täydellinen ymmärrys RNA-molekyylien toiminnasta edellyttää tietoa niiden korkeamman kertaluvun rakenteista (2D ja 3D) sekä niiden alkeisjärjestyksen ominaisuuksista. RNA: n rakenne on tärkeä monille toiminnoille, kuten transkription ja translaation säätelylle, katalyysille, proteiinien kuljetukselle kalvojen yli ja RNA-virusten säätelylle. Näiden toimintojen ymmärtäminen on tärkeää perusbiologian sekä sellaisten lääkkeiden kehittämisen kannalta, jotka voivat puuttua tapauksiin, joissa näiden molekyylien patologinen toiminnallisuus esiintyy.

ryhmämme tutkii ja kehittää menetelmiä RNA: n laskostumisen parantamiseksi ja analyysitekniikoita auttaakseen ymmärtämään paremmin näiden molekyylien toiminnallisia ominaisuuksia. Lisäksi keskitymme kehittyvään RNA-nanobiologian alaan. RNA edustaa suhteellisen uutta molekyylimateriaalia biologisesti suuntautuneiden nanolaitteiden kehittämiseen. Se on mielenkiintoinen materiaali, koska sen luonnolliset toiminnallisuudet, sen kyky taittaa monimutkaisiin rakenteisiin ja itse koota. Olemme kehittäneet laskennallisia ja kokeellisia menetelmiä, jotka mahdollistavat RNA-pohjaisten nanohiukkasten suunnittelun, joilla on mahdollisesti monenlaisia käyttötarkoituksia. RNA: ta koskeva tutkimuksemme kattaa siis viisi toisiinsa läheisesti liittyvää ja integroitua tutkimusaluetta:

1. RNA: n sekundaarirakenteen ennustamisen ja analysoinnin algoritmien tutkimus;
2. RNA: n biologia ja sen suhde sekvenssin ja sekundaarirakenteen taittumisominaisuuksiin;
3. RNA 3D-rakenteen ennustamisen ja analysoinnin algoritmien tutkimus ja niiden soveltaminen RNA-biologiaan;
4. RNA-nanohiukkasten suunnittelun ja analyysin algoritmien tutkimus;
5. RNA-pohjaisten nanohiukkasten kokeellinen suunnittelu, synteesi ja toimitus.

se, mitä yhdellä alueella opitaan, sovelletaan toisiin alueisiin, mikä parantaa ymmärrystämme RNA: n rakenteesta, toiminnasta ja RNA: n nanobiologiasta ja itsensä kokoamisesta.

rinnakkainen laskennallinen Biologia ja RNA-rakenne
mullistavia muutoksia laskennallisissa paradigmoissa tarvitaan, jotta tarvittava laskentateho säilyy molekyylibiologian ongelmien ratkaisemiseksi. Peräkkäisiin tietokonearkkitehtuureihin perustuvien menetelmien ei voitu odottaa jatkuvasti pysyvän tarvittavien laskennallisten nopeuksien tahdissa. Jotta mahtuu suuria nopeuksia, jotka ovat tarpeen, erittäin rinnakkaisia laskennallisia tekniikoita käytetään nyt. Ryhmämme oli yksi uranuurtajista laskennallisen biologian ja rinnakkaisten korkean suorituskyvyn tietokonearkkitehtuurien käytön alalla tässä pyrkimyksessä.

Laskennalliset tekniikat RNA: n sekundaarirakenteen ennustamiseen ja analysointiin
kehitimme ensimmäisenä RNA: n taittotekniikan, joka käyttää käsitteitä geneettisistä algoritmeista. Algoritmimme MPGAfold kehitettiin alun perin toimimaan massiivisesti rinnakkaisella SIMD-supertietokoneella, MasPar MP-2: lla, jossa on 16384 prosessoria. Tämä algoritmi muutettiin ja nyt toimii rinnakkain korkean suorituskyvyn Linux klustereita. Poikkeukselliset skaalaominaisuudet saadaan, kun algoritmia voidaan ajaa sadoilla tuhansilla populaatioelementeillä. RNA pseudoknot-ennustus on osa geneettistä algoritmia, jolloin se pystyy ennustamaan tertiäärisiä vuorovaikutuksia. Muita ominaisuuksia ovat simulointi co-transkription taitto, kyky sisällyttää erilaisia energiasääntöjä, ja pakotettu esto ja upottaminen halutut kierteiset varret. Lisäksi STRUCTURELABIA, heterogeenistä bioinformaattista RNA-analyysia workbench, voidaan käyttää yhdessä Mpgafoldin ja RNA2D3D: n kanssa tuottamaan ennustettuja 3D-atomikoordinaatteja RNA-rakenteista yhdessä näiden rakenteiden visualisoinnin kanssa. Kehitimme myös uudenlaisen interaktiivisen visualisointimenetelmän, joka on osa STRUCTURELABIA. Tämä tekniikka mahdollistaa useiden sekvenssien RNA-poimujen vertailun ja analysoinnin fylogeneettisestä näkökulmasta, mikä mahdollistaa ennustettujen rakennetulosten parantamisen sekvenssiperheessä.
kehitimme Knetfoldin, uuden ja tehokkaan algoritmin RNA: n rakenteen ennustamiseen sekvenssien linjauksista. Algoritmi käyttää rakenteiden ennustamiseen ainutlaatuista hierarkkista luokitteluverkostoa, joka perustuu keskinäiseen informaatioon, termodynamiikkaan ja Watson-Crick base-pairedaliteettiin. Lisäksi olemme kehittäneet verkkopohjaisen sovelluksen, Correlogon, joka käyttää RNA-sekvenssien linjauksista johdettua keskinäistä informaatiota määrittääkseen kovariaatioita emäspariasemien välillä. Algoritmi sisältää yksilöllisen virhemittarin ja kuvaa tulokset 3D: nä.
kehitimme, CyloFold, ainutlaatuisen algoritmin ennustamiseen yhdestä sekvenssistä, RNA: n toisiorakenteita, jotka voivat sisältää pseudoknotteja. Tämä algoritmi hyödyntää uutta tekniikkaa, joka approksimoi 3D-steeristen yhteentörmäysten mahdollisuutta ennustetuissa rakenteissa, suodattaen näin nämä rakenteet pois harkinnasta. Algoritmilla on osoitettu olevan suuri tarkkuus verrattuna muihin sen tyyppisiin algoritmeihin.
kehitimme web-ohjelmiston, joka perustui Bayesilaiseen tilastolliseen lähestymistapaan, joka arvioi EMÄSPARINMUODOSTUKSEN tarkkuuden muodosta (selektiivinen 2′ – Hydroksyyliasylaatio analysoitu Primer Extension) saatujen kokeiden perusteella. Tilastolliset / todennäköisyystulokset saatiin analysoimalla tunnettuja RNA 3D-rakenteita, joilla oli erilaisia tunnettuja emäsvuorovaikutuksia, ja korreloimalla ne MUOTOARVOJEN kanssa. Osoitettiin, että matalat MUOTOARVOT korreloivat hyvin Watson-Crick base-pariliitos-ja pinoamisvuorovaikutusten kanssa, kun taas korkeat MUOTOARVOT osoittavat yksijuosteisia alueita. Parannuksia voitaisiin nähdä, jos myös 2 tai 3 peruskonteksti otettaisiin huomioon. Osoitimme myös, että muunlaiset tunnetut vuorovaikutukset eivät korreloineet hyvin. Tämäntyyppiset tiedot ovat hyödyllisiä RNAS: n toissijaisen rakenteen lopullisessa määrittämisessä.

Laskennalliset tutkimukset RNA: n Taittumisreiteistä
RNA: n taittumisreiteistä osoittautuvat melko tärkeiksi RNA: n toiminnan määrittämisessä. Tutkimukset osoittavat, että RNA saattaa päästä välivaiheen konformaatiotiloihin, jotka ovat avain sen toimivuuteen. Näillä tiloilla voi olla merkittävä vaikutus geenien ilmentymiseen. Tiedetään, että RNA-molekyylien biologisesti funktionaaliset tilat eivät välttämättä vastaa niiden minimienergiatilaa, että voi olla olemassa kineettisiä esteitä, jotka vangitsevat molekyylin paikalliseen minimiin, että taittuminen tapahtuu usein transkription aikana, ja on tapauksia, joissa molekyyli siirtyy yhden tai useamman funktionaalisen konformaation välillä ennen kuin se saavuttaa alkuperäisen tilansa. RNA-molekyylin taittumisreittien simulointimenetelmät, mukaan lukien ko-transkriptionaalinen taittuminen, ja merkittävien välitilojen paikantaminen ovat siten tärkeitä RNA: n rakenteen ja siihen liittyvän toiminnan ennustamisessa. Useita biologisia RNA: n taittumisreittejä on tutkittu onnistuneesti Mpgafoldin ja STRUCTURELABIN avulla. Esimerkkejä ovat perunan sukkulamukulatauti, Escherichia coli-plasmidin R1 isäntää tappava mekanismi, hepatiittidelta-virus, HIV ja DENGUEVIRUS. Nämä laskennalliset tulokset ovat yhdenmukaisia biologisista kokeista saatujen tulosten kanssa. Lisäksi on ennustettu uudenlaisia rakenteellisia vuorovaikutuksia ja tärkeitä toiminnallisia väli-ja kotoperäisiä tiloja. Nämä ovat johtaneet uusiin onnistuneisiin varmistuskokeisiin.

RNA-Vuorovaikutusverkostojen laskennallinen ennustaminen
olemme myös kehittäneet CovaRna-ja CovStat-ohjelmia, joilla tutkitaan pitkän kantaman kovaihtelevia RNA-vuorovaikutusverkostoja koko genomin linjausten avulla. Tätä uutta menetelmää, jota sovellettiin Drosophila-genomeihin, sovelletaan parhaillaan muihin genomeihin. Ohjelmasta kehitettiin rinnakkainen versio nopeuttamaan käsittelyä ja algoritmit nojaavat myös nopeisiin indeksointijärjestelmiin ja konservatiivisiin tilastollisiin menetelmiin erittäin merkittävien vuorovaikutusten määrittämiseksi. Menetelmässä on löydetty mielenkiintoisia vuorovaikutuksia, jotka liittyvät endogeeniseen sirnaan, geenikuljetukseen ja morfogeneesiin liittyviin geeneihin.

kolmiulotteisten RNA-rakenteiden laskennallisia tutkimuksia
joitakin RNA-molekyylien rakenneosia on tutkittu molekyylimekaniikan ja molekyylidynamiikan simulaatioiden avulla. Tutkittuihin rakenteisiin kuuluu RNA-tetraloop, jossa tetraloopin denaturointi lämpötilasta riippuvaiseksi ja sen jälkeen tapahtuva uudelleenlaadinta alkuperäiselle kiderakenteelle suoritettiin. Thermus thermophiluksen 30-luvun ribosomaalisen alayksikön kolmijakoa tutkittiin. Kokeellisesti on määritetty, että kolmitieyhteyden ja S15-ribosomiproteiinin väliset molekyylien väliset vuorovaikutukset käynnistävät 30s-ribosomaalisen alayksikön kokoamisprosessin. Käyttämällä molekyylidynamiikan simulaatioita saimme tietoa S15: n sitoutumiseen liittyvistä liitoksen konformaatiomaisista siirtymistä. Määritimme käyttämällä molekyylidynamiikan simulaatioita, rakenteellisia vaikutuksia hyödyntämällä uudentyyppisiä modifioituja RNA-nukleotideja, jotka sisältävät karbosyklisiä sokereita, jotka rajoittuvat pohjoiseen tai etelään konformaatioihin (C2′ tai C3′ exo). Lisäksi osoitimme molekyylidynamiikan simulaatioilla, miten ionit ja reunustavat emäkset ovat erittäin tärkeässä roolissa ihmisen immuunikatoviruksen (HIV) suutelusilmukan monomeerikonformaatioissa. Nämä tulokset korreloivat hyvin ja saattavat selittää yksityiskohtaisesti kokeellisia tutkimuksia, jotka osoittavat ionien merkityksen HIV-1-dimerisaatiossa.

olemme tutkineet myös telomeraasin pseudoknot-domeenia. Pseudoknot-verkkotunnuksen molekyylimallinnus ja molekyylidynamiikka, mukaan lukien sen hiusneulasilmukka, suoritettiin. Tulokset osoittivat, miten hiusneulasilmukan dynamiikka vaikutti varresta löytyvien ei-kanonisten U-U-emäsparien avautumiseen ja sulkeutumiseen. Avaus ehdotti nukleaatiopisteitä pseudoknotin muodostumiselle. Olemme myös tutkineet dyskeratosis congenita (DKC) – mutaatioiden vaikutusta silmukassa ja miten ne vähensivät varren avautumisalttiutta muodostamalla suhteellisen vakaan vetysidosverkoston hiusneulasilmukkaan. Mallinnimme pseudoknotin itse käyttäen RNA2D3D-ohjelmistoamme yhdistettynä fylogeneettiseen analyysiin. Tutkimme DKC-mutaatioiden dynaamista vaikutusta pseudoknotiin sillä seurauksella, että pseudoknotista tuli epävakaa samalla kun hiusneulan muoto muuttui vakaammaksi.

löysimme ja selvitimme 3D-rakenteet uudentyyppisistä translaatiota lisäävistä aineista, joita löytyy nauriin Rypytysviruksen (ensimmäinen lajissaan löydetty) ja herneen enaation mosaiikkiviruksen 3′ UTRs: stä. Näiden rakenneosien löytäminen on tuonut päivänvaloon uusia mekanismeja translaation tehostamiseksi eukaryoottisissa kasviviruksissa, joilla voi olla laajempia vaikutuksia translaatiomekanismien ymmärtämiseen yleensä. Tämä saavutettiin Mpgafoldin, 3D-molekyylimalliohjelmistomme rna2d3d: n ja läheisten vuorovaikutusten avulla kokeellisten yhteistyökumppaneidemme kanssa. Mallintimme myös CCR5 mRNA: sta löytyneen pseudoknot-romaanin. Tämä pseudoknot on mukana frameshifting ja näyttää vakautetaan microRNA, Uusi funktio microRNA.
lisäksi olemme käyttäneet elastiseen verkkointerpolointiin perustuvia menetelmiä RNA 3D-dynamiikkaan liittyvien laskennallisten kustannusten pienentämiseksi. Kolmiulotteiset dynamiikan liikeradat voidaan määrittää pelkistetyn atomiesityksen ja konformaatiotilojen avulla. Laskenta-aika voidaan vähentää viikoista tunteihin käyttämällä tätä lähestymistapaa.
laskennallinen RNA-Nanobiologia
RNA-nanobiologia edustaa uutta modaliteettia sellaisten nanodeviittien kehittämiselle, joita voidaan käyttää useilla aloilla, muun muassa terapeutiikassa. Edellä kuvatun kokemuksemme pohjalta kehitimme useita laskennallisia ja kokeellisia tekniikoita (KS.alla), joiden avulla voidaan määrittää joukko nukleotidisekvenssejä, jotka voivat kokoontua halutuiksi nanokomplekseiksi. Yksi näistä työkaluista on relaatiotietokanta nimeltä RNAJunction. Tietokanta sisältää rakenne-ja sekvenssitietoja tunnetuista RNA: n kierteisistä liitoksista ja suutelusilmukan vuorovaikutuksista. Näitä motiiveja voidaan etsiä monin eri tavoin, jolloin saadaan lähde RNA nano – rakennuspalikoille. Toinen laskennallinen työkalu, NanoTiler, sallii käyttäjän rakentaa määriteltyjä RNA-pohjaisia nanokokoisia muotoja. NanoTiler tarjoaa 3D-graafisen näkymän suunnitelluista kohteista ja tarjoaa keinot työskennellä vuorovaikutteisesti tai suunnitteluprosessiin liittyvien tietokoneohjelmien kanssa, vaikka tarkkoja RNA-sekvenssejä ei välttämättä ole vielä määritelty, eikä all-atom-mallia ole saatavilla. NanoTiler voi käyttää rnajunction-tietokannasta löytyviä 3D-motiiveja määritetyistä RNA-toisiorakennekuvioista johdettujen motifien kanssa määritellyn RNA-nano-muodon muodostamiseen. Kombinatorista hakua voidaan soveltaa myös sellaisten rakenteiden luettelointiin, joita ei normaalisti otettaisi huomioon.

toinen verkkopohjainen ohjelmistotyökalu RNA-nanorakenteiden suunnitteluun on NanoFolder, joka on yksi harvoista ohjelmistotyökaluista, jotka kykenevät ennustamaan monisäikeisten RNA-konstruktioiden rakenne-ja sekvenssiominaisuuksia. Tämän ohjelmiston avulla on mahdollista määrittää halutut toissijaisen rakenteen kuviot ja saada ohjelmisto ennustamaan sekvenssejä, jotka tuottavat nämä halutut kuviot oikeilla intra – ja inter-strand taitto-ominaisuuksilla.

kokeellinen RNA-Nanobiologia
edellä kuvattujen RNA-nanodesignia koskevien laskennallisten lähestymistapojen pohjalta olemme osoittaneet kyvyn koota ja funktionalisoida kokeellisesti useita RNA-pohjaisia nanohiukkasia. Tämä saavutettiin lähellä vuorovaikutusta kokeellisten ja laskennallisten lähestymistapoja johtaa parannuksia sekä sarjaa menetelmiä. Esimerkkeinä voidaan mainita 6 ja 10 kerratun kuution itsekokoonpano; erikokoisten kuusikulmaisten renkaiden ja kaksoisrenkaiden itsekokoontuminen käyttämällä luonnosta saatua RNA-motiivia; muunnos sekvenssien motif parantaa saanto samalla säilyttäen asianmukaiset geometrioita; ja itse kokoonpano kolmion rakenteita. Kehitimme myös tekniikoita, jotka määrittelevät itseasennusprotokollat ja mahdollistavat konstruktioiden koontikäännöskokoamisen, johon voi sisältyä myös muunneltuja emäksiä näiden nanohiukkasten kemiallisen stabiilisuuden lisäämiseksi. Lisäksi olemme funktionalisoineet nämä hiukkaset jopa kuudella eri sirnalla mahdollistaaksemme hallitun stoikiometrian ja geenien hiljentämisen, ja osoittaneet, että nämä hiukkaset todellakin hiljentävät nimetyt geenit, kun ne siirretään eri solulinjoihin.

olemme tutkineet myös toista paradigmaa, joka perustuu RNA / DNA-hybridinanokonstruktien käyttöön sisältäen jakautuneita funktioita. Tämä mahdollistaa esimerkiksi jaettavan sirnan jakautumisen kahdeksi DNA/RNA-hybridikomponentiksi, joissa on DNA-toeholds, jotka soluihin siirryttäessä ryhmittyvät uudelleen DNA-dupleksiksi ja jaeltavaksi sirnaksi. Tämä hybridimalli on sisällytetty kuusikulmaisiin nanorakenteisiimme ja nanokuutioihimme. Tämän lähestymistavan hyödyllisyys mahdollistaa muun muassa funktionaliteettien hallitun aktivoinnin, MOLEKYYLIMAJAKOIDEN liittämisen DNA-säikeisiin ilman inteferaatiota RNA: n toiminnallisuuden kanssa ja nukleaasin hajoamisen vastustuskyvyn. Tätä lähestymistapaa on kokeiltu menestyksekkäästi soluviljelmissä ja xenograph-kasvainhiirimalleissa.
monet laskennalliset järjestelmät on mukautettu muihin ympäristöihin laboratoriomme ja NIH: n sisä-ja ulkopuolella, ja ne ovat käytettävissä verkkosivustomme kautta osoitteessa http://www-CCRNP.ncifcrf.gov/~bshapiro.