Pflanzenmaterialien und Wachstumsbedingungen

Wildtyp- und Mutantenpflanzen, die in dieser Studie verwendet wurden, gehörten alle zu den Col-0-Ökotypen mit Ausnahme der RGA–GFP-RGA-Linien10, die zum Ler-Ökotyp gehörten. PHYB9-Samen31 wurden vom Arabidopsis Biological Resource Centre bezogen. PIF4-Überexpresser-Linien und pif4-Knockout-Mutationen (slr2-Mutante) waren die in Ref. 3. Doppelte pif4-pif5-Mutanten wurden durch Kreuzung des pif4-101-T-DNA-Insertionsallels und der SALK-087012-Mutant18 mit einer Insertion in das PIF5-Gen erhalten. 20ox-Linien, die eine Knockout-T-DNA-Insertion in das AtGA20ox1-Gen (At4g25420) tragen, wurden von P. Hedden bereitgestellt. GA-unempfindliche Gai-Linien exprimierten das stabile GAI-Protein unter Kontrolle des 35S-Promotors. Doppel- und Dreifachmutanten wurden erzeugt, indem diese Linien gekreuzt und die Nachkommen durch PCR-Amplifikation oder Northern-Blot-Analysen genotypisiert wurden.

Die Samen wurden oberflächensterilisiert und auf gentechnisch veränderte Agarplatten ohne Sucrose32 ausgesät. Die Platten wurden 2 d bei 4 ° C kaltbehandelt und die Keimung wurde durch 3 h Bestrahlung mit weißem Licht und anschließende Inkubation im Dunkeln für 22 h synchronisiert, bevor sie auf die verschiedenen Wachstumsbedingungen übertragen wurden. Weißlichtgewachsene Keimlinge wurden bei 20°C unter Fluoreszenz-Weißlicht (Fluenzrate von 40-60 µmol m-2 s-1) mit einer 16 h Licht/8 h Dunkel Photoperiode gezüchtet. Für Rotlichtbehandlungen wurden Sämlinge unter kontinuierlichem Rotlicht gezüchtet (Fluenzrate von 35 µmol m-2 s-1, bereitgestellt von LEDs). Für dunkel gewachsene Sämlinge wurden die Platten in mehrere Schichten Aluminiumfolie eingewickelt. Die Platten wurden in vertikaler Ausrichtung platziert und mit der ImageJ-Software (http://rsb.info.nih.gov/ij) auf Hypokotyllänge gescannt. Für die PAC-Behandlung wurden Samen nach Induktion der Keimung auf Platten mit dem Inhibitor übertragen. Für jeden Versuchssatz wurden mindestens 20 Keimlinge gemessen.

Pflanzentransformation

Ein komplementäres DNA-Fragment, das den ORF von PIF4 in voller Länge enthält, wurde mit den Primern PIF4-GFPf und PIF4-GFPr amplifiziert, in den PENTR/D-TOPO-Vektor (Invitrogen) kloniert und in den PK7FWG2-Binärvektor (http://www.psb.ugent.be/gateway/) mit der LR-Clonase (Invitrogen) inseriert. Dieses binäre Konstrukt wurde in den Stamm pGV3101 von Agrobacterium eingeführt und in Wildtyp-Col-0- und phyB-Arabidopsis-Pflanzen unter Verwendung der Floral Dip-Transformationsmethode transformiert33. Transformanten wurden auf kanamycinhaltigem Medium selektiert und auf PIF4–GFP-Kernfluoreszenz analysiert. Homozygote Linien wurden für starke Expressoren ausgewählt.

GA-, PAC- und MG132-Behandlungen

GA3 (GA)- und Paclobutrazol (PAC)-Bestände wurden frisch in Ethanol hergestellt. Der Proteasom-Inhibitor MG132 wurde in DMSO gelöst. Für die MG132-Behandlung wurden Keimlinge für 2 h in einer 100 µM-Lösung des Inhibitors vorinkubiert. PAC- und GA-Behandlungen wurden bei 0,1 µM bzw. 50 µM durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die Empfindlichkeit gegenüber dem Inhibitor wurde als invertiertes Verhältnis der Reduktion der Hypocotyllänge berechnet, die bei Sämlingen beobachtet wurde, die in 0,1 µM PAC gezüchtet wurden, relativ zur Reduktion, die bei Col-0-Pflanzen beobachtet wurde (100%). Die Werte sind der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten. Die GA-Sensitivität wurde als Verhältnis der Zunahme der Hypocotyllänge von Sämlingen in 5,0 µM GA3 berechnet und wie zuvor auf Wildtyp-Col-0-Sämlinge bezogen.

Hefe-Zwei-Hybrid-Assays

HEFE-Repressoren werden in Kartoffeln durch mindestens zwei Gene kodiert, wobei das Transkript, das durch das exprimierte Sequenztag TC113247 repräsentiert wird, am häufigsten in vegetativen Geweben exprimiert wird. Der offene Leserahmen in voller Länge für dieses DNA-Protein wurde mit den Primern FPG1 und FPG2 amplifiziert und im Rahmen mit dem GAL4-BD in den pBridge-Vektor (Clontech) eingefügt. Um die Autoaktivierungsaktivität zu vermeiden, die mit diesem Konstrukt voller Länge verbunden ist, wurden N-end- (Reste 1 bis 188), F1- (Reste 1 bis 362), M5- (Reste 188 bis 588) und Cter- (Reste 362 bis 588) Konstrukte, die mit dem GAL4-BD fusioniert sind, durch Aufschluss an den einzigartigen SpeI- und EcoRI-Restriktionsstellen erhalten. Plasmide, die diese Konstrukte enthielten, der leere pBridge–Vektor (pGB) oder eine p53-GAL4BD-Fusion im pGBKT7-Vektor (Kontrolle) wurden in AH109-Hefezellen transformiert und auf SD -Trp- und SD -Trp -Ade -His-Platten plattiert, um auf basale Aktivierung zu testen (Ergänzende Abb. 1). Hefestämme, die die Konstrukte F1, M5 oder Cter enthielten, zeigten die niedrigste Hintergrundaktivität und wurden als Köder verwendet. Hefezellen, die diese Konstrukte enthielten, wurden mit einer komplementären DNA-Bibliothek aus Blattkartoffeln transformiert, die mit dem GAL4-AD im pAD-GAL4-Vektor (Stratagene) fusioniert war, und 1-3 × 106 unabhängige Transformanten wurden auf SD -Leu -Trp -Ade -His für eine positive Interaktion ausgewählt.

Ein DNA-Fragment, das dem Arabidopsis-PIF4-Volllängenprotein entspricht, wurde durch PCR-Amplifikation mit den Primern PIF4yf und PIF4yr erzeugt und in die EcoRI-Stelle der Hefe-pGBKT7- und pGADT7-Vektoren inseriert. Konstrukte für die Arabidopsis PIF3-GAL4BD und PIF3–GAL4AD Fusionen wurden von P. Quail zur Verfügung gestellt.

Deletionskonstrukte für die DELLA– und PIF4–Proteine wurden durch inverse PCR-Reaktion an den RGA-BD- und PIF4-AD-Konstrukten in den pBridge- und pAD-GAL4-Vektoren erhalten. Die Konstrukte del1RGA und del2RGA wurden unter Verwendung der Primer RGAdel1 oder RGAdel2 und pBridBam erzeugt, die an jedem Ende eine BamHI-Restriktionsstelle einführen. Um die Konstrukte del1PIF4, del2PIF4 und del3PIF4 zu generieren, wurde die eindeutige XbaI-Site im pAD-GAL4-Polylinker per Fill-in gelöscht. Dieses Plasmid wurde dann als Vorlage für inverse PCR-Reaktionen mit Primern PIF4del1, PIF4del2 oder PIF4del3 und pGADXba verwendet, wobei an jedem Ende eine XbaI-Restriktionsstelle eingeführt wurde. PCR-Produkte wurden entweder mit BamHI oder XbaI verdaut, religiiert und in Escherichia coli transformiert, um die verschiedenen Konstrukte zu erhalten. Diese Plasmide wurden in den AH109-Hefestamm transformiert und auf SD-4-Platten plattiert, um auf Wechselwirkung zu testen. die β-Galactosidase-Aktivität wurde an Flüssigkulturen dieser Transformanten unter Verwendung des ONPG-Substrats und Standardprotokollbedingungen bestimmt.

Konstrukte, die dem Kartoffel-RGA-M5-Fragment für die Arabidopsis DELLA Gene RGA1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) und RGL3 (At5g17490)äquivalent sind, wurden durch PCR-Amplifikation mit den Primersätzen RGL1pGB-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r, RGApGB-f /RGApGB-r und RGApGB-f/GAIpGB- r (ergänzende Tabelle 1). Diese Fragmente wurden unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI/SalI für RGL1, SalI/PstI für RGL3 und BamHI/PstI für RGA1 und GAI in den Hefe-Vektor pGBKT7 inseriert.

Pull-Down-Assays

Ein DNA-Fragment, das für das Arabidopsis RGA-Volllängenprotein kodiert, wurde durch PCR-Amplifikation mit den Primern RGGST-f und RGGST-r erhalten und in die BamHI-Stelle des pZEX-Vektors kloniert, um eine In-Frame-Fusion mit der GST-kodierenden Region zu erhalten. Der RGA-pZEX und der PZEX-Vektor wurden in den E. coli-Stamm BL21(DE3)pLysS (Stratagene) transformiert und Kulturen dieser Zellen bei 37°C auf einen D600 = 0,8 gezüchtet. Die Expression der GST-Proteine wurde mit 1 mM IPTG für 3 zusätzliche Stunden bei 30 ° C induziert und die Proteinextraktion und Bindung an Gluthathion-Sepharose-Beads (Clontech) wurde gemäß dem vom Hersteller gelieferten Protokoll durchgeführt.

Die PIF4-, PIF3- und carboxyterminalen phyA-Konstrukte im pGBKT7-Vektor wurden als Templates für die in vitro Transkription/Translation in Gegenwart von 35S-Methionin unter Verwendung des TnT-Systems (Promega) verwendet. Plasmid-DNA (1 µg) wurde in jeder Reaktion verwendet. Zum Pull-Down wurden 10 µl der Translationsreaktionen für 30 min mit den RGA–GST und GST Beads (1 µg an die Beads gebundenes Protein) in PBS, 0,05% Tergitol, 10% Glycerin inkubiert. Die Beads wurden gründlich gewaschen, in 2×2 Puffer resuspendiert und mittels SDS–PAGE auf Proteinbindung analysiert.

Transiente Expressionstests

DNA-Fragmente, die die Arabidopsis-PIF4- und RGA-Proteine in voller Länge kodieren, und die ΔRGA- und del1RGA-Deletionen wurden durch PCR-Amplifikation mit Primerpaaren PIF4yf und PIF4yr, RGGST-f und RGGST-r, ΔRGA-f und RGGAST-r und del1RGA-f und RGGST-r erhalten und in die Polilynker-EcoRI- oder BamHI-Stellen der pJIT60-Vektor, unter der Kontrolle des 2 × 35S-Promotors. Ein G-Box-Motivfragment, von dem durch Gel-Shift-Assays berichtet wurde, dass es ein Zielelement für die PIF4-Erkennung34 ist, wurde mit dem GUS-Reportergen fusioniert und als Reporterkonstrukt verwendet. Wir konnten keine PIF4-vermittelte Stimulation dieses Reporterkonstrukts nachweisen, was darauf hindeutet, dass zusätzliche Nukleotidsequenzen, die das CACGTG-Motiv umgeben, für eine effiziente Aktivierung erforderlich sein könnten. Um nach einem Promotorelement zu suchen, das für diese Assays geeignet ist, wurden vorläufige RNA-Profilierungsexperimente von 35S-PIF4- und PIF4-Mutanten durchgeführt, wodurch LTP3 (At5g59320) als stark hochreguliertes Transkript in 35S-PIF4-Sämlingen identifiziert wurde. Die Promotorregion für dieses Gen wurde unter Verwendung der Primer LT3p-f und LTP3p-r amplifiziert und in die EcoRI- und BamHI-Stellen des pGUS-Vektors eingefügt, um das LTP3-GUS-Reporterkonstrukt zu erhalten. Die 2×35S-Luciferase-Fusion wurde als interne Kontrolle verwendet. Arabidopsis-Zellen wurden auf Filterpapier ausgebreitet und über Nacht auf LT87-Medium (4,4 g l-1 Murashige und Skoog Salze + Vitamine, 0,5 g l-1 MES, 0,5 g l-1 NAA, 30 g l-1 Saccharose, 8 g l-1 Agar) inkubiert. Zwei Stunden vor dem Beschuss wurden Filter auf LT87-Medium mit 200 mM Mannitol übertragen, um eine Vakuolenretraktion zu induzieren. Die DNA-Fällung und der Teilchenbombardement wurden unter Verwendung eines heliumgetriebenen Teilchenbeschleunigers (PDS-1000; Bio-Rad) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Zellen wurden mit 0,5 µg des LTP3-GUS Reporterplasmids + 0,5 µg des internen Standards 2×35S-LUC transformiert, und entweder 2 µg des leeren Vektors pJIT60 (LTP3), 1 µg des Effektorkonstrukts 2×35S-PIF4 + 1 µg pJIT60 (PIF4) oder 1 µg von jeweils 2×35S-PIF4 und 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA oder 2×35S-del1RGA Effektorkonstrukte (PIF4 + RGA, PIF4 + ΔRGA, PIF4 + del1RGA). Die Filter wurden auf frische LT87-Platten (-GA) oder auf LT87-Platten + 50 µM GA3 (+GA) überführt und 16 h inkubiert. Die Zellen wurden in dem im Luciferase Assay System Kit (Promega) bereitgestellten Zelllysepuffer extrahiert und durch Zentrifugation bei 12.000g für 5 min geklärt. Die LUC-Aktivität wurde nach dem Kit und die GUS-Aktivität nach dem fluorometrischen Assay bestimmt35. Die LTP3-Promotoraktivität wurde als Verhältnis von GUS zu LUC-Aktivität in jeder Probe berechnet. Für jede Behandlung wurden vier Replikatplatten verwendet.

RNA–Extraktionen und Reverse Transkriptase (RT)-PCR

Für Genexpressionsanalysen wurde Gesamt-RNA aus 4 Tage alten Sämlingen mit der Guanidin-HCl-Methode36 extrahiert und anschließend mit DNaseI (Roche) behandelt, bevor sie durch Qiagen RNeasy Mini-Säulen (Qiagen) gereinigt wurde. RNA (1 µg) wurde für die Erststrang-cDNA-Synthese unter Verwendung des High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) verwendet und 1,0 µl dieser Reaktion wurden als Template für die PCR-Amplifikation verwendet. Zur Amplifikation der Transkripte LTP3 (At5g59320), β-expansin (At2g20750) und actin-8 (At1g49240) wurden Primersätze AtLTP3-f/AtLTP3-r, Atexpan-f/Atexpan-r und Atactin8-f/Atactin8-r verwendet.

Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC)-Assays

Offene Leserahmensequenzen in voller Länge für die Arabidopsis-Proteine PIF4 und RGA wurden mit den Primern PIF4YFP-f/PIF4YFP-r bzw. RGAYFP-f/RGAYFP-r amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in den pENTR/D-TOPO-Vektor (Invitrogen) kloniert und durch LR-Reaktion (Invitrogen) in die binären pBiFC-Vektoren (F. Parcy) enthaltend die amino- oder C-terminalen Fragmente des fluoreszierenden Proteins eYFP (eYFPN und eYFPC). Alle acht möglichen paarweisen Kombinationen dieser Konstrukte wurden in Agrobacterium tumefaciens transformiert und wie beschrieben in die abaxiale Oberfläche von 2-3 Wochen alten Nicothiana benthamiana-Pflanzen koinfiltriert37. Das p19-Protein des Tomato Bushy Stunt Virus wurde verwendet, um das Gen-Silencing zu unterdrücken. Agrobacterium-Stämme, die die pBiFC-Konstrukte und das p19-Silencing-Plasmid enthielten, wurden bei einem D600-Verhältnis von 0,7:0,7:1 für die Infiltration verwendet. Die Fluoreszenz wurde in epidermalen Zellschichten der Blätter nach 2 Tagen Infiltration unter Verwendung eines Leica DMR-Fluoreszenzmikroskops sichtbar gemacht. Blätter wurden mit 1 µg ml-1 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) zur Keimfärbung inkubiert.

PIF4/RGA–GFP Co-Immunopräzipitationen

Co-Immunopräzipitationsstudien der RGA- und PIF4-Proteine wurden an 7 Tage alten transgenen RGA-GFP–RGA-Sämlingen10 durchgeführt, die unter weißem Licht gezüchtet wurden. Sämlinge wurden entweder in Dunkelheit inkubiert oder in PAC- oder GA-haltiges Medium überführt und vor der Extraktion weitere 12 Stunden inkubiert. Die Immunpräzipitation des GFP-RGA-Proteins erfolgte bei 4°C für 6 h unter Verwendung eines Anti-GFP-Antikörpers (Santa Cruz Biotechnology) in einem Puffer enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, PMSF (1 mM) und Proteaseinhibitoren (Sigma). Zur Ausfällung der Immunoproteinkomplexe wurde Protein-G-Agarose (Sigma) verwendet. Der PIF4-Nachweis wurde mit einem Anti-PIF4-Antikörper durchgeführt.

Chromatinimmunpräzipitationen und PCR-Amplifikationen

Chromatinimmunpräzipitationstests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt29. PIF4-HA-Sämlinge20 wurden auf GM-Medium für 6 Tage unter kontinuierlichem rotem Licht gezüchtet und dann auf Platten, die entweder GA oder PAC enthielten, übertragen und über Nacht im Dunkeln gehalten. Sämlinge (1,5–2 g) und 40 µl der Anti-HA-Affinitätsmatrix (Roche) wurden zur Chromatinimmunpräzipitation verwendet. Gefällte DNA wurde in 50 µl TE gelöst und 0,5 µl zur PCR-Amplifikation mit den in ergänzender Tabelle 1 aufgeführten Primern verwendet. PCR-Bedingungen waren wie folgt: 94 ° C für 2 min, 35 Zyklen von 94 ° C für 15 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s, gefolgt von 72 ° C für 7 min. Beschallte Eingangs-DNA (0,3%) wurde für eine quantitative Kontrolle verwendet. Western-Blot-Analysen wurden durchgeführt, um die Menge des zurückgewonnenen PIF4-Proteins nach Chromatinimmunpräzipitation zu quantifizieren. Blots wurden mit einem Anti-HA-Peroxidase-Hochaffinitätsantikörper (Roche) immunodetektiert.

Mikroskopie

Protein-Stabilitäts-Assays wurden mit dem Radiance 2100 (Bio-Rad) Laser-Scanning-System in Verbindung mit einem Zeiss Axiovert 200 Mikroskop durchgeführt. Für die GFP- und Chlorophyllanregung wurden ein Argonionenlaser bei 488 nm Wellenlänge und eine rote Diode bei 637 nm verwendet. Die Kombination der verwendeten Filter war: 560 DCLPXR Strahlteiler und HQ 515/30 Emissionsfilter für GFP und HQ 660LP für Chlorophylldetektion. Die Bilder wurden nacheinander mit der Software LaserSharp v5.0 (Bio-Rad) aufgenommen und mit der Bildsoftware LaserPix v.4 (Bio-Rad) zusammengeführt.

Gel-Shift-Assay

Die Oligonukleotide pLTP-WTf/ r und pLTP-MUTf/r wurden zur Erzeugung der LTP3-Sonden und spezifischen Konkurrenten verwendet, die in EMSA-Assays verwendet wurden. Oligonukleotide wurden in 5×M Restriktionsenzypuffer getempert und durch Fill-in mit Klenow endmarkiert. Für Proteinextrakte, N. benthamiana-Blätter wurden mit den Agrobacterium-Stämmen für die Konstrukte 35S–PIF4-HA (PIF4) und 35S–RGA-GFP (RGA) oder mit einer 1:1-Mischung (PIF4 + RGA) dieser Stämme und mit dem p19-Konstrukt wie oben beschrieben infiltriert. Blattextrakte wurden erhalten durch Homogenisierung in Hochsalzpuffer (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0,5% nonidet P-40, 1 mM DTT, + Proteaseinhibitor), Clearing durch Zentrifugation und anschließende Dialyse gegen 1× BB (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,1 M KCl, 1 mM EDTA, 0,05% nonidet P-40, 0,5 mM DTT, 10% Glycerin). Das Vorhandensein äquivalenter Mengen an PIF4- und RGA-Proteinen in den Extrakten wurde durch Western-Blot-Nachweis mit Anti-HA- (Roche) und Anti-GFP- (Santa Cruz) Antikörpern beurteilt. Zunehmende Mengen dieser Extrakte (5,0, 10,0, 15,0 µl) wurden für die EMSA-Reaktion verwendet. Extrakte wurden für 15 min bei Raumtemperatur mit der markierten Sonde und 100 ng Poly (dI-dIC) in 20 µl 1× BB inkubiert und durch 6% PAGE in 0,5× TBE getrennt. Ein 100-facher Überschuss an Wildtyp- (WT) und Mutanten- (MUT) getemperten Oligonukleotiden wurde für die spezifische Konkurrenz verwendet.