plantematerialer og vækstbetingelser

vildtype-og mutantplanter anvendt i denne undersøgelse var alle i Col–0-økotyperne med undtagelse af RGA-GFP-RGA-linjene10, som var i Ler-økotypen. phyB-9 frø31 blev opnået fra Arabidopsis Biological Resource Center. PIF4-overekspresserlinjer og pif4-knockout-mutationer (slr2-mutant) var dem, der er beskrevet i ref. 3. Dobbelt pif4 pif5 mutanter blev opnået ved at krydse pif4-101 T-DNA-indsættelsesallelen og Salk-087012 mutant18 med en indsættelse i PIF5-genet. 20okslinier med en knockout-T-DNA-indsættelse i atga20oks1-genet (At4g25420) blev leveret af P. Hedden. GA-ufølsomme gai-linjer udtrykte det stabile GAI-protein under kontrol af 35S-promotoren. Dobbelt og tredobbelt mutanter blev genereret ved at krydse disse linjer og genotypebestemme afkom ved PCR-amplifikation eller Northern blot-analyser.

frø blev overfladesteriliseret og sået på GM-agarplader uden sucrose32. Plader blev koldbehandlet for 2 d ved 4 liter C og spiring blev synkroniseret ved 3 h bestråling med hvidt lys og efterfølgende inkubation i mørke for 22 h, før overførsel til de forskellige vækstbetingelser. Hvid-lys-dyrkede frøplanter blev dyrket ved 20 liter C under fluorescens hvidt lys (fluenshastighed på 40-60 liter m-2 s-1) med en 16 timer lys/ 8 timer mørk fotoperiode. Til behandlinger med rødt lys blev kimplanter dyrket under kontinuerligt rødt lys (fluenshastighed på 35 kpmol m-2 s-1 leveret af LED ‘ er). For mørkvoksede frøplanter blev plader pakket ind i flere lag aluminiumsfolie. Plader blev anbragt i lodret retning og scannet for hypocotyllængde ved hjælp af ImageJ-programmet (http://rsb.info.nih.gov/ij). Til PAC-behandling blev frø overført til plader med inhibitoren efter induktion af spiring. Mindst 20 kimplanter blev målt for hvert sæt eksperimenter.

plantetransformation

et komplementært DNA-fragment inklusive fuld længde ORF af PIF4 blev amplificeret med primere PIF4-gfpf og PIF4-GFPr, klonet i pENTR/D-TOPO-vektoren (Invitrogen) og indsat i pk7fvg2 binær vektor (http://www.psb.ugent.be/gateway/) med LR-klonasen (Invitrogen). Denne binære konstruktion blev introduceret i pgv3101-stammen af Agrobacterium og omdannet til vildtype Col-0 og phyB Arabidopsis planter ved hjælp af blomsterdypetransformationsmetoden33. Transformanter blev udvalgt på kanamycinholdigt medium og analyseret for pif4–GFP nuklear fluorescens. Homosygøse linjer blev valgt til stærke Ekspres.

ga -, PAC-og mg132-behandlingerne

GA3 (GA) og PAC-lagrene blev frisklavet i ethanol. Proteasominhibitoren MG132 blev opløst i DMSO. Til mg132-behandling blev frøplanter præinkuberet i 2 timer i en 100 liter opløsning af inhibitoren. PAC-og GA-behandlinger blev udført ved henholdsvis 0,1 og 50 liter, medmindre andet er angivet. Følsomhed over for inhibitoren blev beregnet som det inverterede forhold mellem reduktionen i hypocotyllængde observeret for kimplanter dyrket i 0,1 liter PAC i forhold til reduktionen observeret i Col-0 planter (100%). Værdier er gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter. Ga-følsomhed blev beregnet som forholdet mellem stigningen i hypocotyllængde af kimplanter i 5,0 liter GA3 og henvist til vildtype Col-0-kimplanter som før.

gær-to-hybridassays

DELLA-repressorer kodes i kartoffel af mindst to gener, hvor transkriptionen repræsenteret af det udtrykte sekvensmærke TC113247 er den mest rigeligt udtrykt i vegetativt væv. Den åbne læseramme i fuld længde for dette della-protein blev amplificeret ved anvendelse af primere FPG1 og FPG2 og indsat i ramme med GAL4-BD i pBridge-vektoren (Clontech). For at undgå den autoaktiveringsaktivitet, der er forbundet med denne konstruktion i fuld længde, blev n-end (rester 1 til 188), F1 (rester 1 til 362), M5 (rester 188 til 588) og Cter (rester 362 til 588) konstruktioner smeltet sammen med GAL4-BD opnået ved fordøjelse på de unikke SpeI-og EcoRI-restriktionssteder. Plasmider indeholdende disse konstruktioner, den tomme pBridge–vektor (pGB) eller en p53-GAL4BD-fusion i pGBKT7-vektoren (kontrol) blev omdannet til AH109 gærceller og belagt på SD-Trp og SD-Trp-Ade-his-plader for at teste for basal aktivering (supplerende Fig. 1). Gærstammer indeholdende F1 -, M5-eller Cter-konstruktioner gav den laveste baggrundsaktivitet og blev brugt som agn. Gærceller indeholdende disse konstruktioner blev transformeret med et bladkartoffel komplementært DNA-bibliotek smeltet sammen med GAL4-AD I pAD-GAL4-vektoren (Stratagene) og 1-3 kur 106 uafhængige transformanter valgt på SD-Leu-Trp-Ade-His for positiv interaktion.

et DNA-fragment svarende til Arabidopsis PIF4-proteinet i fuld længde blev genereret ved PCR-amplifikation med primere PIF4yf og PIF4yr og indsat på EcoRI-stedet for gær-pgbkt7-og pGADT7-vektorerne. Konstruktioner til Arabidopsis PIF3-GAL4BD og PIF3–GAL4AD fusioner blev leveret af P. vagtel.

Deletionskonstruktioner for della–og PIF4–proteinerne blev opnået ved invers PCR-reaktion på RGA-BD-og PIF4-ad-konstruktionerne i pBridge-og pAD-GAL4-vektorerne. Konstruktioner del1RGA og del2RGA blev genereret ved hjælp af primere RGAdel1 eller RGAdel2 og pBridBam, som introducerer et BamHI-begrænsningssted i hver ende. For at generere konstruktioner del1PIF4, del2PIF4 og del3PIF4 blev det unikke sted i pAD-GAL4-polylinkeren slettet ved fill-in. Dette plasmid blev derefter anvendt som en skabelon til inverse PCR-reaktioner med primere PIF4del1, PIF4del2 eller PIF4del3 og pgadksba, hvor der blev indført et Hbai-restriktionssted i hver ende. PCR-produkter blev fordøjet enten med BamHI eller Hbai, religieret og omdannet til Escherichia coli for at opnå de forskellige konstruktioner. Disse plasmider blev omdannet til AH109-gærstammen og belagt på SD-4-plader for at analysere for interaktion. der blev bestemt en aktivitet på disse transformanters væskekulturer under anvendelse af onpg-substratet og standardprotokollbetingelserne.

konstruktioner svarende til kartoffel RGA M5-fragmentet for Arabidopsis della-generne RGA1 (At2g01570), GAI (AT1G14920), RGL1 (AT1G66350) og RGL3 (AT5G17490) blev genereret ved PCR-amplifikation med primersætene RGL1pGB-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r, rgapgb – f/Rgapgb-r og RGAPGB-f/Gaipgb-r (supplerende tabel 1). Disse fragmenter blev indsat i gær-pgbkt7-vektoren under anvendelse af restriktionerne BamHI/SalI for RGL1, SalI/PstI for RGL3 og BamHI/PstI for RGA1 og GAI.

Nedtrækningsanalyser

et DNA-fragment, der koder for Arabidopsis RGA-fuldlængdeproteinet, blev opnået ved PCR-amplifikation med primere Rgagt-f og Rgagt-r og klonet ind i BamHI-stedet for pseksvektoren for at opnå en fusion i rammen med GST-kodningsregionen. Vektoren blev transformeret til E. coli-stammen BL21 (DE3) pLysS (Stratagene) og kulturer af disse celler dyrket ved 37 liter C til en D600 = 0,8. Ekspression af GST-proteinerne blev induceret med 1 mM IPTG i yderligere 3 timer ved 30 liter C, og proteinekstraktion og binding til gluthathion-Sepharoseperler (Clontech) blev udført i henhold til den protokol, der blev leveret af producenten.

PIF4 -, PIF3-og carboksyterminale phyA-konstruktioner i pgbkt7-vektoren blev anvendt som skabeloner til in vitro-transkription / translation i nærværelse af 35S-methionin ved anvendelse af TNT-systemet (Promega). Plasmid-DNA (1 liter) blev anvendt i hver reaktion. Til nedtrækning blev 10 liter af translationsreaktionerne inkuberet i 30 minutter med RGA-GST-og GST-perlerne (1 liter protein bundet til perlerne) i PBS, 0,05% tergitol, 10% glycerol. Perler blev grundigt vasket, resuspenderet i 2 liter loading buffer og analyseret af SDS–PAGE for proteinbinding.

transiente ekspressionsanalyser

DNA-fragmenter, der koder for Arabidopsis-pif4-og RGA-proteinerne i fuld længde, og DELRGA-og del1RGA-sletningerne blev opnået ved PCR-amplifikation med primerpar PIF4yf og PIF4yr, Rgagtst-f og Rgagtst-r, LARRGA-f og RGAgast-r og del1RGA-f og Rgagt-r, og indsat i polilynker EcoRI-eller BamHI-stederne af pjit60-vektoren, under kontrol af 2-prisT 35S-promotoren. Et g-boks motivfragment rapporteret af gel-shift-assays for at være et målelement for PIF4 recognition34 blev smeltet sammen med GUS reporter-genet og brugt som en reporterkonstruktion. Vi var ikke i stand til at detektere PIF4-medieret stimulering af denne reporterkonstruktion, hvilket indikerer, at yderligere nukleotidsekvenser omkring CACGTG-motivet muligvis er nødvendige for effektiv aktivering. For at søge efter et promotorelement, der er egnet til at blive brugt i disse analyser, blev der udført foreløbige RNA-profileringseksperimenter af 35S-PIF4-og pif4-mutanter, hvilket identificerede LTP3 (at5g59320) som et stærkt opreguleret transkript i 35S-PIF4-kimplanter. Promotorregionen for dette gen blev amplificeret ved anvendelse af primere LT3p-f og LTP3p-r og indsat i EcoRI-og BamHI-stederne i pGUS-vektoren for at opnå ltp3-GUS-reporterkonstruktionen. Fusionen med 2 L. 35S-luciferase blev brugt som en intern kontrol. Arabidopsis celler blev spredt på filterpapir og inkuberet natten over på LT87 medium (4,4 g L-1 Murashige og Skoog salte + vitaminer, 0,5 g l-1 MES, 0,5 g l-1 NAA, 30 g l-1 saccharose, 8 g l-1 agar). To timer før bombardement blev filtre overført til LT87 medium med 200 mM mannitol for at inducere vakuol tilbagetrækning. DNA-udfældning og partikelbombardement blev udført ved hjælp af en heliumdrevet partikelaccelerator (PDS-1000; Bio-Rad) i henhold til producentens anvisninger. Cellerne blev forvandlet med 0,5 µg af den LTP3-GUS reporter plasmid + 0.5 µg af 2×35S-LUC intern standard, og enten 2 mg af pJIT60 tom vektor (LTP3), 1 µg af 2×35S-PIF4 effektor konstruere + 1 µg pJIT60 (PIF4), eller 1 mg hver 2×35S-PIF4 og 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA eller 2×35S-del1RGA effektor konstruktioner (PIF4 + RGA, PIF4 + ΔRGA, PIF4 + del1RGA). Filtre blev overført til friske lt87-plader (- GA) eller til LT87-plader + 50 liter GA3 (+GA) og inkuberet i 16 timer. celler blev ekstraheret i cellelysbufferen tilvejebragt i Luciferase Assay System kit (Promega) og ryddet ved centrifugering ved 12.000 g i 5 minutter. LUC-aktivitet blev bestemt i henhold til kit og GUS-aktivitet bestemt ved fluorometrisk analyse35. Ltp3-promotoraktivitet blev beregnet som forholdet mellem GUS og LUC-aktivitet i hver prøve. Fire replikaplader blev brugt til hver behandling.

RNA–ekstraktioner og revers transkriptase (RT)-PCR

til genekspressionsanalyser blev total RNA ekstraheret fra 4 dage gamle frøplanter ved hjælp af guanidin-HCl-metoden36 og efterfølgende behandlet med DNaseI (Roche) før rengøring gennem Chiagen RNeasy Minikolonner (Chiagen). RNA (1-larg) blev anvendt til cDNA-syntese i første streng ved anvendelse af cDNA-Arkivsættet med høj kapacitet (Applied Biosystems), og 1,0-larl af denne reaktion blev anvendt som skabelon til PCR-amplifikation. Primersæt AtLTP3-f/AtLTP3-r, Atekspan-f/Atekspan-r og atactin8-f/atactin8-r blev anvendt til amplifikation af transkriptionerne LTP3 (at5g59320), Kristian-ekspansin (at2g20750) og actin-8 (at1g49240).

bimolekylære fluorescens komplementering (BiFC) assays

fuld længde åbne læserammesekvenser for Arabidopsis PIF4-og RGA-proteinerne blev amplificeret med primere PIF4YFP-f/ PIF4YFP-r og rgayfp-f / RGAYFP-r, henholdsvis. PCR-produkterne blev klonet i pENTR / D-TOPO-vektoren (Invitrogen) og indsat ved LR-reaktion (Invitrogen) i de binære pBiFC-vektorer (F. Parcy) indeholdende amino-eller C-terminale fragmenter af eyfp fluorescerende protein (eYFPN og eYFPC). Alle otte mulige parvise kombinationer af disse konstruktioner blev omdannet til Agrobacterium tumefaciens og co-infiltreret i den abaksiale overflade af 2-3 uger gamle Nicothiana benthamiana planter som beskrevet37. P19-proteinet fra tomatbusket stuntvirus blev brugt til at undertrykke genhæmning. Agrobacterium-stammer indeholdende pBiFC-konstruktionerne og P19-lyddæmpningsplasmidet var i et D600-forhold på 0,7:0,7:1 til infiltration. Fluorescens blev visualiseret i epidermale cellelag af bladene efter 2 dages infiltration ved anvendelse af et Leica DMR fluorescerende mikroskop. Bladene blev inkuberet med 1 liter ml-1 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til farvning af kerner.

PIF4/RGA–GFP co-immunopræcipitationer

Co-immunopræcipitationsundersøgelser af RGA-og PIF4-proteinerne blev udført på 7 dage gamle RGA-GFP–RGA transgene frøplanter10 dyrket under hvidt lys. Frøplanter blev enten inkuberet i mørke eller overført til PAC – eller GA-holdigt medium og inkuberet i yderligere 12 timer før ekstraktion. Immunopræcipitering af GFP-RGA-proteinet blev udført ved 4 liter C i 6 timer ved anvendelse af et anti-GFP-antistof (bioteknologi) i en buffer indeholdende 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Triton H-100, pmsf (1 mM) og proteasehæmmere (Sigma). Protein G agarose (Sigma) blev anvendt til at udfælde immunoproteinkomplekserne. PIF4-detektion blev udført med et anti-PIF4-antistof.

Kromatinimmunudfældning og PCR-amplifikationer

Kromatinimmunudfældning assays blev udført som beskrevet tidligere29. PIF4-HA kimplanter20 blev dyrket på GM-medium i 6 dage under kontinuerligt rødt lys og blev derefter overført til plader indeholdende enten GA eller PAC og holdt natten over i mørke. Frøplanter (1,5-2 g) og 40 liter af anti-HA-Affinitetsmatricen (Roche) blev anvendt til kromatin-immunudfældning. Udfældet DNA blev opløst i 50 liter TE, og 0,5 liter blev anvendt til PCR-amplifikation under anvendelse af primerne anført i supplerende tabel 1. PCR-betingelserne var som følger: 94 C i 2 min, 35 cyklusser på 94 C i 15 s, 55 C i 30 s og 72 C i 30 s, efterfulgt af 72 C i 7 min. Sonikeret input-DNA (0,3%) blev anvendt til en kvantitativ kontrol. Vestlige blot-analyser blev udført for at kvantificere mængden af genvundet PIF4-protein efter kromatin-immunudfældning. Blots blev immunodetekteret med et anti-HA-antistof med høj affinitet (Roche).

mikroskopi

proteinstabilitetsanalyser blev udført under anvendelse af Radiance 2100 (Bio-Rad) Laserscanningssystem koblet til et ess Aksiovert 200 mikroskop. Til GFP-og klorofylekspression blev der anvendt en argonionlaser ved 488 nm bølgelængde og en rød diode ved 637 nm henholdsvis. Kombinationen af filtre, der blev brugt, var: 560 dclpr-strålesplitter og 515/30-emissionsfilter til GFP og 660LP til klorofyldetektion. Billederne blev sekventielt taget ved hjælp af LaserSharp v5.0-programmet (Bio-Rad) og fusioneret ved hjælp af Laserpiks v. 4-billedprogrammet (Bio-Rad).

Gel-shift-assay

oligonukleotiderne pLTP-VTF/r og pLTP-MUTf / r blev brugt til at generere LTP3-prober og specifikke konkurrenter anvendt i EMSA-assays. Oligonukleotider blev udglødet i 5 liter m restriktionsbuffer og slutmærket ved udfyldning med Klenov. For proteinekstrakter, N. benthamiana-blade blev infiltreret med Agrobacterium-stammerne til 35S–PIF4-HA (PIF4) og 35S–RGA-GFP (RGA) konstruktioner eller med en 1:1 blanding (PIF4 + RGA) af disse stammer og med p19-konstruktionen som beskrevet ovenfor. Bladekstrakter blev opnået ved homogenisering i høj saltbuffer (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0,5% nonidet P-40, 1 mM DTT, + proteasehæmmer), clearing ved centrifugering og efterfølgende dialyse mod 1 liter BB (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,1 M KCl, 1 mM EDTA, 0,05% nonidet P-40, 0,5 mM DTT, 10% glycerol). Tilstedeværelsen af ækvivalente mængder PIF4-og RGA-proteiner i ekstrakterne blev vurderet ved vestlig blot-detektion med anti-HA (Roche) og anti-GFP (Santa Cruce) antistoffer. Stigende mængder af disse ekstrakter (5,0, 10,0, 15,0 liter) blev anvendt til EMSA-reaktionen. Ekstrakter blev inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur med den mærkede sonde og 100 ng poly (dI-dIC) i 20 liter 1 liter BB og adskilt med 6% side i 0,5 liter TBE. Et 100 gange overskud af vildtype (vægt) og mutant (MUT) udglødede oligonukleotider blev anvendt til specifik konkurrence.