Un cadre moléculaire pour le contrôle de la lumière et de la gibbérelline de l'élongation cellulaire|Nature

Matières végétales et conditions de croissance

Les plantes de type sauvage et mutantes utilisées dans cette étude étaient toutes dans les écotypes Col-0, à l’exception des lignes10 RGA-GFP-RGA, qui étaient dans l’écotype Ler. Les graines phyB-931 ont été obtenues du Centre de ressources biologiques Arabidopsis. Les lignées surexprimantes PIF4 et les mutations knockout pif4 (mutant slr2) étaient celles décrites dans la réf. 3. Des mutants doubles pif4 pif5 ont été obtenus en croisant l’allèle d’insertion de l’ADN-T pif4-101 et le mutant SALK-08701218 avec une insertion dans le gène PIF5. 20 lignées d’ox portant une insertion d’ADN-T knockout dans le gène AtGA20ox1 (At4g25420) ont été fournies par P. Hedden. Les lignées gai insensibles aux GA ont exprimé la protéine GAI stable sous le contrôle du promoteur 35S. Des mutants doubles et triples ont été générés en croisant ces lignées et en génotypant la progéniture par amplification par PCR ou par analyse northern blot.

Les graines ont été stérilisées en surface et semées sur des plaques de gélose GM sans sucrose32. Les plaques ont été traitées à froid pendant 2 jours à 4 °C et la germination a été synchronisée par 3 h d’irradiation à la lumière blanche puis incubation dans l’obscurité pendant 22 h, avant transfert dans les différentes conditions de croissance. Les plantules à lumière blanche ont été cultivées à 20 °C sous une lumière blanche fluorescente (taux de fluence de 40-60 µmol m-2 s-1) avec une photopériode sombre de 16 h / 8 h. Pour les traitements à la lumière rouge, les semis ont été cultivés sous une lumière rouge continue (taux de fluence de 35 µmol m-2 s-1 fourni par des LED). Pour les semis à croissance foncée, les plaques ont été enveloppées dans plusieurs couches de papier d’aluminium. Les plaques ont été placées dans une orientation verticale et scannées pour la longueur de l’hypocotyle à l’aide du logiciel ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). Pour le traitement PAC, les graines ont été transférées sur des plaques avec l’inhibiteur, après induction de la germination. Au moins 20 semis ont été mesurés pour chaque série d’expériences.

Transformation végétale

Un fragment d’ADN complémentaire comprenant l’ORF pleine longueur de PIF4 a été amplifié avec des amorces PIF4-GFPf et PIF4-GFPr, cloné dans le vecteur pENTR/D-TOPO (Invitrogen) et inséré dans le vecteur binaire pK7FWG2 (http://www.psb.ugent.be/gateway/) avec la clonase LR (Invitrogen). Cette construction binaire a été introduite dans la souche pGV3101 d’Agrobacterium et transformée en plantes sauvages Col-0 et phyB Arabidopsis, en utilisant la méthode de transformation par trempage floral33. Des transformants ont été sélectionnés sur milieu contenant de la kanamycine et analysés pour la fluorescence nucléaire de PIF4-GFP. Les lignes homozygotes ont été sélectionnées pour des expresseurs puissants.

Traitements GA, PAC et MG132

Les stocks de GA3 (GA) et de paclobutrazol (PAC) ont été fraîchement préparés dans de l’éthanol. L’inhibiteur du protéasome MG132 a été dissous dans le DMSO. Pour le traitement au MG132, les plantules ont été pré-incubées pendant 2 h dans une solution à 100 µM de l’inhibiteur. Les traitements PAC et GA ont été effectués respectivement à 0,1 µM et 50 µM, sauf indication contraire. La sensibilité à l’inhibiteur a été calculée comme le rapport inversé de la réduction de la longueur de l’hypocotyle observée chez les plantules cultivées en PAC de 0,1 µM par rapport à la réduction observée chez les plantes Col-0 (100 %). Les valeurs sont la moyenne de trois expériences indépendantes. La sensibilité au GA a été calculée comme le rapport de l’augmentation de la longueur hypocotyle des plantules dans 5,0 µM de GA3 et référencée aux plantules de type sauvage Col-0, comme précédemment.

Les dosages bi-hybrides de levure

Les répresseurs DELLA sont codés dans la pomme de terre par au moins deux gènes, le transcrit représenté par l’étiquette de séquence exprimée TC113247 étant le plus abondamment exprimé dans les tissus végétatifs. Le cadre de lecture ouvert sur toute la longueur de cette protéine DELLA a été amplifié à l’aide d’amorces FPG1 et FPG2 et inséré dans le cadre avec le GAL4-BD dans le vecteur pPridge (Clontech). Pour éviter l’activité d’auto-activation associée à cette construction pleine longueur, des constructions N-end (résidus 1 à 188), F1 (résidus 1 à 362), M5 (résidus 188 à 588) et Cter (résidus 362 à 588) fusionnées au GAL4-BD ont été obtenues par digestion aux sites de restriction SpeI et EcoRI uniques. Les plasmides contenant ces constructions, le vecteur pBridge vide (pGB) ou une fusion p53–GAL4BD dans le vecteur pGBKT7 (contrôle) ont été transformés en cellules de levure AH109 et plaqués sur des plaques SD-Trp et SD-Trp-Ade-His, pour tester l’activation basale (Fig. 1). Les souches de levure contenant les constructions F1, M5 ou Cter ont donné l’activité de fond la plus faible et ont été utilisées comme appâts. Les cellules de levure contenant ces constructions ont été transformées avec une banque d’ADN complémentaire de pomme de terre en feuille fusionnée au GAL4-AD dans le vecteur pAD-GAL4 (Stratagène) et 1-3 × 106 transformants indépendants sélectionnés sur SD-Leu-Trp-Ade-His pour une interaction positive.

Un fragment d’ADN correspondant à la protéine pleine longueur d’Arabidopsis PIF4 a été généré par amplification PCR avec des amorces PIF4yf et PIF4yr et inséré dans le site EcoRI des vecteurs pGBKT7 et pGADT7 de levure. Les constructions pour les fusions d’Arabidopsis PIF3–GAL4BD et PIF3–GAL4AD ont été fournies par P. Cail.

Des constructions de délétion pour les protéines DELLA et PIF4 ont été obtenues par réaction PCR inverse sur les constructions RGA-BD et PIF4-AD dans les vecteurs pBridge et pAD-GAL4. Les constructions del1RGA et del2RGA ont été générées à l’aide d’amorces RGAdel1 ou RGAdel2 et pBridBam, qui introduisent un site de restriction BamHI à chaque extrémité. Pour générer les constructions del1PIF4, del2PIF4 et del3PIF4, le site XbaI unique dans le polylinker pAD-GAL4 a été supprimé par fill-in. Ce plasmide a ensuite été utilisé comme matrice pour des réactions de PCR inverses avec des amorces PIF4del1, PIF4del2 ou PIF4del3 et pGADXba, introduisant un site de restriction XbaI à chaque extrémité. Les produits de PCR ont été digérés avec BamHI ou XbaI, religieusement et transformés en Escherichia coli pour obtenir les différentes constructions. Ces plasmides ont été transformés en souche de levure AH109 et plaqués sur des plaques SD-4 afin de tester l’interaction. l’activité de la β-galactosidase a été déterminée sur des cultures liquides de ces transformants en utilisant le substrat ONPG et les conditions du protocole standard.

Des constructions équivalentes au fragment RGA M5 de la pomme de terre pour les gènes Arabidopsis DELLA RGA1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) et RGL3 (At5g17490) ont été générées par amplification PCR avec les ensembles d’amorces RGL1pGB-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r, RGApGB- f/RGApGB-r et RGApGB-f/GAIpGB-r (Tableau supplémentaire 1). Ces fragments ont été insérés dans le vecteur pGBKT7 de la levure en utilisant les enzymes de restriction BamHI/SalI pour RGL1, SalI/PstI pour RGL3 et BamHI/PstI pour RGA1 et GAI.

Tests déroulants

Un fragment d’ADN codant pour la protéine pleine longueur d’Arabidopsis RGA a été obtenu par amplification PCR avec des amorces RGAgst-f et RGAgst-r et cloné dans le site BamHI du vecteur pZEX, pour obtenir une fusion dans la trame avec la région codante GST. Le vecteur RGA-pZEX et le vecteur PZEX vide ont été transformés en la souche d’E. coli BL21 (DE3) pLysS (Stratagene) et des cultures de ces cellules ont été cultivées à 37 °C jusqu’à un D600 = 0,8. L’expression des protéines GST a été induite avec 1 mm d’IPTG, pendant 3 heures supplémentaires à 30 °C, et l’extraction et la liaison des protéines aux billes de gluthathion-Sépharose (Clontech) ont été effectuées selon le protocole fourni par le fabricant.

Les constructions phyA PIF4, PIF3 et carboxy-terminales dans le vecteur pGBKT7 ont été utilisées comme modèles pour la transcription/traduction in vitro, en présence de 35S-méthionine, en utilisant le système TnT (Promega). L’ADN plasmidique (1 µg) a été utilisé dans chaque réaction. Pour le pull-down, 10 µl des réactions de traduction ont été incubés pendant 30 min avec les billes RGA–GST et GST (1 µg de protéine liée aux billes) dans du PBS, 0,05% de tergitol, 10% de glycérol. Les billes ont été soigneusement lavées, remises en suspension dans un tampon de chargement 2× et analysées par SDS–PAGE pour la liaison aux protéines.

Essais d’expression transitoire

Des fragments d’ADN codant pour les protéines PIF4 et RGA de pleine longueur d’Arabidopsis, et les délétions ΔRGA et del1RGA ont été obtenus par amplification PCR avec des paires d’amorces PIF4yf et PIF4yr, RGAgst-f et RGAgst-r, ΔRGA-f et RGAgast-r et del1RGA-f et RGAgst-r, et insérés dans les sites polilynker EcoRI ou BamHI de la Vecteur pJIT60, sous le contrôle du promoteur 2×35S. Un fragment de motif de boîte G rapporté par des tests de décalage de gel comme étant un élément cible pour la reconnaissance de PIF434 a été fusionné au gène rapporteur GUS et utilisé comme construction rapporteuse. Nous n’avons pas pu détecter la stimulation médiée par le PIF4 de cette construction rapporteuse, indiquant que des séquences nucléotidiques supplémentaires entourant le motif CACGTG pourraient être nécessaires pour une activation efficace. Pour rechercher un élément promoteur apte à être utilisé dans ces essais, des expériences préliminaires de profilage de l’ARN de mutants 35S-PIF4 et pif4 ont été réalisées, identifiant ainsi LTP3 (At5g59320) comme une transcription fortement régulée à la hausse chez les plantules 35S-PIF4. La région promotrice de ce gène a été amplifiée à l’aide des amorces LT3p-f et LTP3p-r et insérée dans les sites EcoRI et BamHI du vecteur pGUS pour obtenir la construction reporter LTP3-GUS. La fusion 2×35S-luciférase a été utilisée comme contrôle interne. Des cellules d’Arabidopsis ont été étalées sur du papier filtre et incubées pendant une nuit sur milieu LT87 (4,4 g de sels de Murashige et de Skoog l-1 + vitamines, 0,5 g de MES l-1, 0,5 g de NAA l-1, 30 g de saccharose l-1, 8 g de gélose l-1). Deux heures avant le bombardement, les filtres ont été transférés dans un milieu LT87 avec du mannitol de 200 mM pour induire la rétraction de la vacuole. La précipitation de l’ADN et le bombardement des particules ont été effectués à l’aide d’un accélérateur de particules entraîné par l’hélium (PDS-1000; Bio-Rad), conformément aux instructions du fabricant. Les cellules ont été transformées avec 0,5 µg du plasmide rapporteur LTP3-GUS + 0,5 µg de l’étalon interne 2×35S-LUC, et soit 2 µg du vecteur vide pJIT60 (LTP3), 1 µg de la construction effectrice 2×35S-PIF4 + 1 µg de pJIT60 (PIF4), soit 1 µg de chaque 2×35S-PIF4 et 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA ou 2×35S – Constructions d’effecteurs del1RGA (PIF4 + RGA, PIF4 + ΔRGA, PIF4 + del1RGA). Les filtres ont été transférés sur des plaques LT87 fraîches (-GA) ou sur des plaques LT87 + 50 µM GA3 (+ GA) et incubés pendant 16 h. Les cellules ont été extraites dans le tampon de lyse cellulaire fourni dans le kit de système d’analyse de la Luciférase (Promega) et nettoyées par centrifugation à 12 000 g pendant 5 min. L’activité LUC a été déterminée en fonction du kit et de l’activité GUS déterminées par dosage fluorométrique35. L’activité promotrice de la LTP3 a été calculée comme le rapport entre l’activité GUS et l’activité LUC dans chaque échantillon. Quatre répliques de plaques ont été utilisées pour chaque traitement.

Extractions d’ARN et transcriptase inverse (RT)–PCR

Pour les analyses d’expression génique, l’ARN total a été extrait de semis de 4 jours en utilisant la méthode guanidine-hcl36 et ensuite traité avec du DNaseI (Roche) avant d’être nettoyé à travers des Mini colonnes Qiagen RNeasy (Qiagen). L’ARN (1 µg) a été utilisé pour la synthèse d’ADNc du premier brin à l’aide du Kit d’archivage d’ADNc haute capacité (Applied Biosystems) et 1,0 µl de cette réaction a été utilisé comme modèle pour l’amplification par PCR. Les ensembles d’amorces AtLTP3-f/AtLTP3-r, Atexpan-f/Atexpan-r et Atactin8-f/Atactin8-r ont été utilisés pour l’amplification des transcrits LTP3 (At5g59320), β-expansine (At2g20750) et actine-8 (At1g49240).

Tests de complémentation par fluorescence bimoléculaire (BiFC)

Des séquences de trame de lecture ouverte sur toute la longueur des protéines Arabidopsis PIF4 et RGA ont été amplifiées avec des amorces PIF4YFP-f/PIF4YFP-r et RGAYFP-f/RGAYFP-r, respectivement. Les produits PCR ont été clonés dans le vecteur pENTR/D-TOPO (Invitrogen) et insérés par réaction LR (Invitrogen) dans les vecteurs binaires pBiFC (F. Parcy) contenant les fragments amino ou C-terminaux de la protéine fluorescente eYFP (eYFPN et eYFPC). Les huit combinaisons possibles par paires de ces constructions ont été transformées en Agrobacterium tumefaciens et co-infiltrées dans la surface abaxiale de plantes de Nicothiana benthamiana âgées de 2 à 3 semaines, comme décrit 37. La protéine p19 du virus tomato bushy stunt a été utilisée pour supprimer le silençage génique. Les souches d’Agrobacterium contenant les constructions pBiFC et le plasmide de silençage p19 étaient à un rapport D600 de 0,7:0,7:1 pour l’infiltration. La fluorescence a été visualisée dans les couches cellulaires épidermiques des feuilles après 2 jours d’infiltration, à l’aide d’un microscope fluorescent Leica DMR. Les feuilles ont été incubées avec 1 µg ml-1 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour la coloration des noyaux.

Co–immunoprécipitations PIF4/RGA-GFP

Des études de co-immunoprécipitation des protéines RGA et PIF4 ont été réalisées sur des semis transgéniques RGA-GFP-RGA âgés de 7 jours10 cultivés sous lumière blanche. Les plantules ont été incubées dans l’obscurité ou transférées dans un milieu contenant du PAC ou du GA et incubées pendant 12 heures supplémentaires avant l’extraction. L’immunoprécipitation de la protéine GFP–RGA a été réalisée à 4 °C pendant 6 h, en utilisant un anticorps anti-GFP (Santa Cruz Biotechnology) dans un tampon contenant du Tris-HCl de 50 mM, un pH de 7,5, du NaCl de 150 mM, du Triton X-100 à 0,5%, du PMSF (1 mM) et des inhibiteurs de protéase (Sigma). L’agarose de la protéine G (Sigma) a été utilisé pour précipiter les complexes immunoprotéiques. La détection de PIF4 a été réalisée avec un anticorps anti-PIF4.

immunoprécipitations à la chromatine et amplifications par PCR

Des essais d’immunoprécipitation à la chromatine ont été effectués comme décrit précédemment 29. Les semis de PIF4-ha20 ont été cultivés sur milieu GM pendant 6 jours sous une lumière rouge continue, puis ont été transférés dans des plaques contenant GA ou PAC et conservés pendant une nuit dans l’obscurité. Des semis (1,5-2 g) et 40 µl de la matrice d’affinité anti-HA (Roche) ont été utilisés pour l’immunoprécipitation à la chromatine. L’ADN précipité a été dissous dans 50 µl de TE, et 0,5 µl a été utilisé pour l’amplification par PCR en utilisant les amorces énumérées dans le Tableau supplémentaire 1. Les conditions de PCR étaient les suivantes : 94 °C pendant 2 min, 35 cycles de 94 °C pendant 15 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s, suivis de 72 °C pendant 7 min. L’ADN d’entrée soniqué (0,3%) a été utilisé pour un contrôle quantitatif. Des analyses de Western blot ont été effectuées pour quantifier la quantité de protéine PIF4 récupérée après immunoprécipitation de la chromatine. Des blots ont été immunodétectés avec un anticorps de haute affinité Anti-HA peroxydase (Roche).

Microscopie

Des tests de stabilité des protéines ont été réalisés à l’aide du système de balayage laser Radiance 2100 (Bio-Rad) couplé à un microscope Zeiss Axiovert 200. Pour l’excitation de la GFP et de la chlorophylle, un laser à ions argon à 488 nm de longueur d’onde et une diode rouge à 637 nm ont été utilisés, respectivement. La combinaison de filtres utilisée était la suivante: séparateur de faisceau 560 DCLPXR et filtre d’émission HQ 515/30 pour le GFP et HQ 660LP pour la détection de la chlorophylle. Les images ont été prises séquentiellement à l’aide du logiciel LaserSharp v5.0 (Bio-Rad) et fusionnées à l’aide du logiciel d’image LaserPix v.4 (Bio-Rad).

Test Gel-shift

Les oligonucléotides pLTP-WTf/r et pLTP-MUTf/r ont été utilisés pour générer les sondes LTP3 et des concurrents spécifiques utilisés dans les tests EMSA. Les oligonucléotides ont été recuits dans un tampon enzymatique de restriction de 5× M et marqués par remplissage avec Klenow. Pour les extraits protéiques, N. les feuilles de benthamiana ont été infiltrées avec les souches Agrobacterium pour les constructions 35S-PIF4–HA (PIF4) et 35S-RGA–GFP (RGA) ou avec un mélange 1:1 (PIF4 + RGA) de ces souches et avec la construction p19 telle que décrite ci-dessus. Des extraits de feuilles ont été obtenus par homogénéisation dans un tampon à haute teneur en sel (HEPES 20 mM, pH 7,9, 0,5 M KCl, 1 Mm EDTA, 1 mm MgCl2, 0,5% de nonidet P-40, 1 mm DTT, + inhibiteur de protéase), compensation par centrifugation puis dialyse contre 1 × BB (HEPES 20 mM, pH 7,9, 0,1 M KCl, 1 MM EDTA, 0,05% de nonidet P-40, 0,5 mM DTT, 10 % de glycérol). La présence de quantités équivalentes de protéines PIF4 et RGA dans les extraits a été évaluée par détection western blot avec des anticorps anti-HA (Roche) et anti-GFP (Santa Cruz). Des quantités croissantes de ces extraits (5,0, 10,0, 15,0 µl) ont été utilisées pour la réaction EMSA. Les extraits ont été incubés pendant 15 min à température ambiante avec la sonde marquée et 100 ng de poly (dI-dIC) dans 20 µl 1× BB et séparés de 6% de PAGE dans 0,5× TBE. Un excès de 100 fois d’oligonucléotides recuits de type sauvage (WT) et de mutants (MUT) a été utilisé pour une compétition spécifique.

KGSAU

Un cadre moléculaire pour le contrôle de la lumière et de la gibbérelline de l’élongation cellulaire