en fullstendig forståelse av FUNKSJONEN TIL RNA-molekyler krever kunnskap om deres høyere orden strukturer (2D og 3D) samt egenskapene til deres primære sekvens. RNA-struktur er viktig for mange funksjoner, inkludert regulering av transkripsjon og oversettelse, katalyse, transport av proteiner over membraner og regulering AV RNA-virus. Forståelsen av disse funksjonene er viktig for grunnleggende biologi, samt for utvikling av legemidler som kan gripe inn i tilfeller der patologisk funksjonalitet av disse molekylene oppstår.Vår gruppe gjør forskning og utvikling av metoder for å forbedre rna folding og analyse teknikker for å bidra til ytterligere vår forståelse av de funksjonelle egenskapene til disse molekylene. I tillegg fokuserer vi på det fremvoksende feltet RNA nanobiologi. RNA representerer et relativt nytt molekylært materiale for utvikling av biologisk orienterte nano-enheter. Det er et interessant materiale på grunn av dets naturlige funksjonaliteter, dets evne til å kaste seg inn i komplekse strukturer og selvmontering. Vi har utviklet beregnings-og eksperimentelle metoder som tillater design AV RNA-baserte nanopartikler som potensielt har en rekke bruksområder. Dermed dekker vår forskning på RNA fem svært relaterte og integrerte forskningsområder:

1. Forskning i algoritmer for rna sekundær struktur prediksjon og analyse;
2. rna biologi og dens forhold til sekvens og sekundær struktur folding egenskaper;Forskning I algoritmer FOR RNA 3D struktur prediksjon og analyse og deres anvendelse PÅ rna biologi; Forskning I algoritmer for design og analyse AV rna nanopartikler; Eksperimentell design, syntese og levering AV RNA-baserte nanopartikler.

det som læres på ett område, brukes på de andre områdene, og øker vår forståelse AV RNA-struktur, funksjon OG rna nanobiologi og selvmontering.Parallelle Beregningsbiologi OG RNA Struktur Revolusjonerende endringer i beregnings paradigmer er nødvendig for å opprettholde den nødvendige beregnings makt for å løse problemer i molekylærbiologi. Metoder basert på sekvensielle datamaskinarkitekturer kunne ikke forventes å kontinuerlig holde tritt med de nødvendige beregningshastigheter. For å imøtekomme de høye hastighetene som er nødvendige, er svært parallelle beregningsteknikker nå ansatt. Vår gruppe var en av pionerene innen beregningsbiologi og bruk av parallelle høyytelsesdataarkitekturer for dette arbeidet.

Beregningsteknikker FOR Rna Sekundær Struktur Prediksjon og Analyse
Vi var de første til å utvikle EN RNA folding teknikk som bruker begreper fra genetiske algoritmer. Vår algoritme, MPGAfold, ble opprinnelig utviklet for å kjøre på en massivt parallell SIMD supercomputer, En MasPar MP-2 med 16384 prosessorer. Denne algoritmen ble endret og kjører nå på parallelle Linux-klynger med høy ytelse. Eksepsjonelle skaleringsegenskaper oppnås med evnen til å kjøre algoritmen med hundretusener av befolkningselementer. Rna pseudoknot prediksjon er en del av den genetiske algoritmen, noe som resulterer i sin evne til å forutsi tertiære interaksjoner. Andre funksjoner inkluderer simulering av co-transcriptional folding, evnen til å innlemme ulike energiregler, og tvungen hemming og innebygging av ønskede spiralformede stammer. I tillegg STRUCTURELAB, vår heterogene bioinformatiske rna analyse arbeidsbenk, kan brukes sammen Med MPGAfold OG RNA2D3D å produsere spådd 3d atom koordinater AV RNA strukturer sammen med visualisering av disse strukturene. Vi utviklet også en ny interaktiv visualiseringsmetode som er en del AV STRUCTURELAB. Denne teknikken muliggjør sammenligning OG analyse av multiple sekvens RNA folder fra et fylogenetisk synspunkt, og dermed tillater forbedring av spådde strukturelle resultater på tvers av en familie av sekvenser.Vi utviklet KNetFold, en roman og kraftig algoritme FOR RNA struktur prediksjon fra sekvens justeringer. Algoritmen bruker en unik hierarkisk klassifisering nettverk basert på gjensidig informasjon, termodynamikk og Watson-Crick base-pairedness å forutsi strukturer. I tillegg har Vi utviklet En nettbasert applikasjon, CorreLogo, som bruker gjensidig informasjon avledet FRA rna-sekvensjusteringer for å bestemme kovariasjoner mellom baseparerte posisjoner. Algoritmen inneholder et unikt feilmål og viser resultater I 3D.Vi utviklet, CyloFold, en unik algoritme for å forutsi, fra en enkelt sekvens, rna sekundære strukturer som kan inkludere pseudoknoter. Denne algoritmen benytter en ny teknikk som tilnærmer potensialet FOR 3D-steriske sammenstøt i de forutsagte strukturer, og filtrerer dermed ut disse strukturene fra vurdering. Algoritmen har vist seg å ha høy nøyaktighet i forhold til andre algoritmer av sin type.Vi utviklet webprogramvare basert På En bayesiansk statistisk tilnærming som estimerer nøyaktigheten av baseparformasjon fra data avledet FRA FORM (Selektiv 2′ – Hydroksylacylering analysert ved Primer Extension) eksperimenter. De statistiske / probabilistiske resultatene ble avledet ved å analysere kjente RNA 3D-strukturer som har ulike typer kjente baseinteraksjoner, og korrelere dem med FORMVERDIER. Det ble vist at lav FORM verdier korrelerer godt Med Watson-Crick base sammenkobling og stabling interaksjoner mens høy FORM verdier indikerer enkelt strandet regioner. Forbedringer kan sees hvis en 2 eller 3 base kontekst ble også tatt i betraktning. Vi viste også at andre typer kjente interaksjoner ikke korrelerte godt. Denne typen informasjon er nyttig i slutt å bestemme den sekundære strukturen Av Rna.

Beregningsstudier AV Rna-Foldeveier
RNA-foldeveier viser seg å være ganske viktige i bestemmelsen AV RNA-funksjonen. Studier indikerer at RNA kan gå inn i mellomliggende konformasjonstilstander som er nøkkelen til funksjonaliteten. Disse tilstandene kan ha en betydelig innvirkning på genuttrykk. Det er kjent at de biologisk funksjonelle tilstandene TIL RNA-molekyler kanskje ikke samsvarer med deres minimale energitilstand, at kinetiske barrierer kan eksistere som fanger molekylet i et lokalt minimum, at folding ofte oppstår under transkripsjon, og tilfeller eksisterer der et molekyl vil overgå mellom en eller flere funksjonelle konformasjoner før de når sin opprinnelige tilstand. Dermed er metoder for å simulere foldeveiene til ET RNA-molekyl, inkludert ko-transkripsjonell folding, og lokalisere signifikante mellomliggende tilstander viktige for prediksjonen AV RNA-struktur og dens tilhørende funksjon. Flere biologiske rna-foldeveier har blitt studert ved Hjelp Av MPGAfold og STRUCTURELAB. Eksempler er potet spindel tuber viroid, vert-drap mekanisme Av Escherichia coli plasmid R1, hepatitt delta virus, HIV, OG dengue virus. Disse beregningsresultatene er i samsvar med de som er avledet fra biologiske eksperimenter. I tillegg har nye strukturelle interaksjoner og viktige funksjonelle mellomliggende og innfødte stater blitt spådd. Disse har ført til ytterligere vellykkede bekreftende eksperimenter.Vi har også utviklet Programmer CovaRna og CovStat for å utforske langtrekkende samvarierende RNA interaksjonsnettverk ved hjelp av hele genomet justeringer. Denne nye metoden, som ble brukt På Drosophila genomer, blir for tiden brukt på andre genomer. En parallell versjon av programmet ble utviklet for å øke hastigheten på behandlingen, og algoritmene er også avhengige av raske indekseringsordninger og konservative statistiske metoder for å bestemme svært signifikante interaksjoner. Metoden har funnet interessante interaksjoner som er relatert til endogene siRNAs, gentransport og gener relatert til morfogenese.Noen strukturelle elementer AV RNA-molekyler har blitt studert ved hjelp av molekylær mekanikk og molekylær dynamikk simuleringer. De undersøkte strukturene inkluderer EN RNA tetraloop hvor temperaturavhengig denaturering av tetraloopen og den etterfølgende refolding til den opprinnelige krystallstrukturen ble utført. En treveis veikryss fra kjernen sentrale domenet AV 30s ribosomal subenhet Fra Thermus thermophilus ble utforsket. Det har blitt eksperimentelt bestemt at de intermolekylære interaksjonene mellom treveisforbindelsen og s15 ribosomalproteinet initierer prosessen med montering AV 30s ribosomal underenhet. Ved å bruke molekylær dynamikk simuleringer vi fått innsikt i konformasjons overganger av krysset forbundet Med bindingen Av S15. Vi bestemte oss for å bruke molekylære dynamikksimuleringer, de strukturelle effektene av å utnytte nye typer modifiserte rna-nukleotider som inneholder karbosykliske sukkerarter som er begrenset til nord-eller sørkonformasjoner (C2′ eller c3′ exo). I tillegg viste vi ved hjelp av molekylær dynamikk simuleringer, hvordan ioner og flankerende baser spiller en svært viktig rolle i humant immunsviktvirus (HIV) kyssing loop monomer konformasjoner. Disse resultatene korrelerer godt og kan forklare i detalj, eksperimentelle studier som indikerer betydningen av ioner FOR HIV – 1 dimerization.

Vi har også undersøkt pseudoknot-domenet til telomerase. Molekylær modellering og molekylær dynamikk av pseudoknot-domenet, inkludert hårnålsløyfen, ble utført. Resultatene indikerte hvordan hårnålsløyfedynamikken påvirket åpning og lukking av de ikke-kanoniske U-u-baseparene som finnes i stammen. Åpningen foreslo kjernepunkter for dannelsen av pseudoknoten. Vi har også undersøkt effekten av dyskeratose congenita (DKC) mutasjoner i sløyfen og hvordan de reduserte tilbøyelighet til åpning av stammen ved å danne et relativt stabilt hydrogenbindingsnettverk i hårnålsløyfen. Vi modellerte pseudoknot selv ved hjelp AV VÅR RNA2D3D-programvare kombinert med fylogenetisk analyse. Vi studerte den dynamiske virkningen AV dkc-mutasjonene på pseudoknot med det resultat at pseudoknot ble ustabil mens hårnålformen ble stabilere.

vi oppdaget OG belyste 3d-strukturer av nye typer translasjonsforsterkere som finnes i 3 ‘ UTRs av Ropekrinkle-Viruset (det første av sitt slag funnet) og Pea enation Mosaic-Viruset. Oppdagelsen av disse strukturelle elementene har avdekket nye mekanismer for translasjonsforbedring i eukaryote plantevirus som kan ha bredere implikasjoner for å forstå translasjonsmekanismer generelt. Dette ble oppnådd med kombinert bruk Av MPGAfold, VÅR 3d molekylær modellering programvare RNA2D3D, og nære interaksjoner med våre eksperimentelle samarbeidspartnere. Vi har også modellert en roman pseudoknot funnet I CCR5 mRNA. Denne pseudoknoten er involvert i frameshifting og ser ut til å være stabilisert av en microRNA, en ny funksjon for en microRNA.i tillegg har vi benyttet metoder basert på elastisk nettverksinterpolering for å redusere beregningskostnadene knyttet TIL RNA 3D-dynamikk. Tredimensjonale dynamikk baner kan bestemmes ved hjelp av en redusert atom representasjon og gitt konformasjonstilstander. Beregningstiden kan reduseres fra uker til timer ved hjelp av denne tilnærmingen.
Computational Rna Nanobiology
rna nanobiology representerer en ny modalitet for utvikling av nanodevices som har potensial for bruk i en rekke områder, inkludert therapeutics. Basert på vår erfaring som skissert ovenfor, utviklet vi flere beregnings-og eksperimentelle teknikker (se nedenfor) som gir et middel til å bestemme et sett med nukleotidsekvenser som kan samles inn i ønskede nanokomplekser. Et av disse verktøyene er en relasjonsdatabase kalt RNAJunction. Databasen inneholder struktur og sekvens informasjon for kjente rna spiralformede veikryss og kyssing loop interaksjoner. Disse motivene kan søkes etter på en rekke måter, og gir en kilde TIL rna nano byggesteiner. Et annet beregningsverktøy, NanoTiler, tillater en bruker å konstruere spesifiserte RNA-baserte nanoskalaformer. NanoTiler gir EN 3d grafisk visning av objektene blir utformet og gir midler til å arbeide interaktivt eller med dataskript på designprosessen, selv om de nøyaktige RNA-sekvenser ennå ikke er spesifisert, og en all-atommodell er ikke tilgjengelig. NanoTiler kan bruke 3d-motivene som finnes i rnajunction-databasen med de som er avledet fra spesifiserte rna sekundære strukturmønstre for å bygge en definert rna-nanoform. Også et kombinatorisk søk kan brukes til å oppregne strukturer som normalt ikke ville bli vurdert.Et annet nettbasert programvareverktøy for rna nanostrukturdesign er NanoFolder, som er Et Av de få programvareverktøyene som er i stand til å forutsi strukturen og sekvensattributtene til multi-strandede RNA-konstruksjoner. Med denne programvaren er det mulig å spesifisere de ønskede sekundære strukturmotivene og få programvaren til å forutsi settet av sekvenser som genererer disse ønskede motivene med de riktige intra – og inter-strandfoldegenskapene.Eksperimentell Rna Nanobiologi Basert På de ovenfor beskrevne beregningsmessige tilnærminger TIL rna nanodesign har vi vist evne til eksperimentelt selv montere og funksjonalisere flere rna-baserte nanopartikler. Dette ble oppnådd med nært samspill mellom eksperimentelle og beregningsmessige tilnærminger som førte til forbedringer av begge settene av metoder. Eksempler er selvmontering av 6 og 10 strandede kuber; selvmontering av sekskantede ringer av forskjellige størrelser og doble ringer ved hjelp AV ET RNA-motiv ekstrahert fra naturen; modifikasjonen av sekvenser i motivet for å forbedre utbyttet samtidig som man opprettholder passende geometrier; og selvmontering av trekantede strukturer. Vi har også utviklet teknikker som definerer selvmonteringsprotokoller og som gir mulighet for co-transkripsjonell montering av konstruksjoner som også kan inkludere modifiserte baser for å øke den kjemiske stabiliteten til disse nanopartikler. I tillegg har vi funksjonalisert disse partiklene med opptil seks forskjellige sirna for å muliggjøre kontrollert støkiometri og gendeaktivering, og viste at disse partiklene faktisk slår de utpekte gener når de transfiseres til forskjellige cellelinjer.Vi har også utforsket et annet paradigme basert på BRUK AV rna / DNA hybrid nanokonstruksjoner som inneholder splittede funksjoner. Dette tillater for eksempel splitting av En Diceable siRNA i TO DNA / RNA hybridkomponenter MED DNA-holds, som når transfisert til celler reassembles inn I EN DNA duplex og En Diceable siRNA. Denne hybrid tilnærming har blitt innlemmet i våre sekskantede nanoringer og nanocubes. Nytten av denne tilnærmingen tillater blant annet kontrollert aktivering av funksjonalitet, inkorporering av molekylære beacons på DNA-strengene uten intefering MED RNA-funksjonalitet og motstand mot nuklease-nedbrytning. Denne tilnærmingen har blitt forsøkt vellykket i cellekulturer og xenograf tumor musemodeller.
Mange av beregningssystemene er tilpasset andre miljøer i og utenfor vårt laboratorium OG NIH og er tilgjengelige via vårt nettsted på http://www-CCRNP.ncifcrf.gov/~bshapiro.