a sejtmembrán: áldás és átok

a sejtmembrán körülveszi a citoszolt, amely tele van organellákkal, instabil molekulákkal, enzimekkel és genetikai információkkal – minden, ami az anyagcseréhez és a replikációhoz szükséges. De távol tart mindent, ami destabilizálná az élet kényes, dinamikus egyensúlyát.

bár a membrán elengedhetetlen a sejt számára, gyakran kellemetlenséget okoz a biológiai mérnökök számára is. A sejtek felkészítése az idegen DNS befogadására, a DNS átjuttatása a sejtmembránon, és az új utasításkészlet integrálása a szervezet genomjába időigényes és fáradságos feladat. A kutatókat pedig egyre inkább érdekli a gazdaszervezetek repertoárjának kiterjesztése egzotikusabb fajokra, amelyek nem rendelkeznek áramvonalas transzformációs protokollokkal.

a fehérjetermelés és-metabolizmus legtöbb folyamatának nincs alapvető követelménye a kapszulázáshoz. Ha nincs szükség cellára az alkalmazáshoz, akkor miért zavarja?

a sejtmentes expressziós rendszerek, amelyek az expressziós gépeket kiviszik a sejtből egy kémcsőbe, megoldást jelentenek erre a látszólag megoldhatatlan problémára.

Ezek a rendszerek felhasználhatók alapvető biológiai kérdések megválaszolására, például a “protosejtekben”történő expresszió tanulmányozására. Ugyanilyen hasznosak a genetikai és anyagcsere-rendszerek gyors prototípuskészítéséhez: például gyorsan optimalizálják az anyagcsere útvonalakat a termék titerének maximalizálása érdekében. Akár igény szerinti bioszenzoros és biomanufacturing platformként is használhatók. Ha többet szeretne megtudni arról, hogy milyen cellamentes rendszerek vannak, miért hasznosak, és hogyan kezdheti el, olvassa el!

mindent (vissza) összerakva

milyen összetevőkre van szükség ahhoz, hogy a fordítás a cellán kívül történjen? Minden sejtmentes fehérje expressziós rendszer legalább ezt a három részt tartalmazza.

1. transzlációs gépezet. Ez magában foglalja a riboszómákat és a tRNS-eket, valamint a transzlációhoz szükséges iniciációs, megnyúlási és felszabadulási tényezőket, valamint az aminoacil-tRNS-szintetázokat, amelyek a tRNS-eket rokon aminosavakkal töltik fel.
2. energia. GTP és ATP teljesítmény transzlációs megnyúlás és tRNS töltés. Cukrokat, foszforilezett glikolitikus köztitermékeket vagy más foszforilezett vegyületeket használnak energiaforrásként annak biztosítására, hogy a nukleotid-trifoszfátok magas koncentrációja fennmaradjon a reakció során, ami akár több órán keresztül is eltarthat.
3. egy lefordítandó messenger RNS. Ez előállítható a sejtmentes reakción kívül in vitro T7 transzkripcióval, vagy a sejtmentes reakción belül DNS-sablon és NTP-k hozzáadásával, vagy T7 RNS-polimeráz vagy a sejtlizátumban jelen lévő natív polimeráz felhasználásával.

a sejtmentes rendszerek összefoglalják a transzlációt, és gyakran a transzkripciót és a központi anyagcserét a sejten kívül. Fontos azonban megjegyezni a három fő különbséget a sejtmentes és a sejtalapú rendszerek között.

1. Kompartmentalizáció és térbeli szerveződés. A sejtmentes expressziós rendszerekben nincs akadály a biokémiai reakciórendszer és a környező környezet között,valamint a funkcionálisan elkülönülő rekeszek között. A sejtmentes rendszerekben minden biokémiai reakció homogén környezetben zajlik.
2. hígítás. A sejtmentes rendszerek makromolekuláris tartalmuk szempontjából nagyságrenddel hígabbak, mint a sejtek. Nem csak a génexpressziós gépek koncentrációja alacsonyabb, hanem a makromolekuláris zsúfoltság mértéke is alacsonyabb, ami befolyásolhatja a biokémiai reakciósebességet és az egyensúlyt.
3. egy genom. A kromoszómális DNS-t emésztjük vagy tisztítjuk a sejtmentes rendszerekből. Mivel a sejtmentes rendszerekből hiányzik a genom a viselkedés programozásához, a reakció csak azokat az utasításokat hajtja végre, amelyeket Ön ad meg.

miért kell menni Cell-mentes?

mivel a sejtmentes rendszerekből hiányzik a sejtmembrán, számos előnyük van a sejtexpresszióval szemben.

• gyorsabb – nincsenek hosszú napok a transzformáció és a sejtnövekedés egy sejtmentes kísérletben. Egy tipikus sejtmentes reakció órákig tart, nem napokig. A sejten belüli és a sejtmentes sebesség közötti különbség még nagyobb lesz, ha komplex vagy nem optimalizált transzformációs protokollokkal rendelkező organizmusokban vagy hosszabb tenyésztési időkben dolgoznak. A sejtmentesség nagyszerű módja lehet az új gazdaszervezetek genetikai részeinek prototípusának, genetikai áramkörök, sőt egész anyagcsere utak anélkül, hogy bármilyen genetikai információt integrálnának egy megoldhatatlan gazdaszervezetbe.
• biokémiailag rugalmas – a kis molekulák, metabolitok és enzimek intracelluláris koncentrációja erősen szabályozott. Nehéz lehet összehangolni koncentrációikat az optimális hozam vagy a genetikai rendszer teljesítménye érdekében, vagy akár ellenőrizni, hogy ezek a koncentrációk milyenek. Sokkal jobban ellenőrizheti a biomolekuláris összetételt egy sejtmentes rendszerben. Új koszolutokat adhat hozzá, vagy akár lipid micellákat is használhat a génexpressziós gépek újbóli beágyazására, hogy megvizsgálja, hogy ezek a módosítások hogyan befolyásolják a génexpressziót.
• Open-a sejtmentes rendszerek nyitottsága hasznos a rendszerkémia módosításakor, de különösen hasznos olyan alkalmazásoknál, amelyek külső környezettel való kommunikációt igényelnek, például érzékelés. Jelenleg nehéz olyan sejtérzékelő platformokat tervezni, amelyek reagálnak olyan molekulákra, amelyek nem tudnak átjutni a sejtmembránon, mint például a nukleinsavak. Egy sejtmentes érzékelő rendszerben ez a gát nem létezik, lehetővé téve az olyan molekulák egyszerű kimutatását, mint a vírus RNS.

… és miért ne tennéd?

a celluláris és a sejtmentes környezetek közötti különbségek a két expressziós platform közötti kísérleti megközelítés különbségeihez vezethetnek.

• nem (még) nagy áteresztőképességű-nagy áteresztőképességű áramlási citometria és NGS – alapú genetikai jellemzési kísérletek jól megalapozottak a sejtplatformok számára, amelyek kényelmesen csomagolják a genetikai utasításokat a kimenetükkel együtt. Több tízezer genetikai variáns szűrhető funkcióhoz áramlási citometria és/vagy NGS segítségével. A hagyományos egysejtmentes kísérletben szűrhető variánsok száma több nagyságrenddel kisebb, mint a nagy áteresztőképességű in vivo vizsgálatokban.
• In vivo nem (feltétlenül) egyenlő in vitro-ne feledje, hogy a sejtmentes eredmények nem feltétlenül kapcsolódnak közvetlenül az in vivo rendszer teljesítményéhez, vagy akár más sejtmentes rendszerekhez. A rendszerkomponensek koncentrációjának különbségei miatt a rendszerek közötti cellamentes kimenet általában összehasonlítható, de nem azonos.
• ez nem gazdaságos a nagy léptékű fehérje készítmények. Míg hozamok akár 2.3 g/L fehérjét jelentettek a sejtmentes rendszerekről, ami versenyképessé teszi a sejtalapú expresszióval, a sejtmentes reakció térfogatának ~1000-szeresére lenne szükség. Ez azt jelenti, hogy nem gazdaságos rendszer nagy mennyiségű rekombináns fehérje előállítására.

rendszer kiválasztása

prokarióta vagy eukarióta, házi vagy kereskedelmi, nyers kivonat alapú vagy rekonstruált? A rendszer kiválasztása az Ön egyedi igényeitől és korlátaitól függ.

melyik faj? Hacsak nem prototípus genetikai részek, vagy szükség van a kifejezés gép egy adott szervezet, egy E. coli-alapú sejtmentes rendszer legyen az első választás. A legrégebbi és legszélesebb körben használt sejtmentes rendszercsalád, az E. coli rendszereket megbízható génexpresszióra és magas hozamú fehérjetermelésre optimalizálták.

megy kereskedelmi? A saját sejtkivonat előállítása felszerelést és szakértelmet igényel nagy mennyiségű sejt tenyésztéséhez és lizálásához. Egy maroknyi beszállító eladja saját sejtmentes rendszereit, amelyek modellszervezetekből és munkalovas sejtvonalakból származnak, de nem olcsók. Számíthat arra, hogy reakciónként legalább 7 dollárt fizet, szemben a reakciónkénti centekkel egy házi készítésű rendszerért.

nyers vagy rekonstruált? A legtöbb sejtmentes expressziós rendszer nyers sejtlizátumból készül, amely sokkal több enzimet tartalmaz, mint a maggén expressziós gépezet. Ez jó dolog lehet—a modern E. coli lizátum alapú rendszerek chaperonokat és a központi anyagcsere nagy részét tartalmazzák, ami növeli a fehérje hozamát és a termék titerét. Ha teljesen el kell távolítania egy bizonyos enzim aktivitását, akkor a tiszta (rekombináns elemeket tartalmazó fehérjeszintézis) néven ismert rekonstruált rendszer lehet a megfelelő lehetőség. A PURE – ban a génexpresszióhoz szükséges összes fehérjét megtisztítják és hozzáadják a reakcióhoz, így maximális ellenőrzést biztosít a reakcióösszetétel felett. A közelmúltban egyszerűsített protokollokat tettek közzé mindkét típusú rendszer Gazdaságos előállításához, de készletet is vásárolhat.

összefoglalva

a sejtmentes rendszerek nem kapszulázott bioszintetikus rendszerek, amelyek hasznosak a genetikai rendszer gyors fejlődéséhez és a bioprodukt szintéziséhez. Ha fel akarja gyorsítani egy új bioszintetikus út kifejlesztését, egyszerűbb rendszerben vizsgálja meg a biokémiai folyamatot, vagy egyszerűbb módszert szeretne használni a genetikailag megoldhatatlan gazdaszervezet kifejezési gépének használatára, akkor a sejtmentesség lehet az Ön számára.

további olvasmányok

Dudley QM, Karim AS& Jewett MC. Sejtmentes anyagcsere-tervezés: Biomanufacturing a sejten túl. Biotechnol J. (2015) 10(1): 69-82. DOI: 10.1002 / biot.201400330

Garamella J, Marshall R, Rustad M & Noireaux V.az összes E. coli TX-TL eszköztár 2.0: a sejtmentes szintetikus biológia platformja. ACS Synthetic Biology (2016) 5(4):344-355. DOI: 10.1021 / acssynbio.5b00296

Thermo Fisher Scientific. A fehérje expressziójának áttekintése. Fehérje Biológiai Erőforrás Könyvtár.

Shimizu Y, Kanamori T, Ueda T. fehérjeszintézis tiszta transzlációs rendszerekkel. Módszerek. (2005) 36(3):299-304. DOI: 10.1016 / j. ymeth.2005.04.006

Shoba. Bevezetés a sejtmentes Fehérjeszintézisbe. Bitesize Bio. 2 március 2009.

Shoab. Megoldott: alacsony hozam a sejtmentes fehérjeszintézisben. Bitesize Bio. 21 április 2009.