細胞膜：祝福と呪い

細胞膜は、細胞小器官、不安定な分子、酵素、遺伝情報が生息するサイトゾルを包み込み、代謝と複製に必要なすべてのものを包み込む。 しかし、それはまた、生命の繊細で動的な平衡を不安定にするものを保持します。

膜は細胞にとって不可欠ですが、生物工学者にとっても不便であることがよくあります。

膜は細胞にとって不可欠ですが、生物工学者にとっ 外来DNAを受け入れるように細胞を準備し、細胞膜を横切ってDNAを取得し、生物のゲノムに新しい命令セットを統合することは、時間がかかり、骨の折 そして、研究者は、合理化された形質転換プロトコルを欠いているより外来種に宿主生物のレパートリーを拡大することにますます興味を持っています。

タンパク質の生産と代謝のプロセスのほとんどは、カプセル化のための基本的な要件を持っていません。

あなたのアプリケーションにセルが必要ない場合は、なぜ気にしますか？

発現機構を細胞から試験管に取り出す無細胞発現系は、この一見難治性の問題に対する解決策である。

これらのシステムは、”プロトセル”の表現を研究するなど、基本的な生物学的質問に答えるために使用することができます。 例えば、生成物の力価を最大化するために代謝経路を迅速に最適化することができます。 それらは即時biosensingおよびbiomanufacturingプラットホームとして使用することができる。 無細胞システムが何であるか、なぜそれらが有用であるか、そしてどのように始めることができるかについての詳細を学ぶことに興味があるなら、

それをすべて（バック）一緒に置く

翻訳がセルの外側で発生するために必要なコンポーネントは何ですか？ すべての無細胞タンパク質発現系は、少なくともこれら三つの部分を含む。

1. 並進機械。 これには、リボソームおよびtrna、ならびに翻訳に必要な開始、伸長、および放出因子、およびtrnaを同族のアミノ酸で充電するアミノアシルtRNA合成酵素が含まれる。
2. エネルギー。 GtpおよびATPは、並進伸長およびtRNA帯電を動力源とする。 糖、リン酸化解糖中間体、または他のリン酸化化合物がエネルギー源として使用され、反応の過程で高濃度のヌクレオチド三リン酸塩が維持され、数時間
3. 翻訳されるメッセンジャー RNA。 これは、IN vitro T7転写を介して無細胞反応の外で、またはDNAテンプレートとNTPsを添加し、T7RNAポリメラーゼまたは細胞溶解物中に存在する天然ポリメラーゼのいず

無細胞系は、細胞外での翻訳、しばしば転写および中枢代謝を再現する。 しかし、セルフリーとセルベースのシステムの3つの主な違いを覚えておくことが重要です。

1. 区画化と空間組織化。 無細胞発現系は、生化学反応系と周囲の環境との間の障壁だけでなく、機能的に異なるコンパートメント間の障壁を欠いている。 無細胞系におけるすべての生化学反応は、均質な環境で行われている。
2. 希釈します。 無細胞系は、細胞よりも高分子含有量の点で、より希薄な一桁である。 遺伝子発現機構の濃度が低いだけでなく、高分子の混雑の程度も低く、生化学的反応速度および平衡に影響を及ぼす可能性がある。
3. ゲノム。 染色体ＤＮＡは、無細胞系から消化または精製される。 無細胞システムは行動をプログラムするためのゲノムを欠いているので、反応が実行する唯一の指示はあなたが提供するものです。

なぜあなたは無細胞に行くべきですか？無細胞系は細胞膜を欠いているため、細胞発現よりもいくつかの利点があります。

無細胞系は細胞膜を欠いているため、細胞発現よりもいくつかより速く–無細胞実験では、形質転換と細胞増殖の長い日はありません。

• より速く-無細胞実験では、形質転換と細胞増殖の長い日はありません。
  典型的な無細胞反応は、数日ではなく、完了するまでに数時間かかります。 複雑なまたは最適化されていない形質転換プロトコル、またはより長い培養時間を持つ生物で作業する場合、細胞内と無細胞の間の速度の差はさ 無細胞は、難治性宿主に任意の遺伝情報を統合することなく、新規宿主生物、遺伝的回路、さらには全体の代謝経路のための遺伝的部分をプロトタイプ
• 生化学的に柔軟性があり、小分子、代謝産物、および酵素の細胞内濃度はすべて高度に調節されています。
• 生化学的に柔軟性があります。

適な収量または遺伝的システム性能のためにそれらの濃度を調整したり、それらの濃度が何であるかを監視することさえ困難であり得る。 あなたは、無細胞系における生体分子組成をはるかに制御することができます。 新規コソリュートを追加したり、脂質ミセルを使用して遺伝子発現機構を再カプセル化したりして、これらの修飾が遺伝子発現にどのように影響するかを調べたりすることができます。

• オープン–無細胞システムのオープン性は、システムケミストリーを変更するときに役立ちますが、センシングなどの外部環境との通信を必要とするア 現在、核酸のように細胞膜を横切ることができない分子に応答する細胞センシングプラットフォームを設計することは困難である。 無細胞検出システムでは、その障壁は存在せず、ウイルスRNAのような分子を簡単に検出することができます。

…そして、なぜあなたはいけないのですか？

細胞環境と無細胞環境の違いは、二つの発現プラットフォーム間の実験的アプローチの違いにつながる可能性があります。

• ない（まだ）ハイスループットハイスループットフローサイトメトリーとNGSベースの遺伝的特性評価実験は、便利にそれらの出力と一緒に遺伝的命令をパッケー 数万の遺伝的変異体は、フローサイトメトリーおよび/またはNGSを使用して機能のためにスクリーニングすることができます。 従来の単一の無細胞実験でスクリーニングすることができる変異体の数は、インビボアッセイの高スループットよりも数桁少ない。
• In vivoは（必ずしも）in vitroと同じではありません–無細胞の結果は必ずしもin vivoシステムの性能、または他の無細胞システムに直接マップされるとは限りません。
• in vivoは、in vitroと同等ではありません。 システム成分の濃度の違いのために、システム間の無細胞出力は同等であるが、同一ではない傾向がある。
• それは大規模な蛋白質の準備のために経済的ではないです。 2までの収率ながら。無細胞系では3g/Lのタンパク質が報告されており、細胞ベースの発現と競合するため、無細胞反応量の約1000倍の培養量が必要になります。 これはそれがたくさんの組換え蛋白質を作成するための経済的なシステムではないことを意味します。

システムを選択する

原核生物または真核生物、自家製または商業的、粗抽出物ベースまたは再構成？ システムの選択はあなたの特定の必要性および抑制によって決まる。どの種ですか？

どの種ですか？

あなたが遺伝的部分をプロトタイピングしている、または特定の生物の発現機構を必要としていない限り、大腸菌ベースの無細胞システムが最初の選 最も古く、最も広く使用されている無細胞システムのファミリーである大腸菌システムは、信頼性の高い遺伝子発現と高収率のタンパク質産生のために最適化されています。

商業に行く？ 独自の細胞抽出物を製造するには、大量の細胞を培養して溶解するための設備と専門知識が必要です。 サプライヤーの一握りは、モデル生物や主力細胞株から派生した独自の無細胞システムを販売していますが、彼らは安くはありません。 自家製システムのための反応あたりのセント対反応あたり少なくとも$7を支払うことを期待しています。

粗製または再構成？

粗製または再構成？ ほとんどの無細胞発現系は、コア遺伝子発現機構よりも多くの酵素を含む粗細胞溶解物で作られている。 これは良いことです—現代の大腸菌ライセートベースのシステムにはシャペロンと中心代謝の大部分が含まれており、タンパク質の収率と生成物力価 特定の酵素の活性を完全に除去する必要がある場合は、純粋（組換え要素を使用したタンパク質合成）として知られる再構成されたシステムが適切 PUREでは、遺伝子発現に必要な各タンパク質が精製され、反応に添加され、反応組成を最大限に制御できます。 両方のタイプのシステムを経済的に生産するために合理化されたプロトコルが最近公開されましたが、キットを購入することもできます。

それを要約すると

無細胞系は、迅速な遺伝系開発および生物生成物合成に有用なカプセル化されていない生合成系である。 新しい生合成経路の開発をスピードアップしたり、より単純なシステムで生化学的プロセスを調査したり、遺伝的に難治性の宿主からの発現機構を使

さらに読む

Dudley QM,Karim AS&Jewett MC. 無細胞代謝工学：細胞を超えたバイオマニュファクチャリング。 バイオテクノールJ.(2015) 10(1): 69-82. ドイ:10.1002/biot.201400330

Garamella J,Marshall R,Rustad M&Noireaux V.All e.coli TX-TL Toolbox2.0:無細胞合成生物学のためのプラットフォーム。 ACS合成生物学(2016) 5(4):344-355. 土井：10.1021/acssynbio.5b00296

サーモフィッシャー科学。 タンパク質発現の概要。 タンパク質生物学リソースライブラリ。

清水Y、金森T、上田T.純粋な翻訳システムによるタンパク質合成。 メソッド。 (2005) 36(3):299-304. 土井:10.1016/j.ymeth.2005年04月06日

ショバ。 無細胞タンパク質合成へのイントロ。 バイトサイズバイオ… 2月2009.

ショアブ。 無細胞タンパク質合成における低収率を解決した。 バイトサイズバイオ… 21April2009.