membrana celulară: o binecuvântare și un blestem

membrana celulară învelește un citosol plin de organite, molecule instabile, enzime și informații genetice-tot ceea ce este necesar pentru metabolism și replicare. Dar, de asemenea, păstrează orice ar destabiliza echilibrul delicat și dinamic al vieții.în timp ce membrana este esențială pentru celulă, este adesea și un inconvenient pentru inginerii biologici. Pregătirea celulelor pentru a accepta ADN-ul străin, obținerea ADN-ului prin membrana celulară și integrarea noului set de instrucțiuni în genomul organismului sunt sarcini consumatoare de timp și laborioase. Iar cercetătorii sunt din ce în ce mai interesați să extindă repertoriul nostru de organisme gazdă la specii mai exotice, cărora le lipsesc protocoalele de transformare simplificate.

majoritatea proceselor de producere și metabolizare a proteinelor nu au nicio cerință fundamentală pentru încapsulare. Dacă nu este necesară nicio celulă pentru aplicația dvs., atunci de ce să vă deranjați?

sistemele de Expresie fără celule, care scot mașinile de Expresie din celulă și într-o eprubetă, sunt o soluție la această problemă aparent intractabilă.

aceste sisteme pot fi folosite pentru a răspunde la întrebări biologice fundamentale, cum ar fi studierea expresiei în „protocelule”. Ele sunt la fel de utile pentru prototiparea rapidă a sistemelor genetice și metabolice: de exemplu, optimizarea rapidă a căilor metabolice pentru a maximiza titrurile produselor. Acestea pot fi chiar utilizate ca platforme de biosenzare și biomanufacturare la cerere. Dacă sunteți interesat să aflați mai multe despre ce sunt sistemele fără celule, de ce sunt utile și cum puteți începe, citiți mai departe!

punând totul (înapoi) împreună

ce componente sunt necesare pentru ca traducerea să aibă loc în afara celulei? Toate sistemele de expresie a proteinelor fără celule conțin cel puțin aceste trei părți.

1. mașini de translație. Aceasta include ribozomii și Arnt, precum și factorii de inițiere, alungire și eliberare necesari pentru traducere și aminoacil Arnt sintetaze pentru a încărca Arnt cu aminoacizii lor înrudiți.
2. energie. GTP și ATP pentru a alimenta alungirea translațională și încărcarea Tarn. Zaharurile, intermediarii glicolitici fosforilați sau alți compuși fosforilați sunt utilizați ca surse de energie pentru a se asigura că concentrațiile mari de trifosfați nucleotidici sunt menținute pe parcursul reacției, care poate dura până la câteva ore.
3. un ARN mesager care trebuie tradus. Acest lucru poate fi produs în afara reacției fără celule prin transcriere in vitro T7, sau în cadrul reacției fără celule prin adăugarea unui șablon ADN și NTPs și folosind fie polimeraza ARN T7, fie o polimerază nativă prezentă în lizatul celular.

sistemele fără celule recapitulează traducerea și adesea transcrierea și metabolismul central, în afara celulei. Cu toate acestea, este important să ne amintim cele trei diferențe principale dintre sistemele fără celule și cele bazate pe celule.

1. compartimentarea și organizarea spațială. Sistemele de Expresie fără celule nu au o barieră între un sistem de reacție biochimică și mediul înconjurător, precum și bariere între compartimentele distincte funcțional. Toate reacțiile biochimice din sistemele fără celule au loc într-un mediu omogen.
2. diluare. Sistemele fără celule sunt un ordin de mărime mai diluat, în ceea ce privește conținutul lor macromolecular, decât celulele. Nu numai că concentrațiile mașinilor de exprimare a genelor sunt mai mici, dar și gradul de aglomerare macromoleculară este mai mic, ceea ce poate influența ratele de reacție biochimice și echilibrele.
3. un genom. ADN-ul cromozomial este digerat sau purificat din sistemele fără celule. Deoarece sistemele fără celule nu au un genom pentru a programa comportamentul, singurele instrucțiuni pe care reacția le va efectua sunt cele pe care le furnizați.

De ce ar trebui să mergi fără celule?

deoarece sistemele fără celule nu au o membrană celulară, ele au mai multe avantaje față de expresia celulară.

• mai repede – nu există zile lungi de transformare și creștere celulară într-un experiment fără celule. O reacție tipică fără celule durează ore întregi, nu Zile. Diferența de viteză între in-cell și cell-free devine și mai mare atunci când se lucrează în organisme cu protocoale de transformare complexe sau neoptimizate sau timpi de cultură mai lungi. Fără celule poate fi o modalitate excelentă de a prototipa părți genetice pentru noi organisme gazdă, circuite genetice și chiar căi metabolice întregi, fără a fi nevoie să integrați nicio informație genetică într-o gazdă intractabilă.
• biochimic flexibil-concentrațiile intracelulare ale moleculelor mici, metaboliților și enzimelor sunt toate foarte reglementate. Poate fi dificil să le reglați concentrațiile pentru un randament optim sau o performanță genetică a sistemului sau chiar să monitorizați care sunt aceste concentrații. Aveți mult mai mult control asupra compoziției biomoleculare într-un sistem fără celule. Puteți adăuga cosolute noi sau chiar puteți folosi micelele lipidice pentru a re-încapsula mașinile de exprimare a genelor, pentru a investiga modul în care aceste modificări afectează expresia genelor.
• Open-deschiderea sistemelor fără celule este utilă la modificarea chimiei sistemului, dar este utilă în special pentru aplicațiile care necesită comunicarea cu un mediu exterior, cum ar fi detectarea. În prezent, este dificil să se creeze platforme de detectare celulară care să răspundă moleculelor care nu pot traversa membrana celulară, cum ar fi acizii nucleici. Într-un sistem de detectare fără celule, această barieră nu există, permițând detectarea simplă a moleculelor precum ARN viral.

…și de ce nu ar trebui?

diferențele dintre mediile celulare și cele fără celule pot duce la diferențe în abordarea experimentală între cele două platforme de Expresie.

• Nu (încă) high-throughput – high-throughput flow-citometry și experimentele de caracterizare genetică bazate pe NGS sunt bine stabilite pentru platformele celulare, care împachetează în mod convenabil instrucțiunile genetice împreună cu producția lor. Zeci de mii de variante genetice pot fi analizate pentru funcție folosind citometrie în flux și/sau NGS. Numărul de variante care pot fi analizate într-un experiment tradițional fără celule unice este cu câteva ordine de mărime mai mic decât în testele in vivo cu randament ridicat.
• in vivo nu este (neapărat) egal in vitro – fiți conștienți de faptul că rezultatele fără celule nu se mapează neapărat direct la performanța sistemului in vivo sau chiar la alte sisteme fără celule. Din cauza diferențelor în concentrațiile componentelor sistemului, producția fără celule între sisteme tinde să fie comparabilă, dar nu identică.
• nu este economic pentru preparatele proteice la scară largă. În timp ce randamentele de până la 2.3 g/l de proteine au fost raportate pentru sistemele fără celule, ceea ce îl face competitiv cu expresia bazată pe celule, ai avea nevoie de un volum de cultură de ~1000x volumul volumului de reacție fără celule. Aceasta înseamnă că nu este un sistem economic pentru crearea unor cantități mari de proteine recombinante.

alegerea unui sistem

procariote sau eucariote, homebrewed sau comerciale, pe bază de extract brut sau reconstituit? Alegerea sistemului depinde de nevoile și constrângerile dvs. specifice.

ce specie? Cu excepția cazului în care prototipați părți genetice sau aveți nevoie de mecanismul de exprimare al unui organism specific, un sistem fără celule bazat pe E. coli ar trebui să fie prima dvs. alegere. Cea mai veche și cea mai utilizată familie de sisteme fără celule, sistemele E. coli au fost optimizate pentru expresia genelor fiabile și producția de proteine cu randament ridicat.

merge comercial? Producerea propriului extract de celule necesită echipamente și expertiză pentru a cultiva și a Liza volume mari de celule. O mână de furnizori își vând propriile sisteme fără celule, derivate din organisme model și linii celulare de cai de lucru, dar nu sunt ieftine. Așteptați-vă să plătiți cel puțin 7 USD pe reacție, față de cenți pe reacție pentru un sistem homebrewed.

brut sau reconstituit? Majoritatea sistemelor de Expresie fără celule sunt realizate cu lizat de celule brute, care conține mult mai multe enzime decât mecanismul de expresie a genelor de bază. Acest lucru poate fi un lucru bun—sistemele moderne pe bază de lizat E. coli conțin chaperone și cea mai mare parte a metabolismului central, ceea ce crește randamentul proteinelor și titrurile produselor. Dacă trebuie să eliminați complet activitatea unei anumite enzime, un sistem reconstituit cunoscut sub numele de pur (sinteza proteinelor folosind elemente recombinante) poate fi opțiunea potrivită. În pură, fiecare proteină necesară pentru exprimarea genelor este purificată și adăugată la reacție, oferindu-vă un control maxim asupra compoziției reacției. Protocoalele simplificate au fost publicate recent pentru a produce economic ambele tipuri de sisteme, dar puteți achiziționa și un kit.

pentru a rezuma

sistemele fără celule sunt sisteme biosintetice necapsulate care sunt utile pentru dezvoltarea rapidă a sistemului genetic și sinteza bioproduselor. Dacă doriți să accelerați dezvoltarea unei noi căi biosintetice, investigați un proces biochimic într-un sistem mai simplu sau doriți o modalitate mai simplă de a utiliza mecanismul de expresie de la o gazdă intractabilă genetic, ar putea fi potrivit pentru dvs.

lecturi suplimentare

Dudley QM, Karim ca& Jewett mc. Inginerie metabolică fără celule: Biomanufacturarea dincolo de celulă. Biotechnol J. (2015) 10(1): 69-82. DOI: 10.1002 / biot.201400330

Garamella J, Marshall R, Rustad m& Noireaux V. Toate E. coli TX-TL Toolbox 2.0: o platformă pentru biologie sintetică fără celule. ACS biologie sintetică (2016) 5(4):344-355. DOI: 10.1021 / acssynbio.5b00296

Thermo Fisher științific. Prezentare generală a expresiei proteinelor. Biblioteca De Resurse Pentru Biologie Proteică.

Shimizu y, Kanamori t, Ueda T. sinteza proteinelor prin sisteme de traducere pură. Metode. (2005) 36(3):299-304. DOI: 10.1016 / j.ymeth.2005.04.006

Shoba. O introducere în sinteza proteinelor fără celule. Bitesize Bio. 2 martie 2009.

Shoab. Rezolvat: randamente scăzute în sinteza proteinelor fără celule. Bitesize Bio. 21 aprilie 2009.