błona komórkowa: błogosławieństwo i przekleństwo

błona komórkowa otacza cytozol pełen organelli, niestabilnych cząsteczek, enzymów i informacji genetycznej-wszystko, czego potrzeba do metabolizmu i replikacji. Ale także powstrzymuje wszystko, co mogłoby zdestabilizować delikatną, dynamiczną równowagę życia.

chociaż błona jest niezbędna dla komórki, często jest również niedogodnością dla inżynierów biologicznych. Przygotowanie komórek do przyjęcia obcego DNA, pobieranie DNA przez błonę komórkową i integracja nowego zestawu instrukcji z genomem organizmu to czasochłonne i pracochłonne zadania. Naukowcy są coraz bardziej zainteresowani rozszerzeniem naszego repertuaru organizmów żywicielskich na bardziej egzotyczne gatunki, które nie mają usprawnionych protokołów transformacji.

większość procesów produkcji białka i metabolizmu nie ma żadnego podstawowego wymogu kapsułkowania. Jeśli Twoja aplikacja nie wymaga komórki, po co się tym przejmować?

wolne od komórek systemy ekspresji, które zabierają ekspresję z komórki do probówki, są rozwiązaniem tego pozornie trudnego do rozwiązania problemu.

systemy te mogą być używane do odpowiedzi na podstawowe pytania biologiczne, takie jak badanie ekspresji w „protokomórkach”. Są one równie przydatne do szybkiego prototypowania systemów genetycznych i metabolicznych: na przykład szybkiej optymalizacji szlaków metabolicznych w celu zmaksymalizowania miana produktu. Mogą być nawet wykorzystywane jako platformy do biosensowania na żądanie i produkcji biomanufaktury. Jeśli chcesz dowiedzieć się więcej o tym, czym są systemy bez komórek, dlaczego są przydatne i jak zacząć, Czytaj dalej!

składając to wszystko (z powrotem) razem

Jakie składniki są wymagane do translacji poza komórką? Wszystkie systemy ekspresji białek wolnych od komórek zawierają co najmniej te trzy części.

1. Maszyny translacyjne. Obejmuje to rybosomy i Trna, jak również czynniki inicjujące, wydłużające i uwalniające wymagane do translacji oraz syntetazy aminoacylo tRNA do ładowania Trna z ich poznawanymi aminokwasami.
2. Energia. GTP i ATP do zasilania elongacji translacyjnej i ładowania tRNA. Cukry, fosforylowane glikolityczne półprodukty lub inne fosforylowane związki są używane jako źródła energii, aby upewnić się, że wysokie stężenia trójfosforanów nukleotydów są utrzymywane w trakcie reakcji, która może trwać do kilku godzin.
3. posłaniec RNA do przetłumaczenia. Można to wytworzyć poza reakcją wolną od komórek poprzez transkrypcję T7 in vitro, lub w reakcji wolnej od komórek przez dodanie szablonu DNA i NTPs oraz przy użyciu polimerazy RNA T7 lub natywnej polimerazy obecnej w lizacie komórki.

Systemy bezkomórkowe rekapitulują translację, a często transkrypcję i centralny metabolizm, poza komórką. Jednak ważne jest, aby pamiętać o trzech głównych różnicach między systemami bez komórek i systemami opartymi na komórkach.

1. podział i organizacja przestrzenna. Systemy ekspresji wolnej od komórek nie mają bariery między układem reakcji biochemicznych a otaczającym środowiskiem, jak również barier między funkcjonalnie odrębnymi przedziałami. Wszystkie reakcje biochemiczne w układach wolnych od komórek zachodzą w jednorodnym środowisku.
2. rozcieńczenie. Systemy wolne od komórek są o rząd wielkości bardziej rozcieńczone, pod względem zawartości makrocząsteczek, niż komórki. Nie tylko są stężenia maszynerii ekspresji genów niższe, ale stopień macromolecular crowding jest niższa, jak również, co może wpływać na szybkość reakcji biochemicznych i równowagi.
3. Genom. Chromosomalne DNA jest trawione lub oczyszczane z systemów wolnych od komórek. Ponieważ systemom bezkomórkowym brakuje genomu do zaprogramowania zachowania, jedynymi instrukcjami, które przeprowadzi reakcja, są te, które dostarczasz.

dlaczego warto iść bez komórek?

ponieważ systemom wolnym od komórek brakuje błony komórkowej, mają one kilka zalet w stosunku do ekspresji komórkowej.

• szybciej – nie ma długich dni transformacji i wzrostu komórek w eksperymencie bez komórek. Typowa reakcja bezkomórkowa trwa godziny, a nie dni. Różnica w szybkości pomiędzy komórkami wewnątrzkomórkowymi a komórkami wolnymi staje się jeszcze większa podczas pracy w organizmach ze złożonymi lub nieoptymalizowanymi protokołami transformacji lub dłuższymi czasami hodowli. Bez komórek może być świetnym sposobem na prototypowanie części genetycznych dla nowych organizmów gospodarza, obwodów genetycznych, a nawet całych szlaków metabolicznych bez konieczności integrowania informacji genetycznej z trudnym do opanowania gospodarzem.
• biochemicznie elastyczny-wewnątrzkomórkowe stężenia małych cząsteczek, metabolitów i enzymów są ściśle regulowane. Może być trudno dostroić ich stężenia w celu uzyskania optymalnej wydajności lub wydajności systemu genetycznego, a nawet monitorować, jakie są te stężenia. Masz o wiele większą kontrolę nad składem biomolekularnym w systemie wolnym od komórek. Można dodać nowe korozoluty, a nawet użyć Miceli lipidowych do ponownego kapsułkowania maszynerii ekspresji genów, aby zbadać, jak te modyfikacje wpływają na ekspresję genów.
• Open-otwartość systemów bez komórek jest pomocna przy modyfikowaniu chemii systemu, ale jest szczególnie przydatna w aplikacjach wymagających komunikacji ze środowiskiem zewnętrznym, takich jak wykrywanie. Obecnie trudno jest zaprojektować komórkowe platformy wykrywające, które reagują na cząsteczki, które nie mogą przedostać się przez błonę komórkową, jak kwasy nukleinowe. W bezkomórkowym systemie wykrywania ta bariera nie istnieje, pozwalając na proste wykrywanie cząsteczek, takich jak wirusowe RNA.

… A dlaczego nie?

różnice między środowiskami komórkowymi i komórkowymi mogą prowadzić do różnic w podejściu eksperymentalnym między dwiema platformami ekspresji.

• Not (yet) high-throughput – high-throughput flow-cytometry i oparte na NGS eksperymenty charakteryzacji genetycznej są dobrze znane dla platform komórkowych, które wygodnie pakują instrukcje genetyczne wraz z ich wynikami. Dziesiątki tysięcy wariantów genetycznych mogą być przesiewane pod kątem funkcji za pomocą cytometrii przepływowej i / lub NGS. Liczba wariantów, które mogą być przesiewane w tradycyjnym eksperymencie bez komórek jest o kilka rzędów wielkości mniejsza niż w testach in vivo o wysokiej przepustowości.
• In vivo nie jest (koniecznie) równe in vitro – należy pamiętać, że wyniki wolne od komórek niekoniecznie bezpośrednio odwzorowują działanie systemu in vivo, a nawet innych systemów wolnych od komórek. Ze względu na różnice w stężeniach składników systemu, wyjście bez komórek między systemami wydaje się być porównywalne, ale nie identyczne.
• to nie jest ekonomiczne dla preparatów białkowych na dużą skalę. Podczas gdy wydajność do 2.3 G / L białka zostały zgłoszone dla Systemów wolnych od komórek, co czyni go konkurencyjnym z ekspresji opartej na komórkach, trzeba by objętość Kultury ~ 1000x objętość wolnej od komórek objętości reakcji. Oznacza to, że nie jest to ekonomiczny system do tworzenia dużych ilości rekombinowanego białka.

wybór systemu

Prokariotyczny czy eukariotyczny, Homebrew czy komercyjny, surowy na bazie ekstraktu czy odtworzony? Wybór systemu zależy od konkretnych potrzeb i ograniczeń.

jaki gatunek? O ile nie prototypujesz części genetycznych lub nie potrzebujesz maszynerii ekspresji określonego organizmu, system wolny od komórek oparty na E. coli powinien być twoim pierwszym wyborem. Najstarsza i najczęściej stosowana Rodzina systemów wolnych od komórek, systemy E. coli zostały zoptymalizowane pod kątem niezawodnej ekspresji genów i produkcji białek o wysokiej wydajności.

idziesz na reklamę? Produkcja własnego ekstraktu komórkowego wymaga sprzętu i wiedzy specjalistycznej do hodowli i lizy dużych ilości komórek. Garstka dostawców sprzedaje własne systemy bezkomórkowe, pochodzące z organizmów modelowych i linii komórkowych konia pociągowego, ale nie są tanie. Spodziewaj się zapłacić co najmniej $7 za reakcję, w porównaniu do centów za reakcję dla homebrewed systemu.

surowy czy odtworzony? Większość systemów ekspresji wolnych od komórek jest wytwarzana z surowego lizatu komórkowego, który zawiera o wiele więcej enzymów niż podstawowa maszyna ekspresji genów. To może być dobra rzecz—nowoczesne systemy oparte na lizacie E. coli zawierają białka opiekuńcze i większość centralnego metabolizmu, co zwiększa wydajność białka i miana produktu. Jeśli trzeba całkowicie usunąć aktywność określonego enzymu, odtworzony system znany jako czysty (synteza białek przy użyciu rekombinowanych elementów) może być właściwą opcją. W PURE każde białko wymagane do ekspresji genów jest oczyszczane i dodawane do reakcji, co daje maksymalną kontrolę nad składem reakcji. Usprawnione protokoły zostały niedawno opublikowane, aby ekonomicznie produkować oba typy systemów, ale można również kupić zestaw.

Podsumowując

systemy wolne od komórek są nieskapsułkowanymi systemami biosyntetycznymi, które są przydatne do szybkiego rozwoju systemu genetycznego i syntezy bioproduktów. Jeśli chcesz przyspieszyć rozwój nowego szlaku biosyntetycznego, zbadać proces biochemiczny w prostszym systemie, lub chciałbyś prostszego sposobu użycia maszynerii ekspresji od genetycznie trudnego gospodarza, przejście bez komórek może być właśnie dla ciebie.

Czytaj dalej

& Inżynieria metaboliczna bez komórek: Biomanufacturing poza komórką. Biotechnol J. (2015) 10(1): 69-82. DOI: 10.1002 / biot.201400330

Garamella J, Marshall R, Rustad m& Noireaux V.Wszystkie E. coli TX-TL Toolbox 2.0: Platforma dla biologii syntetycznej bez komórek. ACS biologia syntetyczna(2016) 5(4):344-355. DOI: 10.1021 / acssynbio.5b00296

Thermo Fisher Scientific. Przegląd ekspresji białek. Protein Biology Resource Library.

Shimizu Y, Kanamori T, Ueda T. synteza białek przez czyste systemy translacyjne. Metody. (2005) 36(3):299-304. DOI: 10.1016 / j. ymeth.2005.04.006

Wstęp do syntezy białek bez komórek. Biogram Bitesize. 2 marca 2009 r.

Ławica. Rozwiązany: niskie plony w syntezie białek bez komórek. Biogram Bitesize. 21 kwietnia 2009 r.