pełne zrozumienie funkcji cząsteczek RNA wymaga znajomości ich struktur wyższego rzędu (2D i 3D), a także cech ich pierwotnej sekwencji. Struktura RNA jest ważna dla wielu funkcji, w tym regulacji transkrypcji i translacji, katalizy, transportu białek przez błony i regulacji wirusów RNA. Zrozumienie tych funkcji jest ważne dla podstawowej biologii, jak również dla rozwoju leków, które mogą interweniować w przypadkach, w których występuje patologiczna funkcjonalność tych cząsteczek.

Nasza grupa prowadzi badania i rozwój metodologii poprawy zwijania RNA i technik analizy, aby pomóc w lepszym zrozumieniu właściwości funkcjonalnych tych cząsteczek. Ponadto skupiamy się na rozwijającej się dziedzinie nanobiologii RNA. RNA stanowi stosunkowo nowy materiał cząsteczkowy dla rozwoju biologicznie zorientowanych nanocząstek. Jest to interesujący materiał Ze względu na swoje naturalne funkcjonalności, zdolność do składania w złożone struktury i samodzielnego montażu. Opracowaliśmy metody obliczeniowe i eksperymentalne, które pozwalają na projektowanie nanocząstek opartych na RNA, które potencjalnie mają wiele zastosowań. Tak więc, nasze badania nad RNA obejmują pięć wysoce powiązanych i zintegrowanych obszarów badań:

1. badania w algorytmach przewidywania i analizy struktury wtórnej RNA;
2. Biologia RNA i jej związek z sekwencją i charakterystyką fałdowania struktury wtórnej;
3. badania algorytmów przewidywania i analizy struktury RNA 3D oraz ich zastosowania w biologii RNA;
4. badania algorytmów projektowania i analizy nanocząstek RNA;
5. eksperymentalne projektowanie, synteza i dostarczanie nanocząstek opartych na RNA.

to, czego uczy się w jednym obszarze, stosuje się do innych obszarów, poprawiając nasze zrozumienie struktury, funkcji i nanobiologii RNA oraz samoorganizacji RNA.

równoległa Biologia obliczeniowa i struktura RNA
rewolucyjne zmiany w paradygmatach obliczeniowych są wymagane, aby utrzymać niezbędną moc obliczeniową do rozwiązywania problemów w biologii molekularnej. Nie można oczekiwać, że metodologie oparte na sekwencyjnych architekturach komputerowych będą stale nadążać za wymaganymi prędkościami obliczeniowymi. W celu dostosowania się do wysokich prędkości, które są niezbędne, wysoce równoległe techniki obliczeniowe są obecnie stosowane. Nasza grupa była jednym z pionierów w dziedzinie biologii obliczeniowej i wykorzystania równoległych architektur komputerowych o wysokiej wydajności w tym przedsięwzięciu.

Computational Techniques for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis
jako pierwsi opracowaliśmy technikę zwijania RNA, która wykorzystuje koncepcje z algorytmów genetycznych. Nasz algorytm, MPGAfold, został pierwotnie opracowany do pracy na masowo równoległym superkomputerze SIMD, MasPar MP-2 z 16384 procesorami. Algorytm ten został zmodyfikowany i obecnie działa na równoległych klastrach Linuksa o wysokiej wydajności. Wyjątkowe cechy skalowania uzyskuje się dzięki możliwości uruchomienia algorytmu z setkami tysięcy elementów populacji. Przewidywanie pseudokibiców RNA jest częścią algorytmu genetycznego, co skutkuje jego zdolnością do przewidywania trzeciorzędowych oddziaływań. Inne funkcje obejmują symulację składania Ko-transkrypcji, zdolność do włączenia różnych zasad energetycznych oraz wymuszone hamowanie i osadzanie pożądanych pędów śrubowych. Ponadto, STRUCTURELAB, nasz heterogeniczny bioinformatyczny Warsztat analizy RNA, może być użyty w połączeniu z MPGAfold i RNA2D3D do wytworzenia przewidywanych współrzędnych atomowych 3D struktur RNA wraz z wizualizacją tych struktur. Ponadto opracowaliśmy nowatorską metodologię interaktywnej wizualizacji, która jest częścią STRUCTURELAB. Technika ta umożliwia porównanie i analizę fałdów RNA wielu sekwencji z filogenetycznego punktu widzenia, umożliwiając w ten sposób poprawę przewidywanych wyników strukturalnych w całej rodzinie sekwencji.
opracowaliśmy KNetFold, nowatorski i potężny algorytm przewidywania struktury RNA na podstawie wyrównań sekwencji. Algorytm wykorzystuje unikalną hierarchiczną sieć klasyfikacji opartą na wzajemnej informacji, termodynamice I bazie Watsona-Cricka do przewidywania struktur. Ponadto opracowaliśmy internetową aplikację CorreLogo, która wykorzystuje wzajemne informacje pochodzące z wyrównań sekwencji RNA do określania współzmienności między pozycjami sparowanymi z bazą. Algorytm zawiera unikalną miarę błędu i przedstawia wyniki w 3D.
opracowaliśmy, CyloFold, unikalny algorytm przewidywania, z pojedynczej sekwencji, drugorzędowych struktur RNA, które mogą zawierać pseudoklosy. Algorytm ten wykorzystuje nowatorską technikę, która przybliża potencjał trójwymiarowych starć sterycznych w przewidywanych strukturach, filtrując w ten sposób te struktury z uwagi. Algorytm okazał się mieć wysoką dokładność w porównaniu do innych algorytmów tego typu.
opracowaliśmy oprogramowanie sieciowe oparte na Bayesowskim podejściu statystycznym, które szacuje dokładność tworzenia par zasad na podstawie danych pochodzących z eksperymentów SHAPE (Selective 2′ – Hydroxyl acylation analyzed by Primer Extension). Wyniki statystyczne / probabilistyczne uzyskano analizując znane struktury 3D RNA mające różne rodzaje znanych interakcji zasadowych i korelując je z wartościami kształtu. Wykazano, że niskie wartości kształtu dobrze korelują z interakcjami parowania i układania bazy Watson-Crick, podczas gdy wysokie wartości kształtu wskazują regiony jednoniciowe. Ulepszenia można zauważyć, jeśli uwzględniono również kontekst bazowy 2 lub 3. Pokazaliśmy również, że inne rodzaje znanych interakcji nie korelują dobrze. Ten rodzaj informacji jest pomocny w ostatecznym określeniu struktury wtórnej RNA.

badania obliczeniowe ścieżek zwijania RNA
ścieżki zwijania RNA okazują się dość ważne w określaniu funkcji RNA. Badania wskazują, że RNA może wchodzić w pośrednie Stany konformacyjne, które są kluczowe dla jego funkcjonalności. Stany te mogą mieć znaczący wpływ na ekspresję genów. Wiadomo, że biologicznie funkcjonalne Stany cząsteczek RNA mogą nie odpowiadać ich minimalnemu stanowi energetycznemu, że mogą istnieć bariery kinetyczne, które zatrzymują cząsteczkę w lokalnym minimum, że fałdowanie często występuje podczas transkrypcji i istnieją przypadki, w których cząsteczka przechodzi między jedną lub więcej konformacjami funkcjonalnymi przed osiągnięciem swojego rodzimego stanu. Tak więc, metody symulowania szlaków fałdowania cząsteczki RNA, w tym fałdowania Ko-transkrypcyjnego i lokalizowania znaczących Stanów pośrednich są ważne dla przewidywania struktury RNA i związanej z nią funkcji. Kilka biologicznych szlaków zwijania RNA zostało z powodzeniem zbadanych przy użyciu MPGAfold i STRUCTURELAB. Przykłady obejmują wiroid wrzeciona bulw ziemniaka, mechanizm zabijania gospodarza plazmidu R1 Escherichia coli, wirus zapalenia wątroby typu delta, HIV i wirus dengi. Te wyniki obliczeniowe są zgodne z tymi pochodzącymi z eksperymentów biologicznych. Ponadto przewidywano nowe interakcje strukturalne i ważne funkcjonalne Stany pośrednie i rodzime. Doprowadziły one do dalszych udanych eksperymentów potwierdzających.

obliczeniowa Predykcja sieci interakcji RNA
Opracowaliśmy również programy CovaRna i CovStat do eksploracji sieci interakcji RNA dalekiego zasięgu przy użyciu wyrównań całego genomu. Ta nowa metodologia, która została zastosowana do genomów Drosophila, jest obecnie stosowana do innych genomów. Równoległa wersja programu została opracowana w celu przyspieszenia przetwarzania, a algorytmy opierają się również na schematach szybkiego indeksowania i konserwatywnych metodach statystycznych w celu określenia wysoce istotnych interakcji. Metodologia odkryła interesujące interakcje, które są związane z endogennymi sirna, transportem genów i genami związanymi z morfogenezą.

badania obliczeniowe trójwymiarowych struktur RNA
niektóre elementy strukturalne cząsteczek RNA zostały zbadane przy użyciu mechaniki molekularnej i symulacji dynamiki molekularnej. Badane struktury obejmują tetraloop RNA, gdzie przeprowadzono zależną od temperatury denaturację tetraloop i późniejsze ponowne odtworzenie pierwotnej struktury krystalicznej. Zbadano trójdrożne połączenie z domeną centralną podjednostki rybosomalnej 30s z Thermus thermophilus. Eksperymentalnie ustalono, że interakcje międzycząsteczkowe między złączem trójdrożnym a białkiem rybosomalnym S15 inicjują proces montażu podjednostki rybosomalnej 30s. Wykorzystując symulacje dynamiki molekularnej uzyskaliśmy wgląd w konformacyjne przejścia złącza związane z wiązaniem S15. Za pomocą symulacji dynamiki molekularnej określiliśmy strukturalne efekty wykorzystania nowych typów zmodyfikowanych nukleotydów RNA zawierających cukry karbocykliczne, które są ograniczone do konformacji Północnej lub Południowej (C2′ lub C3 ’ exo). Ponadto za pomocą symulacji dynamiki molekularnej pokazaliśmy, jak jony i bazy flankujące odgrywają bardzo ważną rolę w konformacjach monomerów pętli całującej ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Wyniki te dobrze się korelują i mogą szczegółowo wyjaśnić badania eksperymentalne, które wskazują na znaczenie jonów dla dimeryzacji HIV-1.

zbadaliśmy również pseudoklasę telomerazy. Przeprowadzono modelowanie molekularne i dynamikę molekularną domeny pseudokibiców, w tym jej pętli. Wyniki wykazały, w jaki sposób dynamika pętli spinki wpłynęła na otwarcie i zamknięcie niekanonicznych par zasad U-U występujących w łodydze. Otwarcie sugerowało punkty zarodkowania dla tworzenia pseudoknotów. Zbadaliśmy również wpływ mutacji dyskeratosis congenita (DKC) w pętli i w jaki sposób zmniejszają one skłonność do otwierania łodygi poprzez utworzenie stosunkowo stabilnej sieci wiązania wodorowego w pętli spinki do włosów. Modelowaliśmy sam pseudoknot za pomocą naszego oprogramowania rna2d3d połączonego z analizą filogenetyczną. Zbadaliśmy dynamiczny wpływ mutacji DKC na pseudoknoty, w wyniku czego pseudoknoty stały się niestabilne, podczas gdy forma spinki do włosów stała się bardziej stabilna.

odkryliśmy i wyjaśniliśmy struktury 3D nowych typów wzmacniaczy translacyjnych, które znajdują się w 3′ UTRs wirusa rzepy (pierwszego tego rodzaju znalezionego) i wirusa mozaiki enacji grochu. Odkrycie tych elementów strukturalnych ujawniło nowe mechanizmy ulepszania translacji u eukariotycznych wirusów roślinnych, które mogą mieć szersze implikacje dla zrozumienia mechanizmów translacyjnych w ogóle. Udało się to osiągnąć dzięki połączeniu MPGAfold, naszego oprogramowania do modelowania molekularnego 3D rna2d3d i bliskim interakcjom z naszymi eksperymentalnymi współpracownikami. Modelowaliśmy również nowatorski pseudoknot znaleziony w mRNA CCR5. Ten pseudoknot bierze udział w zmianie RAM i wydaje się być stabilizowany przez mikroRNA, nową funkcję dla mikroRNA.
ponadto zastosowaliśmy metody oparte na elastycznej interpolacji sieci w celu zmniejszenia kosztów obliczeniowych związanych z dynamiką RNA 3D. Trójwymiarowe trajektorie dynamiki można określić za pomocą zredukowanej reprezentacji atomu i danych Stanów konformacyjnych. Dzięki temu podejściu czas obliczeniowy można skrócić Z tygodni do godzin.
Nanobiologia obliczeniowa RNA
nanobiologia RNA reprezentuje nowy sposób rozwoju nanorządzeń, które mają potencjał do zastosowania w wielu dziedzinach, w tym w medycynie. Opierając się na naszym doświadczeniu, jak opisano powyżej, opracowaliśmy kilka technik obliczeniowych i eksperymentalnych (patrz poniżej), które zapewniają środki do określenia zestawu sekwencji nukleotydowych, które mogą gromadzić się w pożądane Nano kompleksy. Jednym z tych narzędzi jest relacyjna baza danych o nazwie RNAJunction. Baza danych zawiera informacje o strukturze i sekwencji znanych połączeń śrubowych RNA i oddziaływań pętli całującej. Motywy te można wyszukiwać na wiele sposobów, zapewniając źródło nano bloków budulcowych RNA. Inne narzędzie obliczeniowe, NanoTiler, pozwala użytkownikowi na konstruowanie określonych kształtów nanoskali opartych na RNA. NanoTiler zapewnia graficzny widok 3D projektowanych obiektów i zapewnia środki do interaktywnej pracy lub ze skryptami komputerowymi nad procesem projektowania, nawet jeśli dokładne sekwencje RNA nie mogą być jeszcze określone, a model all-atom nie jest dostępny. NanoTiler może używać motywów 3D znalezionych w bazie danych RNAJunction z tymi pochodzącymi z określonych wzorów struktury wtórnej RNA do budowy zdefiniowanego kształtu nano RNA. Ponadto, wyszukiwanie kombinatoryczne może być zastosowane do wyliczenia struktur, które normalnie nie byłyby brane pod uwagę.

innym internetowym narzędziem do projektowania nanostruktury RNA jest NanoFolder, który jest jednym z niewielu narzędzi programowych, które są w stanie przewidzieć strukturę i sekwencje atrybutów wielowątkowych konstruktów RNA. Za pomocą tego oprogramowania można określić pożądane motywy struktury wtórnej i mieć oprogramowanie przewidzieć zestaw sekwencji, które generują te pożądane motywy z prawidłową charakterystyką fałdowania wewnątrz – i między nici.

eksperymentalna Nanobiologia RNA
opierając się na wyżej opisanym podejściu obliczeniowym do nanodesignu RNA, wykazaliśmy zdolność do eksperymentalnego samoskładania i funkcjonalizacji kilku nanocząstek opartych na RNA. Osiągnięto to dzięki bliskim interakcjom między podejściami eksperymentalnymi i obliczeniowymi prowadzącymi do ulepszeń obu zestawów metodologii. Przykłady obejmują samodzielne złożenie 6 i 10 splecionych sześcianów; samodzielne złożenie sześciokątnych pierścieni o różnych rozmiarach i podwójnych pierścieni z wykorzystaniem motywu RNA wyekstrahowanego z natury; modyfikacja sekwencji w motywie w celu poprawy wydajności przy jednoczesnym zachowaniu odpowiednich geometrii; oraz samodzielne montowanie trójkątnych struktur. Opracowaliśmy również techniki, które definiują protokoły samodzielnego montażu i które pozwalają na Ko-transkrypcyjny montaż konstruktów, które mogą również zawierać zmodyfikowane zasady w celu zwiększenia stabilności chemicznej tych nanocząstek. Ponadto, funkcjonalizowaliśmy te cząstki z maksymalnie sześcioma różnymi sirna, aby umożliwić kontrolowaną stechiometrię i wyciszanie genów, i wykazaliśmy, że cząstki te rzeczywiście wyciszają wyznaczone geny po transfekcji do różnych linii komórkowych.

badamy również inny paradygmat oparty na wykorzystaniu hybrydowych NANOKONSTRUKCJI RNA/DNA zawierających podzielone funkcjonalności. Pozwala to np. na podział Diceable siRNA na dwa komponenty hybrydowe DNA / RNA z DNA do dna, które po transfekcji do komórek ponownie składają się w dupleks DNA i Diceable siRNA. To hybrydowe podejście zostało włączone do naszych sześciokątnych nanoringów i nanokubek. Użyteczność tego podejścia pozwala m.in. na kontrolowaną aktywację funkcjonalności, włączenie molekularnych beaconów do nici DNA bez ingerencji w funkcjonalność RNA i odporność na degradację nukleazy. Podejście to zostało wypróbowane z powodzeniem w hodowlach komórkowych i ksenografowych modelach myszy nowotworowych.
wiele systemów obliczeniowych zostało przystosowanych do innych środowisk wewnątrz i na zewnątrz naszego laboratorium i NIH i są dostępne za pośrednictwem naszej strony internetowej pod adresemhttp://www-CCRNP.ncifcrf.gov/~bshapiro.