – vouwroutes blijken vrij belangrijk te zijn bij de bepaling van de RNA-functie. De Studies wijzen erop dat RNA tussen conformational Staten kan ingaan die aan zijn functionaliteit sleutel zijn. Deze staten kunnen een significante invloed op genuitdrukking hebben. Het is bekend dat de biologisch functionele Staten van de molecules van RNA niet met hun minimale energietoestand kunnen corresponderen, dat kinetische barrières kunnen bestaan die de molecule in een lokaal minimum vangen, dat het vouwen vaak tijdens transcriptie voorkomt, en gevallen bestaan waarin een molecuul tussen één of meer functionele conformaties zal overgaan alvorens zijn geboortestaat te bereiken. Aldus, zijn de methodes voor het simuleren van de vouwende wegen van een molecule van RNA, met inbegrip van co-transcriptional vouwen, en het plaatsen van significante tussenliggende Staten belangrijk voor de voorspelling van de structuur van RNA en zijn bijbehorende functie. Verschillende biologische RNA-vouwroutes zijn met succes bestudeerd met behulp van MPGAfold en STRUCTURELAB. Voorbeelden zijn de Potato spindle tuber viroid, het gastheer-dodende mechanisme van Escherichia coli plasmide R1, het hepatitis delta virus, HIV, en het dengue virus. Deze computationele resultaten zijn consistent met die afgeleid van biologische experimenten. Daarnaast zijn nieuwe structurele interacties en belangrijke functionele intermediaire en inheemse Staten voorspeld. Deze hebben geleid tot verdere succesvolle bevestigende experimenten.

computationele voorspelling van RNA-Interactienetwerken
We hebben ook programma ‘ s CovaRna en CovStat ontwikkeld om lange-afstand co-variërende RNA-interactienetwerken te verkennen met behulp van gehele genoomuitlijningen. Deze nieuwe methodologie, die op genomen van Drosophila werd toegepast, wordt momenteel toegepast op andere genomen. Een parallelle versie van het programma werd bedacht om de verwerking te versnellen en de algoritmen vertrouwen ook op snelle indexeringsschema ‘ s en conservatieve statistische methoden om zeer significante interacties te bepalen. De methodologie heeft interessante interactie gevonden die met endogeen siRNAs, genvervoer en genen met betrekking tot morfogenese worden gerelateerd.

computationele Studies van driedimensionale RNA-structuren
Sommige structurele elementen van RNA-moleculen zijn bestudeerd met behulp van moleculaire mechanica en moleculaire dynamica simulaties. De onderzochte structuren omvatten een tetraloop van RNA waar de temperatuur-afhankelijke denaturatie van tetraloop en het daaropvolgende opnieuw vouwen aan de originele kristalstructuur werden uitgevoerd. Een Drieweg kruising van het centrale kerndomein van de 30s ribosomale subeenheid van Thermus thermophilus werd onderzocht. Men heeft experimenteel bepaald dat de intermoleculaire interactie tussen de driewegverbinding en de S15 ribosomal proteã ne het proces van de assemblage van de 30s ribosomal subeenheid in werking stelt. Door gebruik te maken van moleculaire dynamica simulaties verkregen we inzicht in de conformationele overgangen van de kruising geassocieerd met de binding van S15. We bepaalden met behulp van moleculaire dynamica simulaties, de structurele effecten van het gebruik van nieuwe types gemodificeerde RNA-nucleotiden die carbocyclische suikers bevatten die beperkt zijn tot Noord-of Zuid-conformaties (C2′ of C3 ‘ exo). Daarnaast toonden we aan de hand van moleculaire dynamicasimulaties, hoe ionen en flankerende basen een zeer belangrijke rol spelen in humaan immunodeficiëntievirus (HIV) kissing loop monomeer conformaties. Deze resultaten correleren goed en kunnen in detail, experimentele studies verklaren die het belang van ionen voor HIV-1 dimerisatie aangeven.

we hebben ook het pseudoknot domein van telomerase onderzocht. Moleculaire modellering en moleculaire dynamica van het pseudoknot domein, inclusief de haarspeldlus, werden uitgevoerd. De resultaten gaven aan hoe de haarspeldlusdynamica het openen en sluiten van de niet-canonieke u-U-basenparen in de stengel beïnvloedde. De opening stelde nucleatiepunten voor voor de vorming van de pseudoknot. We hebben ook het effect van dyskeratosis congenita (DKC) mutaties in de lus onderzocht en hoe ze de neiging tot het openen van de stengel verminderden door het vormen van een relatief stabiel waterstofverbindingsnetwerk in de haarspeldlus. We modelleerden de pseudoknot zelf met behulp van onze RNA2D3D-software gecombineerd met fylogenetische analyse. We bestudeerden de dynamische impact van de DKC mutaties op de pseudoknot met als resultaat dat de pseudoknot onstabiel werd terwijl de haarspeldvorm stabieler werd.

We ontdekten en verhelderden de 3D-structuren van nieuwe typen translationele versterkers die worden gevonden in de 3′ Utr ‘ s van het Raapkrankvirus (de eerste in zijn soort gevonden) en het Pea enation mozaïekvirus. De ontdekking van deze structurele elementen heeft nieuwe mechanismen voor translationele verhoging in eukaryotic installatievirussen aan het licht gebracht die bredere implicaties voor het begrijpen van translationele mechanismen in het algemeen kunnen hebben. Dit werd bereikt met het gecombineerde gebruik van MPGAfold, onze 3D molecular modeling software RNA2D3D, en nauwe interacties met onze experimentele medewerkers. We modelleerden ook een nieuwe pseudoknot gevonden in de CCR5 mRNA. Deze pseudoknot is betrokken bij frameshifting en lijkt te worden gestabiliseerd door een microRNA, een nieuwe functie voor een microRNA.
daarnaast hebben we methoden gebruikt gebaseerd op elastische netwerkinterpolatie om de computationele kosten gerelateerd aan RNA 3D dynamica te verminderen. Driedimensionale dynamica trajecten kunnen worden bepaald met behulp van een gereduceerde atoom representatie en gegeven conformationele toestanden. De rekentijd kan met deze benadering worden teruggebracht van weken naar uren.
computationele RNA Nanobiologie
RNA nanobiologie vertegenwoordigt een nieuwe modaliteit voor de ontwikkeling van nanodevices die het potentieel hebben voor gebruik in een aantal gebieden, waaronder therapeutiek. Voortbouwend op onze ervaring zoals hierboven beschreven, ontwikkelden we verschillende computationele en experimentele technieken (zie hieronder) die een middel bieden om een reeks nucleotidesequenties te bepalen die kunnen assembleren tot gewenste nano-complexen. Een van deze tools is een relationele database genaamd RNAJunction. Het gegevensbestand bevat structuur en opeenvolgingsinformatie voor bekende spiraalvormige verbindingen van RNA en het kussen lijninteractie. Deze motieven kunnen op een verscheidenheid van manieren worden gezocht, die een bron voor de bouwstenen van RNA nano verstrekken. Een ander computationeel hulpmiddel, NanoTiler, staat een gebruiker toe om gespecificeerde RNA-gebaseerde nanoschaal vormen te construeren. NanoTiler biedt een 3D grafische weergave van de objecten die worden ontworpen en biedt de middelen om interactief of met computer scripts te werken aan het ontwerpproces, hoewel de precieze RNA-sequenties nog niet kunnen worden gespecificeerd, en een all-atom model is niet beschikbaar. NanoTiler kan 3D motieven gebruiken die in het RNAJunction-gegevensbestand met die worden gevonden die van gespecificeerde secundaire structuurpatronen van RNA worden afgeleid om een bepaalde nano vorm van RNA te bouwen. Ook kan een combinatorische zoekopdracht worden toegepast om structuren op te sommen die normaal niet in aanmerking zouden worden genomen.

een andere web-based software tool voor RNA nanostructuur ontwerp is NanoFolder, dat is een van de weinige software tools die in staat zijn om de structuur en sequentie attributen van multi-stranded RNA constructies te voorspellen. Met deze software is het mogelijk om de gewenste secundaire structuurmotieven te specificeren en de software de reeks sequenties te laten voorspellen die deze gewenste motieven genereren met de juiste intra – en interstreng vouweigenschappen.

experimentele RNA Nanobiologie
Op basis van de hierboven beschreven computationele benaderingen van RNA nanodesign hebben we het vermogen aangetoond om experimenteel zelf-assembleren en functionaliseren van verschillende RNA-gebaseerde nanodeeltjes. Dit werd bereikt met nauwe interacties tussen de experimentele en computationele benaderingen die leiden tot verbeteringen aan beide reeksen methodologieën. Voorbeelden zijn de zelfassemblage van 6 en 10 gestrande kubussen; de zelfassemblage van zeshoekige ringen van verschillende grootte en dubbele ringen die een RNA-motief gebruiken dat uit de natuur wordt gehaald; de wijziging van opeenvolgingen in het motief om opbrengst te verbeteren terwijl ook het handhaven van aangewezen geometrieën; en de zelfassemblage van driehoekige structuren. We ontwikkelden ook technieken die zelfassemblageprotocollen definiëren en die co-transcriptionele assemblage mogelijk maken van constructies die ook gemodificeerde basen kunnen bevatten om de chemische stabiliteit van deze nanodeeltjes te verhogen. Bovendien hebben we deze deeltjes gefunctionaliseerd met maximaal zes verschillende siRNAs om gecontroleerde stoichiometrie en Gen-het tot zwijgen brengen mogelijk te maken, en toonden we aan dat deze deeltjes inderdaad de aangewezen genen doen zwijgen wanneer ze in verschillende cellijnen worden getransfecteerd.

we hebben ook een ander paradigma onderzocht gebaseerd op het gebruik van RNA / DNA hybride nanoconstructies die split functionaliteiten bevatten. Dit staat, bijvoorbeeld, het splitsen van een Diceable siRNA in twee hybride componenten van DNA/RNA met DNA toeholds toe, die wanneer getransfecteerd in cellen opnieuw in een duplex van DNA en een Diceable siRNA samenstelt. Deze hybride benadering is verwerkt in onze zeshoekige nanorings en nanocubes. Het nut van deze benadering staat onder andere gecontroleerde activering van functionaliteiten toe, integratie van moleculaire bakens op de bundels van DNA zonder met de functionaliteit van RNA te inteferen en weerstand tegen nuclease degradatie. Deze benadering is met succes geprobeerd in de modellen van de celculturen en de muis van de xenographtumor.veel van de computationele systemen zijn aangepast aan andere omgevingen binnen en buiten ons laboratorium en de NIH en zijn toegankelijk via onze website op http://www-CCRNP.ncifcrf.gov/~bshapiro.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.