solukalvo: siunaus ja kirous

solukalvo ympäröi sytosolin, joka on täynnä organelleja, epävakaita molekyylejä, entsyymejä ja geneettistä informaatiota – kaikkea, mitä tarvitaan aineenvaihduntaan ja replikaatioon. Mutta se pitää myös poissa kaiken, mikä horjuttaisi elämän herkkää, dynaamista tasapainoa.

vaikka kalvo on solulle välttämätön, siitä on usein haittaa myös biologisille insinööreille. Solujen valmistaminen vastaanottamaan vierasta DNA: ta, DNA: n saaminen solukalvon poikki ja uuden ohjeen integroiminen eliön genomiin ovat aikaa vieviä ja työläitä tehtäviä. Tutkijat ovat yhä kiinnostuneempia laajentamaan isäntäeliöiden valikoimaa eksoottisempiin lajeihin, joilla ei ole virtaviivaisia muunnosprotokollia.

useimmissa proteiinintuotannon ja aineenvaihdunnan prosesseissa ei ole mitään kapseloinnin perustarvetta. Jos hakemukseen ei tarvita solua, niin miksi vaivautua?

Soluvapaat ilmentymäjärjestelmät, jotka vievät ilmentymäkoneiston ulos solusta koeputkeen, ovat ratkaisu tähän hankalalta tuntuvaan ongelmaan.

näitä järjestelmiä voidaan käyttää biologisiin peruskysymyksiin vastaamiseen, kuten ilmaisun tutkimiseen ”protokelloissa”. Ne ovat yhtä hyödyllisiä geneettisten ja aineenvaihdunnallisten järjestelmien nopeassa prototyypityksessä: esimerkiksi aineenvaihduntareittien nopeassa optimoinnissa tuotteiden tiittereiden maksimoimiseksi. Niitä voidaan jopa käyttää tilattavina biosensointi-ja biomanufacturing-alustoina. Jos olet kiinnostunut oppimaan lisää siitä, mitä soluttomat järjestelmät ovat, miksi ne ovat hyödyllisiä, ja miten voit aloittaa, lue eteenpäin!

Putting It All (Back) Together

mitä komponentteja tarvitaan, jotta translaatio tapahtuu solun ulkopuolella? Kaikki soluttomat proteiiniekspressiojärjestelmät sisältävät vähintään nämä kolme osaa.

1. Translaatiokoneisto. Näihin kuuluvat ribosomit ja trnat sekä translaatioon tarvittavat initiaatio -, venymä-ja vapautumistekijät sekä aminoasyyli-tRNA-syntetaasit, jotka lataavat trnoja konjaattiaminohapoillaan.
2. Energia. GTP ja ATP translationaaliseen venymään ja tRNA-lataukseen. Energialähteinä käytetään sokereita, fosforyloituja glykolyyttisiä välituotteita tai muita fosforyloituja yhdisteitä, joilla varmistetaan, että nukleotiditrifosfaattien korkeat pitoisuudet säilyvät reaktion aikana, mikä voi kestää jopa useita tunteja.
3. käännettävä lähetti-RNA. Tätä voidaan valmistaa soluttoman reaktion ulkopuolella in vitro T7-transkriptiolla tai soluttomassa reaktiossa lisäämällä siihen DNA-malli ja NTPs ja käyttämällä joko T7-RNA-polymeraasia tai solulysaatissa olevaa natiivia polymeraasia.

Soluttomat systeemit kertaavat translaatiota ja usein transkriptiota ja keskusaineenvaihduntaa solun ulkopuolella. On kuitenkin tärkeää muistaa kolme tärkeintä eroa soluttomien ja solupohjaisten järjestelmien välillä.

1. lokerointi ja tilajärjestely. Soluttomilta ilmentymäjärjestelmiltä puuttuu este biokemiallisen reaktiojärjestelmän ja ympäröivän ympäristön välillä sekä toiminnallisesti erillisten osastojen väliset esteet. Soluttomissa järjestelmissä kaikki biokemialliset reaktiot tapahtuvat homogeenisessa ympäristössä.
2. laimennus. Soluttomat systeemit ovat suuruusluokkaa laimeampia makromolekyylisisällöltään kuin solut. Geeniekspressiokoneiden pitoisuudet eivät ole ainoastaan pienempiä, vaan myös makromolekyylien joukkoistumisaste on alhaisempi, mikä voi vaikuttaa biokemiallisiin reaktionopeuksiin ja tasapainoon.
3. perimä. Kromosomaalinen DNA pilkotaan tai puhdistetaan soluttomista järjestelmistä. Koska soluttomilla järjestelmillä ei ole perimää käyttäytymisen ohjelmointiin, ainoat ohjeet, jotka reaktio toteuttaa, ovat ne, jotka sinä annat.

miksi pitäisi mennä Sellittömäksi?

koska soluttomilta järjestelmiltä puuttuu solukalvo, niillä on useita etuja soluekspressioon nähden.

• nopeammin – soluttomassa kokeessa ei ole pitkiä transformaatio-ja solukasvupäiviä. Tyypillinen soluton reaktio kestää tunteja, ei päiviä. Solujen sisäisten ja soluttomien nopeuksien ero kasvaa entisestään, kun eliöt työskentelevät monimutkaisilla tai optimoimattomilla muunnosprotokollilla tai pidemmillä viljelyajoilla. Soluton voi olla hyvä tapa prototyyppi geneettisiä osia uusia isäntäorganismeja, geneettisiä piirejä, ja jopa kokonaisia aineenvaihduntareittejä ilman integroida mitään geneettistä tietoa hankala isäntä.
• biokemiallisesti joustava – pienten molekyylien, metaboliittien ja entsyymien solunsisäiset pitoisuudet ovat kaikki hyvin säädeltyjä. Niiden pitoisuuksien virittäminen optimaalisen tuoton tai geneettisen järjestelmän suorituskyvyn saavuttamiseksi voi olla vaikeaa tai jopa näiden pitoisuuksien seuraamista. Sinulla on paljon enemmän kontrollia biomolekyylikoostumukseen soluttomassa järjestelmässä. Voit lisätä uusia cosolutes, tai jopa käyttää lipidi misellejä uudelleen kapseloida geenin ilmentymistä koneita, tutkia, miten nämä muutokset vaikuttavat geenin ilmentymistä.
• avoin – soluttomien järjestelmien avoimuus on hyödyllistä systeemikemiaa muokattaessa, mutta erityisen hyödyllinen se on sovelluksissa, jotka vaativat kommunikointia ulkopuolisen ympäristön kanssa, kuten aistimisessa. Tällä hetkellä on vaikea valmistaa solutunnistusalustoja, jotka reagoivat molekyyleihin, jotka eivät voi ylittää solukalvoa, kuten nukleiinihapot. Soluttomassa sensorijärjestelmässä tuota estettä ei ole olemassa, mikä mahdollistaa viruksen RNA: n kaltaisten molekyylien yksinkertaisen havaitsemisen.

…ja miksi ei?

solujen ja soluttomien ympäristöjen erot voivat johtaa eroavaisuuksiin kokeellisessa lähestymistavassa kahden ilmaisualustan välillä.

• ei (vielä) suuren läpimenokyvyn virtaussytometria ja NGS-pohjaiset geneettiset karakterisointikokeet ovat vakiintuneita solualustoille, jotka sopivasti pakkaavat geneettiset ohjeet yhteen ulostulonsa kanssa. Kymmeniätuhansia geenivariantteja voidaan seuloa funktioksi virtaussytometrialla ja / tai NGS: llä. Perinteisessä yksisoluttomassa kokeessa seulottavien varianttien määrä on useita suuruusluokkia pienempi kuin suuren läpäisykyvyn in vivo-määrityksissä.
• In vivo ei ole (välttämättä) yhtä suuri in vitro – huomaa, että soluttomat tulokset eivät välttämättä kuvaa suoraan In vivo-järjestelmän suorituskykyä tai edes muita soluttomia järjestelmiä. Systeemin komponenttien pitoisuuserojen vuoksi soluton ulostulo järjestelmien välillä on yleensä vertailukelpoista, mutta ei identtistä.
• se ei ole edullista suuren mittakaavan proteiinivalmisteille. Vaikka tuotot jopa 2.3 g/L proteiinia on raportoitu soluttomille järjestelmille, mikä tekee siitä kilpailukykyisen solupohjaisen ilmentymisen kanssa, tarvitset viljelmätilavuuden ~1000x soluttoman reaktiotilavuuden tilavuudesta. Tämä tarkoittaa, että se ei ole taloudellinen järjestelmä luoda suuria määriä rekombinantti proteiinia.

valitaan systeemi

prokaryootti tai eukaryootti, homebrewed tai commercial, crude extract-based or rekonstruoitu? Järjestelmän valinta riippuu erityistarpeistasi ja rajoituksistasi.

mitkä lajit? Jos et ole prototyyppien geneettisiä osia, tai tarvitse ilmaisukoneisto tietyn organismin, E. coli-pohjainen soluton järjestelmä pitäisi olla ensimmäinen valinta. Vanhin ja laajimmin käytetty soluttomien järjestelmien perhe, E. coli-järjestelmät on optimoitu luotettavaan geeniekspressioon ja korkean tuotoksen proteiinin tuotantoon.

menossa kaupalliseksi? Oman soluuutteen tuottaminen vaatii laitteita ja asiantuntemusta suurten solumäärien viljelemiseen ja lyseeraamiseen. Kourallinen toimittajia myy omia soluttomia järjestelmiään, jotka on johdettu malliorganismeista ja työjuhdan solulinjoista, mutta ne eivät ole halpoja. Odottaa maksaa vähintään $7 per reaktio, vs. senttiä per reaktio homebrewed järjestelmä.

raakaa vai rekonstruoitua? Useimmat soluvapaat ilmentymäjärjestelmät on tehty karkealla solulysaatilla, joka sisältää paljon enemmän entsyymejä kuin ydingeeniekspressiokoneisto. Tämä voi olla hyvä asia—nykyaikaiset E. coli-lysaattipohjaiset järjestelmät sisältävät esiliinoja ja suurimman osan keskusaineenvaihdunnasta, mikä lisää proteiinin saantia ja tuotteiden tiittereitä. Jos tietyn entsyymin aktiivisuus on poistettava kokonaan, REKOMBINANTTIELEMENTTEJÄ käyttävä rekonstruoitu järjestelmä, joka tunnetaan nimellä PURE (proteiinisynteesi), voi olla oikea vaihtoehto. Puhtaassa jokainen geeniekspressioon tarvittava proteiini puhdistetaan ja lisätään reaktioon, jolloin reaktiokoostumusta voidaan kontrolloida maksimaalisesti. Virtaviivaiset protokollat on äskettäin julkaistu taloudellisesti tuottaa molempia järjestelmiä, mutta voit myös ostaa pakki.

Yhteenvetona

Soluttomat järjestelmät ovat kapseloimattomia biosynteettisiä järjestelmiä, jotka ovat hyödyllisiä geneettisen järjestelmän nopeassa kehityksessä ja biotuotesynteesissä. Jos haluat nopeuttaa uuden biosynteettisen reitin kehittymistä, tutkia biokemiallista prosessia yksinkertaisemmassa järjestelmässä, tai haluat yksinkertaisemman tavan käyttää ilmentymäkoneistoa geneettisesti hankalasta isännästä, soluttomaksi meneminen voi olla oikea ratkaisu sinulle.

jatkolukemista

Dudley QM, Karim AS & Jewett MC. Cell-Free Metabolic Engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnol J. (2015) 10(1): 69-82. DOI: 10.1002 / biot.201400330

Garamella J, Marshall R, Rustad m & Noireaux V. the All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: a Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS synteettinen biologia (2016) 5(4):344-355. DOI: 10.1021 / acssynbio.5b00296

Thermo Fisher Scientific. Yleiskatsaus proteiinin ilmentymiseen. Proteiinibiologian Resurssikirjasto.

Shimizu Y, Kanamori T, Ueda T. protein synthesis by pure translation systems. Menetelmä. (2005) 36(3):299-304. DOI: 10.1016 / j.ymeth.2005. 04.006

Shoba. Soluttoman proteiinisynteesin Intro. Bitesize Bio. Maaliskuuta 2009.

Shoab. Ratkaistu: soluton proteiinisynteesi tuottaa heikosti. Bitesize Bio. Huhtikuuta 2009.