plantmaterialen en groeicondities

Wild-type en mutante planten die in dit onderzoek werden gebruikt, waren allemaal in de Col-0 ecotypen, met uitzondering van de RGA-GFP–RGA lijnen10, die in het ler ecotype zaten. phyB-9 zaadjes31 werden verkregen van het Arabidopsis Biological Resource Centre. PIF4-overexpressorlijnen en pif4-knockoutmutaties (slr2-mutant) werden beschreven in ref. 3. Dubbele pif4 pif5 mutanten werden verkregen door kruising van het pif4-101 T-DNA insertie allel en de SALK-087012 mutant18 met een insertie in het pif5 gen. 20ox lijnen die een knockout T-DNA insertie in het atga20ox1 gen (At4g25420) dragen werden verstrekt door P. Hedden. Ga-ongevoelige Gai lijnen uitgedrukt het stabiele Gai eiwit onder controle van de 35S promotor. De dubbele en drievoudige mutanten werden gegenereerd door deze lijnen te kruisen en de nakomelingen door PCR-versterking of Noordelijke vlekanalyses te genotyperen.

zaden werden aan de oppervlakte gesteriliseerd en gezaaid op GM-agarplaten zonder sucrose32. De platen werden gedurende 2 d bij 4 °C koud behandeld en de kieming werd gesynchroniseerd door 3 uur bestraling met wit licht en vervolgens gedurende 22 uur incubatie in het donker, alvorens over te gaan op de verschillende groeiomstandigheden. Wit-licht-geteelde zaailingen werden gekweekt bij 20 °C onder fluorescentie wit licht (fluentiesnelheid van 40-60 µmol m-2 s-1) met een 16 uur licht/ 8 uur donker fotoperiode. Voor rood-licht behandelingen werden zaailingen gekweekt onder continu rood licht (fluentiesnelheid van 35 µmol m-2 s-1 geleverd door LED ‘ s). Voor donkere zaailingen werden platen in verschillende lagen aluminiumfolie gewikkeld. Platen werden verticaal geplaatst en gescand op hypocotyllengte met behulp van de ImageJ-software (http://rsb.info.nih.gov/ij). Voor PAC-behandeling werden zaden na inductie van kieming met de remmer overgebracht naar platen. Voor elke reeks experimenten werden ten minste 20 zaailingen gemeten.

Planttransformatie

een complementair DNA-fragment inclusief de ORF van PIF4 over de volledige lengte werd versterkt met primers PIF4-GFPf en PIF4-GFPr, gekloond in de pENTR/d-TOPO vector (Invitrogen) en ingebracht in de pk7fwg2 binaire vector (http://www.psb.ugent.be/gateway/) met de LR clonase (Invitrogen). Deze binaire constructie werd geïntroduceerd in de Pgv3101 stam van Agrobacterium en omgezet in wild-type Col-0 en Phyb Arabidopsis planten, met behulp van de floral dip transformation method33. Transformanten werden geselecteerd op kanamycine-bevattend medium en geanalyseerd op pif4–GFP nucleaire fluorescentie. Homozygote lijnen werden geselecteerd voor sterke expressers.

GA, PAC en MG132 behandelingen

GA3 (GA) en paclobutrazool (PAC) voorraden werden vers bereid in ethanol. De proteasoomremmer MG132 werd opgelost in DMSO. Voor MG132 behandeling, zaailingen werden vooraf geïncubeerd gedurende 2 uur in een 100 µM oplossing van de remmer. PAC-en GA-behandelingen werden uitgevoerd bij respectievelijk 0,1 µM en 50 µM, tenzij geïndiceerd. De gevoeligheid voor de remmer werd berekend als de omgekeerde verhouding van de vermindering van de hypocotyllengte die werd waargenomen bij zaailingen die in PAC van 0,1 µM werden gekweekt ten opzichte van de vermindering die werd waargenomen bij Col-0-planten (100%). Waarden zijn het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten. De ga-gevoeligheid werd berekend als de verhouding van de toename van de hypocotyllengte van zaailingen in 5,0 µM GA3 en verwees naar wild-type Col-0 zaailingen, zoals voorheen.

gist two-hybrid assays

DELLA repressors worden gecodeerd in aardappel door ten minste twee genen, waarbij het transcript dat wordt weergegeven door de sequentietabel TC113247 het meest in vegetatieve weefsels wordt uitgedrukt. Het volledige open leesframe voor dit DELLA proteïne werd versterkt met primers FPG1 en FPG2 en in het frame met GAL4-BD in de Pbridge-vector (Clontech) geplaatst. Om de auto-activeringsactiviteit in verband met deze volledige constructie te vermijden, werden n-end (residuen 1 tot 188), F1 (residuen 1 tot 362), M5 (residuen 188 tot 588) en Cter (residuen 362 tot 588) constructies gefuseerd aan de GAL4-BD verkregen door vertering op de unieke SPEI-en EcoRI-beperkingslocaties. Plasmiden met deze constructies, de lege pbridge vector (pGB) of een p53–GAL4BD fusie in de pgbkt7 vector (controle) werden omgezet in AH109 gistcellen en geplateerd op SD-Trp en SD-Trp-ADE-zijn platen, om te testen voor basale activering (aanvullende Fig. 1). Giststammen die de F1 -, M5-of Cter-constructies bevatten, gaven de laagste achtergrondactiviteit en werden als aas gebruikt. Gistcellen die deze constructies bevatten werden getransformeerd met een blad aardappel complementaire DNA bibliotheek gefuseerd aan de GAL4-AD in de pAD-GAL4 vector (Stratagene) en 1-3 × 106 onafhankelijke transformanten geselecteerd op SD-Leu-Trp-Ade-His voor positieve interactie.

een DNA-fragment dat overeenkomt met het volledige eiwit Arabidopsis PIF4 werd gegenereerd door PCR-amplificatie met primers PIF4yf en PIF4yr en ingebracht in de EcoRI-locatie van de gist pgbkt7 en pGADT7 vectoren. Constructies voor de Arabidopsis pif3–GAL4BD en PIF3-GAL4AD fusies werden geleverd door P. Quail.

Deletieconstructies voor de DELLA–en PIF4–eiwitten werden verkregen door een omgekeerde PCR-reactie op de RGA-BD-en PIF4-AD-constructies in de pbridge-en pAD-GAL4-vectoren. Constructies del1RGA en del2RGA werden gegenereerd met behulp van primers RGAdel1 of RGAdel2 en pBridBam, die een BamHI restrictie site te introduceren aan elk uiteinde. Om constructies del1PIF4, del2PIF4 en del3PIF4 te genereren, werd de unieke xbai-site in de pAD-GAL4 polylinker verwijderd door in te vullen. Dit plasmide werd vervolgens gebruikt als een sjabloon voor inverse PCR reacties met primers PIF4del1, PIF4del2 of PIF4del3 en pGADXba, de invoering van een xbai beperking plaats aan elk uiteinde. PCR producten werden verteerd ofwel met BamHI of XbaI, religieus en omgezet in Escherichia coli om de verschillende constructies te verkrijgen. Deze plasmiden werden omgezet in de ah109 gist stam en geplateerd op SD-4 platen voor analyse voor interactie. de activiteit van β-galactosidase werd bepaald op vloeibare culturen van deze transformanten met behulp van het ONPG-substraat en de standaardprotocol-voorwaarden.

Constructies gelijk aan de aardappel RGA M5 fragment voor het Arabidopsis DELLA genen RGA1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) en RGL3 (At5g17490) werden gegenereerd door PCR-amplificatie met de primer sets RGL1pGB-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r, RGApGB-f/RGApGB-r en RGApGB-f/GAIpGB – r (Aanvullende Tabel 1). Deze fragmenten werden ingebracht in de gist pgbkt7 vector met behulp van de restrictie-enzymen BamHI/SalI voor RGL1, SalI/PstI voor RGL3 en BamHI/PstI voor RGA1 en GAI.

Pull-down assays

een DNA-fragment dat codeert voor het volledige eiwit Arabidopsis RGA werd verkregen door PCR-amplificatie met primers RGAgst-f en RGAgst-r en gekloond in de BamHI-site van de pzex-vector, om een in-frame fusie met het GST-coderingsgebied te verkrijgen. De RGA-pZEX en lege pzex vector werden omgezet in de E. coli stam BL21 (DE3) pLysS (Stratagene) en culturen van deze cellen gegroeid bij 37 °C tot een D600 = 0,8. Expressie van de GST-eiwitten werd geïnduceerd met 1 mM IPTG, gedurende 3 extra uren bij 30 °C, en eiwitextractie en binding aan gluthathion-Sepharose parels (Clontech) werd uitgevoerd volgens het protocol geleverd door de fabrikant.

De pif4 -, pif3-en carboxy-terminal phyA-constructies in de pgbkt7-vector werden gebruikt als sjablonen voor in vitro transcriptie/vertaling, in aanwezigheid van 35S-methionine, met behulp van het TnT-systeem (Promega). Plasmide DNA (1 µg) werd gebruikt in elke reactie. Voor pull-down werd 10 µl van de translatiereacties gedurende 30 minuten geïncubeerd met de RGA-GST en GST parels (1 µg eiwit gebonden aan de parels) in PBS, 0,05% tergitol, 10% glycerol. Parels werden grondig gewassen, geresuspendeerd in 2× laadbuffer en geanalyseerd door SDS–PAGE op eiwitbinding.

Transiënte expressie testen

DNA-fragmenten het coderen van de Arabidopsis full-length PIF4 en RGA eiwitten, en de ΔRGA en del1RGA verwijderingen werden verkregen door PCR-amplificatie met primer paren PIF4yf en PIF4yr, RGAgst-f en RGAgst-r, ΔRGA-f en RGAgast-r en del1RGA-f en RGAgst-r, en ingevoegd in de polilynker EcoRI of BamHI sites van de pJIT60 vector, onder de controle van de 2×35S-promotor. Een fragment van het G-boxmotief dat door gel-shift-assays werd gerapporteerd als een doelelement voor pif4-herkenning34 werd gefuseerd aan het GUS reporter-gen en gebruikt als reporter-constructie. We waren niet in staat om pif4-gemedieerde stimulatie van deze reporter construct te detecteren, wat erop wijst dat extra nucleotide sequenties rond het CACGTG motief nodig zouden kunnen zijn voor efficiënte activering. Om te zoeken naar een promotor-element dat geschikt is om in deze tests te worden gebruikt, werden voorlopige RNA-profileringsexperimenten van 35S-pif4-en pif4-mutanten uitgevoerd, waardoor LTP3 (At5g59320) werd geïdentificeerd als een sterk upregulated transcript in 35S-PIF4-zaailingen. De promotor regio voor dit gen werd versterkt met behulp van primers LT3p-f en LTP3p-r en ingebracht in de ecori en BamHI sites van de pgus vector om de LTP3-GUS reporter construct te verkrijgen. De 2 × 35S-luciferase fusie werd gebruikt als een interne controle. Arabidopsis cellen werden verspreid op filtreerpapier en ‘ s nachts geïncubeerd op LT87 medium (4,4 g L-1 Murashige en Skoog zouten + vitaminen, 0,5 g l-1 MES, 0,5 g L-1 NAA, 30 g L-1 sucrose, 8 g L-1 agar). Twee uur voor het bombardement, werden filters overgebracht naar LT87 medium met 200 mM mannitol om vacuole terugtrekking te induceren. DNA precipitatie en deeltjesbombardement werd uitgevoerd met behulp van een helium-aangedreven deeltjesversneller (PDS-1000; Bio-Rad), volgens de instructies van de fabrikant. De cellen werden getransformeerd met 0,5 µg van de LTP3-GUS reporter plasmide + 0.5 µg van de 2×35S-LUC interne standaard, en 2 µg van de pJIT60 lege vector (LTP3), 1 µg van de 2×35S-PIF4 effector bouwen + 1 µg pJIT60 (PIF4), of 1 µg / kg elke 2×35S-PIF4 en 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA of 2×35S-del1RGA effector constructies (PIF4 + RGA, PIF4 + ΔRGA, PIF4 + del1RGA). Filters werden overgebracht op verse LT87-platen (- GA) of op LT87-platen + 50 µM GA3 (+GA) en gedurende 16 uur geïncubeerd. cellen werden geëxtraheerd in de cellysisbuffer die in de Luciferase Assay System kit (Promega) is geleverd en geklaard door centrifugering bij 12.000 g gedurende 5 minuten. LUC activiteit werd bepaald volgens de kit en GUS activiteit bepaald door fluorometrische assay35. De ltp3-promotoractiviteit werd berekend als de verhouding tussen GUS en LUC-activiteit in elk monster. Voor elke behandeling werden vier Replica-platen gebruikt.

RNA-extracties en reverse transcriptase (RT)–PCR

voor genexpressieanalyses werd totaal RNA geëxtraheerd uit vier dagen oude zaailingen met behulp van de guanidine-HCl-methode36 en vervolgens behandeld met DNaseI (Roche) alvorens te reinigen via Qiagen RNeasy Mini columns (Qiagen). RNA (1 µg) werd gebruikt voor eerst-bundel cDNA synthese gebruikend de hoge capaciteit cDNA Archiefuitrusting (Toegepaste Biosystems) en 1.0 µl van deze reactie werd gebruikt als malplaatje voor PCR versterking. De inleidingssets AtLTP3-f / AtLTP3-r, Atexpan-f/Atexpan-r en Atactin8-f/Atactin8-r werden gebruikt voor versterking van de afschriften LTP3 (At5g59320), β-expansin (At2g20750) en actin-8 (At1g49240).

bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays

volledige open reading frame sequenties voor de Arabidopsis pif4 en RGA proteïnen werden versterkt met respectievelijk primers PIF4YFP-f/ PIF4YFP-r en RGAYFP-f / RGAYFP-r. De PCR producten werden gekloond in de pENTR / d-TOPO vector (Invitrogen) en ingebracht door LR-reactie (Invitrogen) in de binaire pBiFC vectoren (F. Parcy) die de amino – of C-eindfragmenten van de eYFP fluorescente proteã ne (eYFPN en eYFPC) bevatten. Alle acht mogelijke paarsgewijze combinaties van deze constructies werden omgevormd tot Agrobacterium tumefaciens en geïnfiltreerd in het abaxiale oppervlak van 2-3 weken oude nicothiana benthamiana planten zoals beschreven 37. Het P19-eiwit van tomaat bossige stuntvirus werd gebruikt om gen het tot zwijgen brengen te onderdrukken. Agrobacteriumstammen die de pBiFC-constructies bevatten en het P19-tot zwijgen brengende plasmide hadden een D600-Verhouding van 0,7: 0,7: 1 voor infiltratie. Fluorescentie werd gevisualiseerd in epidermale cellagen van de bladeren na 2 dagen infiltratie, met behulp van een Leica DMR fluorescente microscoop. Bladeren werden geïncubeerd met 1 µg ml-1 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) voor kleuring van de kernen.

pif4/RGA–GFP co-immunoprecipitaties

Co-immunoprecipitaties van de RGA-en PIF4-eiwitten werden uitgevoerd op 7 dagen oude RGA-GFP–RGA transgene zaailingen10 gekweekt onder wit licht. Zaailingen werden ofwel in het donker geïncubeerd of overgebracht naar PAC – of GA-bevattende medium en gedurende 12 extra uren geïncubeerd voordat ze werden geëxtraheerd. Immunoprecipitatie van het GFP-RGA eiwit werd uitgevoerd bij 4 °C gedurende 6 uur, gebruikend een anti-GFP antilichaam (Santa Cruz biotechnologie) in een buffer die 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, PMSF (1 mM) en proteaseremmers (Sigma) bevat. Eiwit g agarose (Sigma) werd gebruikt om de immunoproteïne complexen neerslaan. Pif4-detectie werd uitgevoerd met een anti-pif4-antilichaam.

chromatine-immunoprecipitaties en PCR-versterkingen

chromatine-immunoprecipitatietesten werden uitgevoerd zoals eerder beschreven 29. Pif4-HA zaailingen20 werden gedurende 6 dagen op GM-medium geteeld onder continu rood licht en vervolgens overgebracht naar platen met GA of PAC en ‘ s nachts in het donker bewaard. Zaailingen (1,5-2 g) en 40 µl van de anti-HA affiniteit Matrix (Roche) werden gebruikt voor chromatine immunoprecipitation. Precipitated DNA werd opgelost in 50 µl TE, en 0,5 µl werd gebruikt voor PCR-versterking met behulp van de primers vermeld in aanvullende tabel 1. De PCR-omstandigheden waren als volgt: 94 °C gedurende 2 min, 35 cycli van 94 ° C gedurende 15 s, 55 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s, gevolgd door 72 °C gedurende 7 min. Sonicated input DNA (0,3%) werd gebruikt voor een kwantitatieve controle. Western blot analyses werden uitgevoerd om de hoeveelheid teruggevonden pif4-eiwit na chromatin immunoprecipitation te kwantificeren. Blots werden immunodetecteerd met een anti-HA peroxidase high Affinity antilichaam (Roche).

microscopie

Eiwitstabiliteit tests werden uitgevoerd met behulp van Radiance 2100 (Bio-Rad) laserscanning systeem gekoppeld aan een Zeiss Axiovert 200 microscoop. Voor de opwinding van GFP en chlorofyl, werden een argon ionenlaser bij 488 nm golflengte en een rode diode bij 637 nm aangewend, respectievelijk. De gebruikte combinatie van filters was: 560 dclpxr beam splitter en HQ 515/30 emissiefilter voor GFP, en HQ 660LP voor chlorofyl detectie. De beelden werden sequentieel genomen met behulp van de LaserSharp v5. 0 software (Bio-Rad) en samengevoegd met behulp van de LaserPix V 4 image software (Bio-Rad).

Gel-shift assay

De oligonucleotiden pLTP-WTf/r en pLTP-MUTf / r werden gebruikt om de LTP3-sondes en Specifieke concurrenten te genereren die in EMSA-assays werden gebruikt. Oligonucleotiden werden onthard in de buffer van het beperkingsenzym van 5× M en geëindigd-geëtiketteerd door opvulling met Klenow. Voor eiwitextracten, N. benthamiana bladeren werden geïnfiltreerd met de Agrobacterium stammen voor de 35S-PIF4–HA (PIF4) en 35S-RGA–GFP (RGA) constructies of met een 1:1 mengsel (PIF4 + RGA) van deze stammen en met de P19 construct zoals hierboven beschreven. Bladextracten werden verkregen door homogenisatie in hoge zoutbuffer (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0,5% nonidet P-40, 1 mM DTT, + proteaseremmer), clearing door centrifugering en daaropvolgende dialyse tegen 1× BB (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,1 M KCl, 1 mM EDTA, 0,05% nonidet P-40, 0,5 mM DTT, 10% glycerol). De aanwezigheid van equivalente hoeveelheden pif4-en RGA-eiwitten in de extracten werd beoordeeld door middel van western blot-detectie met anti-HA (Roche) en anti-GFP (Santa Cruz) antilichamen. Toenemende hoeveelheden van deze extracten (5,0, 10,0, 15,0 µl) werden gebruikt voor de EMSA-reactie. Extracten werden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met de geëtiketteerde sonde en 100 ng poly (dI-dIC) in 20 µl 1× BB en gescheiden door 6% pagina in 0,5× TBE. Een 100-voudige overmaat van wild-type (WT) en mutant (MUT) ontharde oligonucleotiden werd gebruikt voor specifieke concurrentie.