het celmembraan: een zegen en een vloek

het celmembraan omhult een cytosol vol organellen, instabiele moleculen, enzymen en genetische informatie – alles wat nodig is voor metabolisme en replicatie. Maar het houdt ook alles buiten dat het delicate, dynamische evenwicht van het leven zou destabiliseren.

hoewel het membraan essentieel is voor de cel, is het vaak ook een ongemak voor biologische ingenieurs. Het voorbereiden van cellen om vreemd DNA te accepteren, het krijgen van DNA over het celmembraan, en het integreren van de nieuwe instructie die in het genoom van het organisme wordt geplaatst, zijn tijdrovende en moeizame taken. Onderzoekers zijn steeds meer geïnteresseerd in het uitbreiden van ons repertoire van gastheerorganismen naar meer exotische soorten, die geen gestroomlijnde transformatieprotocollen hebben.

De meeste processen van eiwitproductie en metabolisme hebben geen fundamentele eis voor inkapseling. Als er geen cel vereist is voor uw toepassing, waarom dan de moeite?

Cell-free expression systems, die expressiemachines uit de cel naar een reageerbuis halen, zijn een oplossing voor dit schijnbaar onoplosbare probleem.

deze systemen kunnen worden gebruikt om fundamentele biologische vragen te beantwoorden, zoals het bestuderen van expressie in”protocellen”. Zij zijn even nuttig voor snel prototyping genetische en metabolische systemen: bijvoorbeeld, snel het optimaliseren van metabolische wegen om producttiters te maximaliseren. Ze kunnen zelfs worden gebruikt als on-demand biosensing en biomanufacturing platforms. Als u meer wilt weten over wat celvrije systemen zijn, waarom ze nuttig zijn en hoe u kunt beginnen, lees dan verder!

Putting It All (Back) Together

welke componenten zijn vereist voor vertaling buiten de cel? Alle CEL-vrije eiwituitdruksystemen bevatten ten minste deze drie delen.

1. translationele machines. Dit omvat ribosomen en tRNAs, evenals initiatie, verlenging, en versiefactoren die voor vertaling worden vereist, en aminoacyltrna synthetases om tRNAs met hun verwante aminozuren te laden.
2. energie. GTP en ATP aan macht Vertalende verlenging en tRNA het laden. De suikers, phosphorylated glycolytic tussenpersonen, of andere phosphorylated samenstellingen worden gebruikt als energiebronnen om ervoor te zorgen dat de hoge concentraties van nucleotidetrifosfaten in de loop van de reactie worden gehandhaafd, die tot verscheidene uren kan duren.
3. een messenger-RNA dat moet worden vertaald. Dit kan buiten de cel-vrije reactie via in vitro T7-transcriptie, of binnen de cel-vrije reactie worden veroorzaakt door een malplaatje van DNA en NTPs toe te voegen en of de polymerase van T7 RNA of een inheemse polymerase huidig in het cellysaat te gebruiken.

celvrije systemen recapituleren vertaling, en vaak transcriptie en Centraal metabolisme, buiten de cel. Nochtans, is het belangrijk om de drie belangrijkste verschillen tussen cel-vrije en cel-gebaseerde systemen te onthouden.

1. Compartmentalisatie en ruimtelijke organisatie. De systemen van de cel-vrije uitdrukking missen een barrière tussen een biochemisch reactiesysteem en het omringende milieu, evenals barrières tussen functioneel verschillende compartimenten. Alle biochemische reacties in celvrije systemen vinden plaats in een homogene omgeving.
2. verdunning. Cel-vrije systemen zijn een orde van grootte meer verdund, in termen van hun macromoleculaire inhoud, dan cellen. Niet alleen zijn de concentraties van genuitdrukkingsmachines lager, maar de mate van macromoleculaire verdringing is ook lager, wat biochemische reactiesnelheden en evenwichten kan beïnvloeden.
3. een genoom. Chromosomaal DNA wordt verteerd of gezuiverd uit celvrije systemen. Omdat celvrije systemen geen genoom hebben om gedrag te programmeren, zijn de enige instructies die de reactie zal uitvoeren die welke jij geeft.

waarom zou u celvrij moeten worden?

omdat celvrije systemen geen celmembraan hebben, hebben ze verschillende voordelen ten opzichte van cellulaire expressie.

• sneller-er zijn geen lange dagen van transformatie en celgroei in een celvrij experiment. Een typische celvrije reactie duurt uren, geen dagen. Het verschil in snelheid tussen in-cel en cel-vrij wordt nog groter bij het werken in organismen met complexe of niet-geoptimaliseerde transformatieprotocollen, of langere kweektijden. Cel-vrij kan een grote manier zijn om genetische delen voor nieuwe gastheerorganismen, genetische kringen, en zelfs volledige metabolische wegen te prototype zonder enige genetische informatie in een hardnekkige gastheer te moeten integreren.
• biochemisch flexibel-de intracellulaire concentraties van kleine moleculen, metabolieten en enzymen zijn allemaal sterk gereguleerd. Het kan moeilijk zijn om hun concentraties af te stemmen op optimale opbrengst of genetische systeemprestaties, of zelfs om te controleren wat die concentraties zijn. Je hebt veel meer controle over de biomoleculaire samenstelling in een celvrij systeem. U kunt nieuwe cosolutes toevoegen, of zelfs lipide micellen gebruiken om de machines van de genuitdrukking opnieuw in te kapselen, om te onderzoeken hoe deze wijzigingen genuitdrukking beïnvloeden.
• Open-de openheid van celvrije systemen is nuttig bij het wijzigen van systeemchemie, maar is vooral nuttig voor toepassingen die communicatie met een externe omgeving vereisen, zoals detectie. Het is momenteel moeilijk om cellulaire detectieplatforms te ontwikkelen die reageren op moleculen die het celmembraan niet kunnen passeren, zoals nucleïnezuren. In een celvrij sensorsysteem bestaat die barrière niet, waardoor moleculen zoals viraal RNA eenvoudig kunnen worden gedetecteerd.

… en waarom niet?

de verschillen tussen de cellulaire en celvrije omgevingen kunnen leiden tot verschillen in de experimentele benadering tussen de twee expressieplatforms.

• niet (nog) high-throughput – High-throughput flow-cytometrie en op NGS gebaseerde genetische karakterisatieexperimenten zijn goed ingeburgerd voor cellulaire platforms, die gemakkelijk genetische instructies samen met hun output verpakken. Tienduizenden genetische varianten kunnen voor functie worden gescreend gebruikend cytometry stroom en / of NGS. Het aantal varianten dat in een traditioneel eencellig-vrij experiment kan worden gescreend is verscheidene ordes van grootte minder dan in analyses van hoog-productie in vivo.
• in vivo is niet (noodzakelijk) gelijk aan in vitro – wees ervan bewust dat celvrije resultaten niet noodzakelijk direct in kaart brengen met de prestaties van het in vivo systeem, of zelfs met andere celvrije systemen. Door verschillen in de concentraties van systeemcomponenten is de celvrije output tussen systemen meestal vergelijkbaar, maar niet identiek.
• Het is niet economisch voor grootschalige eiwitpreparaten. Terwijl opbrengsten tot 2.3 G / L eiwit zijn gemeld voor cel-vrije systemen, die het concurrerend met cel-gebaseerde uitdrukking maakt, zou u een cultuurvolume van ~1000x het volume van het cel-vrije reactievolume nodig hebben. Dit betekent dat het geen economisch systeem voor het creëren van grote hoeveelheden recombinante proteã ne is.

een systeem Kiezen

prokaryotisch of eukaryotisch, zelfgebreid of in de handel, ruw extract gebaseerd of gereconstitueerd? De keuze van het systeem is afhankelijk van uw specifieke behoeften en beperkingen.

welke soort? Tenzij u prototyping genetische delen in, of de expressie machinerie van een specifiek organisme nodig hebt, een E. coli-gebaseerde cel-vrije systeem moet uw eerste keuze. De oudste en meest gebruikte familie van cel-vrije systemen, E. coli systemen zijn geoptimaliseerd voor betrouwbare genexpressie en high-yield eiwitproductie.

commercieel gaan? Het produceren van uw eigen celextract vereist apparatuur en expertise om grote hoeveelheden cellen te cultiveren en te lyseren. Een handvol leveranciers verkopen hun eigen celvrije systemen, afgeleid van modelorganismen en werkpaarden cellijnen, maar ze zijn niet goedkoop. Verwacht te betalen ten minste $ 7 per reactie, versus cent per reactie voor een zelf gebrouwen systeem.

ruw of gereconstitueerd? De meeste cel-vrije uitdrukkingssystemen worden gemaakt met ruw cellysaat, dat veel meer enzymen bevat dan de machines van de kerngenuitdrukking. Dit kan een goede zaak zijn—moderne Op E. coli gebaseerde systemen op basis van lysaat bevatten chaperonen en het grootste deel van het centrale metabolisme, wat de eiwitopbrengst en producttiters verhoogt. Als u de activiteit van een bepaald enzym volledig moet verwijderen, kan een gereconstitueerd systeem dat bekend staat als PURE (eiwitsynthese met behulp van recombinante elementen) de juiste optie zijn. In PURE, wordt elk eiwit dat Voor genuitdrukking wordt vereist gezuiverd en aan de reactie toegevoegd, die u maximumcontrole over de reactiesamenstelling geven. Gestroomlijnde protocollen zijn onlangs gepubliceerd om beide soorten systemen economisch te produceren, maar u kunt ook een kit kopen.

om het samen te vatten

celvrije systemen zijn niet-ingekapselde biosynthetische systemen die nuttig zijn voor de snelle ontwikkeling van genetische systemen en de synthese van bioproducten. Als je de ontwikkeling van een nieuwe biosynthetische route wilt versnellen, een biochemisch proces in een eenvoudiger systeem wilt onderzoeken, of een eenvoudigere manier wilt gebruiken om de expressiemachines van een genetisch onhandelbare gastheer te gebruiken, dan is celvrij gaan misschien goed voor je.

verder lezen

Dudley QM, Karim als & Jewett MC. Cel-vrije metabolische techniek: Biomanufacturing voorbij de cel. Biotechnol J. (2015) 10(1): 69-82. DOI: 10.1002 / biot.201400330

Garamella J, Marshall R, Rustad m & Noireaux V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS synthetische biologie (2016) 5(4):344-355. DOI: 10.1021 / acssynbio.5b00296

Thermo Fisher Scientific. Overzicht van eiwitexpressie. Bibliotheek Van Eiwitbiologie.

Shimizu Y, Kanamori T, Ueda T. eiwitsynthese door pure translation systems. Methode. (2005) 36(3):299-304. DOI: 10.1016 / j. ymeth.2005.04.006

Shoba. Een introductie tot celvrije eiwitsynthese. Bitesize Bio. 2 maart 2009.

Shoab. Opgelost: lage opbrengsten in celvrije eiwitsynthese. Bitesize Bio. 21 April 2009.