La membrana cellulare: una benedizione e una maledizione

La membrana cellulare avvolge un citosol brulicante di organelli, molecole instabili, enzimi e informazioni genetiche-tutto ciò che serve per il metabolismo e la replicazione. Ma tiene anche fuori tutto ciò che destabilizzerebbe il delicato equilibrio dinamico della vita.

Mentre la membrana è essenziale per la cellula, è spesso anche un inconveniente per gli ingegneri biologici. Preparare le cellule ad accettare il DNA estraneo, ottenere il DNA attraverso la membrana cellulare e integrare il nuovo set di istruzioni nel genoma dell’organismo sono compiti che richiedono tempo e laboriosi. E i ricercatori sono sempre più interessati ad espandere il nostro repertorio di organismi ospiti a specie più esotiche, che mancano di protocolli di trasformazione semplificati.

La maggior parte dei processi di produzione e metabolismo delle proteine non hanno alcun requisito fondamentale per l’incapsulamento. Se non è richiesta alcuna cella per la tua applicazione, allora perché preoccuparsi?

I sistemi di espressione senza cellule, che portano i macchinari di espressione fuori dalla cella e in una provetta, sono una soluzione a questo problema apparentemente intrattabile.

Questi sistemi possono essere utilizzati per rispondere a domande biologiche fondamentali, come lo studio dell’espressione nelle “protocelle”. Sono ugualmente utili per prototipare rapidamente sistemi genetici e metabolici: ad esempio, ottimizzando rapidamente le vie metaboliche per massimizzare i titoli del prodotto. Possono anche essere utilizzati come piattaforme di biosensing e biomanufacturing on-demand. Se siete interessati a saperne di più su ciò che i sistemi senza cellule sono, perché sono utili, e come si può iniziare, continuate a leggere!

Mettere tutto (indietro) Insieme

Quali componenti sono necessari per la traduzione al di fuori della cella? Tutti i sistemi di espressione proteica senza cellule contengono almeno queste tre parti.

1. Macchine traslazionali. Ciò include ribosomi e TRNA, nonché fattori di iniziazione, allungamento e rilascio necessari per la traduzione e aminoacil tRNA sintetasi per caricare i TRNA con i loro amminoacidi affini.
2. Energia. GTP e ATP per alimentare l’allungamento traslazionale e la carica tRNA. Zuccheri, intermedi glicolitici fosforilati o altri composti fosforilati sono utilizzati come fonti di energia per assicurarsi che alte concentrazioni di trifosfati nucleotidici siano mantenute nel corso della reazione, che può durare fino a diverse ore.
3. Un RNA messaggero da tradurre. Questo può essere prodotto al di fuori della reazione senza cellule tramite trascrizione in vitro T7, o all’interno della reazione senza cellule aggiungendo un modello di DNA e NTPs e utilizzando la T7 RNA polimerasi o una polimerasi nativa presente nel lisato cellulare.

I sistemi senza cellule ricapitolano la traduzione, e spesso la trascrizione e il metabolismo centrale, al di fuori della cellula. Tuttavia, è importante ricordare le tre principali differenze tra i sistemi cell-free e cell-based.

1. Compartimentazione e organizzazione spaziale. I sistemi di espressione senza cellule mancano di una barriera tra un sistema di reazione biochimica e l’ambiente circostante, nonché di barriere tra compartimenti funzionalmente distinti. Tutte le reazioni biochimiche nei sistemi senza cellule avvengono in un ambiente omogeneo.
2. Diluizione. I sistemi senza cellule sono un ordine di grandezza più diluito, in termini di contenuto macromolecolare, rispetto alle cellule. Non solo le concentrazioni dei macchinari di espressione genica sono più basse, ma anche il grado di affollamento macromolecolare è più basso, il che può influenzare i tassi di reazione e gli equilibri biochimici.
3. Un genoma. Il DNA cromosomico viene digerito o purificato da sistemi privi di cellule. Poiché i sistemi senza cellule mancano di un genoma per programmare il comportamento, le uniche istruzioni che la reazione effettuerà sono quelle che fornisci.

Perché si dovrebbe andare senza cellulare?

Poiché i sistemi senza cellule mancano di una membrana cellulare, hanno diversi vantaggi rispetto all’espressione cellulare.

• Più veloce – Non ci sono lunghi giorni di trasformazione e crescita cellulare in un esperimento senza cellule. Una tipica reazione senza cellule richiede ore per completare, non giorni. La differenza di velocità tra in-cell e cell-free diventa ancora maggiore quando si lavora in organismi con protocolli di trasformazione complessi o non ottimizzati, o tempi di coltura più lunghi. Cell-free può essere un ottimo modo per prototipare parti genetiche per nuovi organismi ospiti, circuiti genetici e persino intere vie metaboliche senza dover integrare alcuna informazione genetica in un ospite intrattabile.
• Biochimicamente flessibile-Le concentrazioni intracellulari di piccole molecole, metaboliti ed enzimi sono tutti altamente regolati. Può essere difficile sintonizzare le loro concentrazioni per ottenere una resa ottimale o prestazioni del sistema genetico, o anche monitorare quali sono tali concentrazioni. Hai molto più controllo sulla composizione biomolecolare in un sistema senza cellule. È possibile aggiungere nuove cosolute, o anche utilizzare micelle lipidiche per ri-incapsulare macchinari espressione genica, per indagare come queste modifiche impatto espressione genica.
• Open-L’apertura dei sistemi senza celle è utile quando si modifica la chimica del sistema, ma è particolarmente utile per le applicazioni che richiedono la comunicazione con un ambiente esterno, come il rilevamento. Attualmente è difficile progettare piattaforme di rilevamento cellulari che rispondono a molecole che non possono attraversare la membrana cellulare, come gli acidi nucleici. In un sistema di rilevamento senza cellule, quella barriera non esiste, consentendo una semplice rilevazione di molecole come l’RNA virale.

Why e perché non dovresti?

Le differenze tra l’ambiente cellulare e quello senza cellule possono portare a differenze nell’approccio sperimentale tra le due piattaforme di espressione.

• Non (ancora) high-throughput – High-throughput la citometria a flusso e gli esperimenti di caratterizzazione genetica basati su NGS sono ben consolidati per le piattaforme cellulari, che confezionano comodamente le istruzioni genetiche insieme al loro output. Decine di migliaia di varianti genetiche possono essere sottoposte a screening per la funzione utilizzando citometria a flusso e / o NGS. Il numero di varianti che possono essere proiettate in un esperimento tradizionale senza celle singole è di diversi ordini di grandezza inferiore rispetto ai test in vivo ad alta produttività.
• In vivo non è (necessariamente) uguale in vitro – Essere consapevoli del fatto che i risultati senza cellule non necessariamente mappano direttamente alle prestazioni del sistema in vivo, o anche ad altri sistemi senza cellule. A causa delle differenze nelle concentrazioni dei componenti del sistema, l’uscita senza celle tra i sistemi tende ad essere comparabile, ma non identica.
• Non è economico per preparazioni proteiche su larga scala. Mentre i rendimenti fino a 2.3 g / L di proteine sono stati riportati per i sistemi senza cellule, il che lo rende competitivo con l’espressione basata sulle cellule, avresti bisogno di un volume di coltura di ~1000 volte il volume del volume di reazione senza cellule. Ciò significa che non è un sistema economico per la creazione di grandi quantità di proteine ricombinanti.

Scelta di un sistema

Procariota o eucariotica, homebrewed o commerciale, a base di estratto grezzo o ricostituito? La scelta del sistema dipende dalle vostre esigenze e vincoli specifici.

Quale specie? A meno che tu non stia prototipando parti genetiche o abbia bisogno del macchinario di espressione di un organismo specifico, un sistema senza cellule basato su E. coli dovrebbe essere la tua prima scelta. La famiglia più antica e più ampiamente utilizzata di sistemi senza cellule, i sistemi E. coli sono stati ottimizzati per l’espressione genica affidabile e la produzione di proteine ad alto rendimento.

Andando commerciale? Produrre il proprio estratto di cellule richiede attrezzature e competenze per la coltura e lyse grandi volumi di cellule. Una manciata di fornitori vendono i propri sistemi senza cellule, derivati da organismi modello e linee cellulari cavallo di battaglia, ma non sono economici. Aspettatevi di pagare almeno 7 7 per reazione, contro centesimi per reazione per un sistema homebrewed.

Greggio o ricostituito? La maggior parte dei sistemi di espressione senza cellule sono realizzati con lisato di cellule grezze, che contiene molti più enzimi rispetto al macchinario di espressione genica principale. Questa può essere una buona cosa: i moderni sistemi a base di lisato di E. coli contengono chaperoni e la maggior parte del metabolismo centrale, che aumenta le rese proteiche e i titoli del prodotto. Se è necessario rimuovere completamente l’attività di un determinato enzima, un sistema ricostituito noto come PURO (sintesi proteica utilizzando elementi ricombinanti) può essere l’opzione giusta. In PURO, ogni proteina necessaria per l’espressione genica viene purificata e aggiunta alla reazione, dando il massimo controllo sulla composizione della reazione. Protocolli semplificati sono stati recentemente pubblicati per produrre economicamente entrambi i tipi di sistemi, ma è anche possibile acquistare un kit.

Per riassumere

I sistemi cell-free sono sistemi biosintetici non incapsulati che sono utili per lo sviluppo rapido del sistema genetico e la sintesi dei bioprodotti. Se stai cercando di accelerare lo sviluppo di un nuovo percorso biosintetico, studiare un processo biochimico in un sistema più semplice, o vorresti un modo più semplice per usare il macchinario di espressione da un ospite geneticamente intrattabile, andare senza cellule potrebbe essere giusto per te.

Ulteriori letture

Dudley QM, Karim AS& Jewett MC. Ingegneria metabolica senza cellule: Biomanufacturing oltre la cellula. Biotechnol J. (2015) 10(1): 69-82. DOI: 10.1002 / biot.201400330

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Shoba. Un’introduzione alla sintesi proteica senza cellule. Bitesize Bio. 2 Marzo 2009.

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