Cellemembranen: En Velsignelse og En Forbannelse

cellemembranen omslutter en cytosol som er full av organeller, ustabile molekyler, enzymer og genetisk informasjon – alt som kreves for metabolisme og replikasjon. Men det holder også ut alt som vil destabilisere den delikate, dynamiske likevekten i livet.mens membranen er viktig for cellen, er det ofte også en ulempe for biologiske ingeniører. Å forberede celler til å akseptere fremmed DNA, få DNA over cellemembranen og integrere det nye instruksjonssettet i organismens genom er tidkrevende og arbeidskrevende oppgaver. Og forskere er stadig mer interessert i å utvide vårt repertoar av vertsorganismer til mer eksotiske arter, som mangler strømlinjeformede transformasjonsprotokoller.De fleste prosessene for proteinproduksjon og metabolisme har ingen grunnleggende krav til innkapsling. Hvis det ikke kreves noen celle for søknaden din, hvorfor bry deg?Cellefrie uttrykkssystemer, som tar uttrykksmaskiner ut av cellen og inn i et reagensrør, er en løsning på dette tilsynelatende ugjennomtrengelige problemet.

disse systemene kan brukes til å svare på grunnleggende biologiske spørsmål, for eksempel å studere uttrykk i «protocells». De er like nyttige for raskt prototyping av genetiske og metabolske systemer: for eksempel raskt optimalisering av metabolske veier for å maksimere produkttitere. De kan også brukes som on-demand biosensing og biomanufacturing plattformer. Hvis du er interessert i å lære mer om hva cellefrie systemer er, hvorfor de er nyttige, og hvordan du kan komme i gang, les videre!

Sette Alt (Tilbake) sammen

hvilke komponenter kreves for oversettelse å skje utenfor cellen? Alle cellefrie protein expression-systemer inneholder minst disse tre delene.

1. Translasjonell maskineri. Dette inkluderer ribosomer og trna, så vel som initierings -, forlengelses-og frigjøringsfaktorer som kreves for oversettelse, og aminoacyl – trna-syntetaser for å lade trna med deres beslektede aminosyrer.
2. Energi. GTP og ATP for å drive translasjonell forlengelse og tRNA-lading. Sukker, fosforylerte glykolytiske mellomprodukter eller andre fosforylerte forbindelser brukes som energikilder for å sikre at høye konsentrasjoner av nukleotidtrifosfater opprettholdes i løpet av reaksjonen, noe som kan vare opptil flere timer.
3. et budbringer-RNA som skal oversettes. Dette kan produseres utenfor den cellefrie reaksjonen via in vitro t7-transkripsjon, eller i den cellefrie reaksjonen ved å legge TIL EN DNA-mal og NTPs og bruke Enten T7 RNA-polymerase eller en innfødt polymerase tilstede i cellelysatet.

Cellefrie systemer rekapitulere oversettelse, og ofte transkripsjon og sentral metabolisme, utenfor cellen. Det er imidlertid viktig å huske de tre viktigste forskjellene mellom cellefrie og cellebaserte systemer.

1. Kompartmentalisering og romlig organisering. Cellefrie uttrykkssystemer mangler en barriere mellom et biokjemisk reaksjonssystem og omgivelsene, samt barrierer mellom funksjonelt forskjellige rom. Alle biokjemiske reaksjoner i cellefrie systemer foregår i et homogent miljø.
2. Fortynning. Cellefrie systemer er en størrelsesorden mer fortynnet, når det gjelder deres makromolekylære innhold, enn celler. Ikke bare er konsentrasjonene av genekspresjonsmaskiner lavere, men graden av makromolekylær trengsel er også lavere, noe som kan påvirke biokjemiske reaksjonshastigheter og likevekt.
3. et genom. Kromosomalt DNA fordøyes eller renses ut av cellefrie systemer. Fordi cellefrie systemer mangler et genom for å programmere atferd, er de eneste instruksjonene som reaksjonen vil utføre de som du gir.

Hvorfor Skal Du Gå Cellefri?

fordi cellefrie systemer mangler en cellemembran, har de flere fordeler over cellulær uttrykk.

• Raskere – det er ingen lange dager med transformasjon og cellevekst i et cellefritt eksperiment. En typisk cellefri reaksjon tar timer å fullføre, ikke dager. Forskjellen i hastighet mellom in-celle og cellefri blir enda større når man arbeider i organismer med komplekse eller uoptimiserte transformasjonsprotokoller, eller lengre kulturtider. Cellefri kan være en fin måte å prototype genetiske deler for nye vertsorganismer, genetiske kretser og til og med hele metabolske veier uten å måtte integrere noen genetisk informasjon i en ugjennomtrengelig vert.Biokjemisk fleksibel-de intracellulære konsentrasjonene av små molekyler, metabolitter og enzymer er alle sterkt regulert. Det kan være vanskelig å justere konsentrasjonene for optimal utbytte eller genetisk systemytelse, eller til og med å overvåke hva disse konsentrasjonene er. Du har mye mer kontroll over den biomolekylære sammensetningen i et cellefritt system. Du kan legge til nye cosolutes, eller til og med bruke lipidmikeller til å re-innkapsle genuttrykk maskiner, for å undersøke hvordan disse modifikasjonene påvirker genuttrykk.Open-åpenheten til cellefrie systemer er nyttig når du endrer systemkjemi, men det er spesielt nyttig for applikasjoner som krever kommunikasjon med et utemiljø, for eksempel sensing. Det er for tiden vanskelig å konstruere cellulære sensingplattformer som reagerer på molekyler som ikke kan krysse cellemembranen, som nukleinsyrer. I et cellefritt sensorsystem eksisterer ikke denne barrieren, noe som muliggjør enkel deteksjon av molekyler som viralt RNA.

… Og Hvorfor Skulle Du ikke?

forskjellene mellom de cellulære og cellefrie miljøene kan føre til forskjeller i eksperimentell tilnærming mellom de to uttrykksplattformene.Ikke (ennå) high-throughput-High-throughput flow-cytometry og NGS-baserte genetiske karakterisering eksperimenter er veletablert for cellulære plattformer, som praktisk pakke genetiske instruksjoner sammen med deres utgang. Titusenvis av genetiske varianter kan screenes for funksjon ved hjelp av flowcytometri og / eller NGS. Antall varianter som kan screenes i et tradisjonelt enkeltcellefritt eksperiment, er flere størrelsesordener mindre enn i høy gjennomstrømning in vivo-analyser.

in vivo er ikke (nødvendigvis) lik in vitro-Vær oppmerksom på at cellefrie resultater ikke nødvendigvis direkte kartlegger til in vivo systemytelse, eller til og med til andre cellefrie systemer. På grunn av forskjeller i konsentrasjonene av systemkomponenter, har cellefri utgang mellom systemer en tendens til å være sammenlignbar, men ikke identisk.

Det er ikke økonomisk for store proteinpreparater. Mens utbytter på opptil 2.3 g / L protein er rapportert for cellefrie systemer, noe som gjør det konkurransedyktig med cellebasert uttrykk, du vil trenge et kulturvolum på ~1000x volumet av det cellefrie reaksjonsvolumet. Dette betyr at det ikke er et økonomisk system for å skape store mengder rekombinant protein.

Velge Et System

Prokaryotisk eller eukaryotisk, homebrewed eller kommersiell, rå ekstrakt-basert eller rekonstituert? Valg av system avhenger av dine spesifikke behov og begrensninger.

hvilke arter? Med mindre du prototyper genetiske deler i, eller trenger uttrykksmaskineriet til en bestemt organisme, bør Et e. coli-basert cellefritt system være ditt førstevalg. Den eldste og mest brukte familien av cellefrie systemer, E. coli-systemer, er optimalisert for pålitelig genuttrykk og høyutbyttende proteinproduksjon.

kommer kommersiell? Produsere din egen celle ekstrakt krever utstyr og kompetanse til kultur og lyse store mengder celler. En håndfull leverandører selger sine egne cellefrie systemer, avledet fra modellorganismer og arbeidshestcellelinjer, men de er ikke billige. Forvent å betale minst $ 7 per reaksjon, mot cent per reaksjon for et homebrewed system.

Rå Eller rekonstituert? De fleste cellefrie ekspresjonssystemer er laget med råcellelysat, som inneholder mange flere enzymer enn kjerneuttrykksmaskineriet. Dette kan være en god ting—moderne e. coli lysatbaserte systemer inneholder chaperoner og det meste av sentral metabolisme, noe som øker proteinutbyttet og produkttiter. Hvis du trenger å fjerne aktiviteten til et bestemt enzym helt, kan et rekonstituert system kjent SOM REN (Proteinsyntese Ved Hjelp Av Rekombinante Elementer) være det riktige alternativet. I PURE blir hvert protein som kreves for genuttrykk renset og tilsatt reaksjonen, noe som gir deg maksimal kontroll over reaksjonssammensetningen. Strømlinjeformede protokoller har nylig blitt publisert for å produsere begge typer systemer økonomisk, men du kan også kjøpe et sett.

For Å Oppsummere

Cellefrie systemer er uinnkapslede biosyntetiske systemer som er nyttige for rask genetisk systemutvikling og bioproduktsyntese. Hvis du ønsker å fremskynde utviklingen av en ny biosyntetisk vei, undersøke en biokjemisk prosess i et enklere system, eller ønsker en enklere måte å bruke uttrykksmaskineriet fra en genetisk ugjennomtrengelig vert, kan det være riktig for deg å gå cellefri.

Videre Lesing

Dudley QM, Karim AS& Jewett MC. Cellefri Metabolsk Engineering: Biomanufacturing utover cellen. Bioteknologi J. (2015) 10(1): 69-82. DOI: 10.1002 / biot.201400330

Garamella J, Marshall R, Rustad m & Noireaux V. Alle E. coli TX-TL Verktøykasse 2.0: En Plattform For Cellefri Syntetisk Biologi. Acs Syntetisk Biologi (2016) 5(4):344-355. DOI: 10.1021 / acssynbio.5b00296

Thermo Fisher Vitenskapelig. Oversikt Over Proteinuttrykk. Proteinbiologi Ressursbibliotek.

Shimizu Y, Kanamori T, Ueda T. Proteinsyntese av rene oversettelsessystemer. Metoder. (2005) 36(3):299-304. DOI: 10.1016 / j.ymeth.2005.04.006

Shoba. En Intro Til Cellefri Proteinsyntese. Bitesize Bio. 2. Mars 2009.

Shoab. Løst: Lav Avkastning I Cellefri Proteinsyntese. Bitesize Bio. 21. April 2009.