A Membrana Celular: uma Bênção e Uma Maldição

A membrana celular envolve uma citosol repleta de organelas, moléculas instáveis, enzimas, e a informação genética – tudo o que é necessário para o metabolismo e a replicação. Mas também mantém de fora qualquer coisa que desestabilize o delicado e dinâmico equilíbrio da vida.enquanto a membrana é essencial para a célula, é muitas vezes um inconveniente para os engenheiros biológicos. Preparar células para aceitar DNA estranho, obter o DNA através da membrana celular, e integrar o novo conjunto de instruções no genoma do organismo são tarefas demoradas e laboriosas. E os pesquisadores estão cada vez mais interessados em expandir nosso repertório de organismos hospedeiros para espécies mais exóticas, que não possuem protocolos de transformação simplificados.a maioria dos processos de produção e metabolismo de proteínas não têm qualquer requisito fundamental para a encapsulação. Se nenhuma célula é necessária para a sua aplicação, então por que se incomodar?

Sistemas de expressão sem células, que levam máquinas de expressão para fora da célula e para um tubo de ensaio, são uma solução para este problema aparentemente intratável.

estes sistemas podem ser usados para responder a questões biológicas fundamentais, tais como o estudo da expressão em “protocélulas”. Eles são igualmente úteis para a prototipagem rápida de sistemas genéticos e metabólicos: por exemplo, otimizar rapidamente as vias metabólicas para maximizar os títulos de produtos. Podem até ser utilizadas como plataformas de biossensagem e biomanufacturação a pedido. Se você está interessado em aprender mais sobre o que são sistemas livres de células, por que eles são úteis, e como você pode começar, leia!que componentes são necessários para que a tradução ocorra fora da célula? Todos os sistemas de expressão proteica sem células contêm pelo menos estas três partes.máquinas translacionais. Isso inclui ribossomas e tRNAs, bem como iniciação, alongamento e fatores de liberação necessários para a tradução, e aminoacil tRNA sintetases para carregar tRNAs com seus aminoácidos cognatos.energia. GTP e ATP para alongamento translacional de potência e carga tRNA. Os açúcares, os intermediários glicolíticos fosforilados ou outros compostos fosforilados são utilizados como fontes de energia para garantir que as elevadas concentrações de trifosfatos nucleotídeos são mantidas ao longo da reação, que pode durar até várias horas.

um ARN mensageiro a ser traduzido. Isto pode ser produzido fora da reação sem células através da transcrição in vitro T7, ou dentro da reação sem células adicionando um modelo de DNA e NTPs e usando tanto a polimerase de RNA T7 ou uma polimerase nativa presente no lisado celular.

sistemas sem células recapitulam a tradução, e muitas vezes a transcrição e o metabolismo central, fora da célula. No entanto, é importante lembrar as três principais diferenças entre sistemas sem células e baseados em células.

1. compartimentalização e organização espacial. Os sistemas de expressão sem células não possuem uma barreira entre um sistema de reação bioquímica e o ambiente circundante, bem como barreiras entre compartimentos funcionalmente distintos. Todas as reações bioquímicas em sistemas sem células estão ocorrendo em um ambiente homogêneo.diluição. Sistemas sem células são uma ordem de magnitude mais diluída, em termos de seu conteúdo macromolecular, do que as células. Não só as concentrações de máquinas de expressão genética são mais baixas, mas o grau de crowding macromolecular é menor também, o que pode influenciar as taxas de reação bioquímica e equilíbrio.
2. um genoma. O ADN cromossómico é digerido ou purificado de sistemas sem células. Como os sistemas sem células não possuem um genoma para programar o comportamento, as únicas instruções que a reação irá realizar são aquelas que você fornece.porque é que não tem células?

   porque os sistemas sem células não possuem uma membrana celular, eles têm várias vantagens sobre a expressão celular.

   • mais rápido-não há longos dias de transformação e crescimento celular num experimento sem células. Uma reacção típica sem células leva horas a completar, Não dias. A diferença de velocidade entre células e células livres torna-se ainda maior quando se trabalha em organismos com protocolos de transformação complexos ou não otimizados, ou períodos de cultura mais longos. Livre de células pode ser uma ótima maneira de protótipos de partes genéticas para novos organismos hospedeiros, circuitos genéticos, e até mesmo vias metabólicas inteiras sem ter que integrar qualquer informação genética em um hospedeiro intratável.todas as concentrações intracelulares de pequenas moléculas, metabolitos e enzimas são altamente reguladas. Pode ser difícil sintonizar suas concentrações para o rendimento ideal ou desempenho do sistema genético, ou até mesmo para monitorar quais são essas concentrações. Você tem muito mais controle sobre a composição biomolecular em um sistema sem células. Você pode adicionar novos cosolutos, ou até mesmo usar micelas lipídicas para re-encapsular máquinas de expressão genética, para investigar como essas modificações afetam a expressão do gene.aberto-a abertura de sistemas sem células é útil ao modificar a química do sistema, mas é especialmente útil para aplicações que requerem comunicação com um ambiente externo, como a detecção. Atualmente é difícil projetar plataformas de detecção celular que respondem a moléculas que não podem atravessar a membrana celular, como ácidos nucleicos. Em um sistema de detecção sem células, essa barreira não existe, permitindo a detecção simples de moléculas como RNA viral.

   … e porque não deveria?

   as diferenças entre os ambientes sem células e celulares podem levar a diferenças na abordagem experimental entre as duas plataformas de expressão.

   • (ainda) a citometria de alto débito e os experimentos de caracterização genética baseados em NGS estão bem estabelecidos para Plataformas celulares, que convenientemente embalam instruções genéticas juntamente com a sua saída. Dezenas de milhares de variantes genéticas podem ser rastreadas para função usando citometria de fluxo e/ou NGS. O número de variantes que podem ser rastreadas em um experimento tradicional sem células é de várias ordens de magnitude menor do que em testes in vivo de alto rendimento.
   • In vivo não é (necessariamente) igual in vitro – estar ciente de que os resultados sem células não necessariamente mapeiam diretamente para o desempenho do Sistema in vivo, ou mesmo para outros sistemas sem células. Devido às diferenças nas concentrações dos componentes do sistema, a saída livre de células entre os sistemas tende a ser comparável, mas não idêntica.não é económico para preparações proteicas em grande escala. = = Ligações externas = = 3 g / L de proteína têm sido relatados para sistemas sem células, o que o torna competitivo com a expressão baseada em células, você precisaria de um volume de cultura de ~1000x o volume do volume de reação sem células. Isto significa que não é um sistema econômico para a criação de grandes quantidades de proteína recombinante.escolha de um sistema baseado em extratos ou reconstituído procarióticos ou eucarióticos, homebrewed ou comerciais? A escolha do sistema depende de suas necessidades e restrições específicas.que espécie? A menos que esteja a prototipar partes genéticas ou precise da máquina de expressão de um organismo específico, um sistema sem células à base de E. coli deve ser a sua primeira escolha. A mais antiga e mais amplamente utilizada família de sistemas sem células, E. coli sistemas foram otimizados para a expressão genética confiável e produção de proteínas de alto rendimento.vai para o mercado? Produzir o seu próprio extrato celular requer equipamento e experiência para a cultura e Lise grandes volumes de células. Um punhado de fornecedores vendem seus próprios sistemas sem células, derivados de organismos modelo e linhas de células de trabalho, mas eles não são baratos. Espere pagar pelo menos $7 por reação, contra centavos por reação para um sistema caseiro.em bruto ou reconstituído? A maioria dos sistemas de expressão sem células são feitos com lisato de células brutas, que contém muito mais enzimas do que a máquina de expressão do gene Central. Isto pode ser uma coisa boa-os sistemas modernos de E. coli lysate-based contêm chaperones e a maioria do metabolismo central, que aumenta o rendimento de proteínas e títulos do produto. Se necessitar de remover completamente a actividade de uma determinada enzima, um sistema reconstituído conhecido como puro (síntese proteica utilizando elementos recombinantes) pode ser a opção certa. Na pureza, cada proteína necessária para a expressão do gene é purificada e adicionada à reação, dando-lhe o máximo controle sobre a composição da reação. Protocolos simplificados foram publicados recentemente para produzir economicamente ambos os tipos de sistemas, mas você também pode comprar um kit.
     

     para resumi-lo em

     sistemas sem células são sistemas biossintéticos não encapsulados que são úteis para o rápido desenvolvimento do sistema genético e síntese de bioprodutos. Se você está olhando para acelerar o desenvolvimento de uma nova via biossintética, investigar um processo bioquímico em um sistema mais simples, ou gostaria de uma maneira mais simples de usar a máquina de expressão de um hospedeiro geneticamente intratável, ficar livre de células pode ser certo para você.

     Further Reading

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