en fuldstændig forståelse af RNA-molekylers funktion kræver viden om deres højere ordensstrukturer (2D og 3D) samt egenskaberne ved deres primære sekvens. RNA-struktur er vigtig for mange funktioner, herunder regulering af transkription og translation, katalyse, transport af proteiner på tværs af membraner og regulering af RNA-vira. Forståelserne af disse funktioner er vigtige for grundlæggende biologi såvel som for udviklingen af medikamenter, der kan gribe ind i tilfælde, hvor patologisk funktionalitet af disse molekyler forekommer.

vores gruppe gør forskning og udvikling af metoder til forbedring af RNA foldning og analyse teknikker til at hjælpe yderligere vores forståelse af de funktionelle egenskaber af disse molekyler. Derudover fokuserer vi på det nye felt af RNA nanobiologi. RNA repræsenterer et relativt nyt molekylært materiale til udvikling af biologisk orienterede nanoenheder. Det er et interessant materiale på grund af dets naturlige funktionaliteter, dets evne til at folde ind i komplekse strukturer og selvmontere. Vi har udviklet beregningsmæssige og eksperimentelle metoder, der tillader design af RNA-baserede nanopartikler, der potentielt har en række anvendelser. Således dækker vores forskning på RNA fem stærkt relaterede og integrerede forskningsområder:

1. forskning i algoritmer til RNA sekundær struktur forudsigelse og analyse;
2. RNA biologi og dets forhold til sekvens og sekundær struktur foldningsegenskaber;
3. forskning i algoritmer til RNA 3D struktur forudsigelse og analyse og deres anvendelse på RNA biologi;
4. forskning i algoritmer til design og analyse af RNA nanopartikler;
5. eksperimentelt design, syntese og levering af RNA-baserede nanopartikler.

det, der læres på et område, anvendes på de andre områder, hvilket forbedrer vores forståelse af RNA-struktur, funktion og RNA-nanobiologi og selvmontering.

Parallel Computational Biology and RNA Structure
revolutionære ændringer i computational paradigmer er nødvendige for at opretholde den nødvendige beregningskraft til at løse problemer i Molekylærbiologi. Metoder baseret på sekventielle computerarkitekturer kunne ikke forventes at holde trit med de nødvendige beregningshastigheder. For at imødekomme de høje hastigheder, der er nødvendige, anvendes der nu meget parallelle beregningsteknikker. Vores gruppe var en af pionererne inden for beregningsbiologi og brugen af parallelle højtydende computerarkitekturer til denne bestræbelse.

Beregningsteknikker til RNA sekundær struktur forudsigelse og analyse
vi var de første til at udvikle en RNA-foldeteknik, der bruger begreber fra genetiske algoritmer. Vores algoritme, MPGAfold, blev oprindeligt udviklet til at køre på en massivt parallel SIMD supercomputer, en MasPar MP-2 med 16384 processorer. Denne algoritme blev ændret og kører nu på parallelle højtydende linuksklynger. Ekstraordinære skaleringsegenskaber opnås med evnen til at køre algoritmen med hundreder af tusinder af befolkningselementer. RNA pseudoknot forudsigelse er en del af den genetiske algoritme, hvilket resulterer i dets evne til at forudsige tertiære interaktioner. Andre funktioner inkluderer simulering af co-transkriptionel foldning, evnen til at inkorporere forskellige energiregler og tvungen hæmning og indlejring af ønskede spiralformede stængler. Derudover kan STRUCTURELAB, vores heterogene bioinformatiske RNA-analysebænk, bruges sammen med MPGAfold og RNA2D3D til at producere forudsagte 3D-atomkoordinater for RNA-strukturer sammen med visualiseringen af disse strukturer. Vi udviklede også en ny interaktiv visualiseringsmetode, der er en del af STRUCTURELAB. Denne teknik muliggør sammenligning og analyse af multiple sekvens RNA-folder fra et fylogenetisk synspunkt, hvilket muliggør forbedring af forudsagte strukturelle resultater på tværs af en familie af sekvenser.
Vi udviklede KNetFold, en ny og kraftfuld algoritme til RNA-struktur forudsigelse fra sekvensjusteringer. Algoritmen bruger et unikt hierarkisk klassificeringsnetværk baseret på gensidig information, termodynamik og Baseparrethed til at forudsige strukturer. Derudover har vi udviklet en internetbaseret applikation, CorreLogo, der bruger gensidig information afledt af RNA-sekvensjusteringer til at bestemme kovariationer blandt baseparrede positioner. Algoritmen indeholder en unik fejlmåling og viser resultater i 3D.
Vi udviklede, CyloFold, en unik algoritme til at forudsige, fra en enkelt sekvens, RNA sekundære strukturer, der kan omfatte pseudoknots. Denne algoritme bruger en ny teknik, der tilnærmer potentialet for 3D steriske sammenstød i de forudsagte strukturer og filtrerer således disse strukturer ud fra overvejelse. Algoritmen har vist sig at have høj nøjagtighed sammenlignet med andre algoritmer af sin type.baseret på en bayesisk statistisk tilgang, der estimerer nøjagtigheden af basepardannelse ud fra data afledt af form (selektiv 2′ – Hydroksylacylation analyseret ved Primerforlængelse) eksperimenter. De statistiske / probabilistiske resultater blev afledt ved at analysere kendte RNA 3D-strukturer med forskellige typer kendte basisinteraktioner og korrelere dem med FORMVÆRDIER. Det blev vist, at lave FORMVÆRDIER korrelerer godt med parring og stablingsinteraktioner med lav form, mens høje FORMVÆRDIER indikerer enkeltstrengede regioner. Forbedringer kunne ses, hvis der også blev taget højde for en 2 eller 3 basiskontekst. Vi viste også, at andre typer kendte interaktioner ikke korrelerede godt. Denne type information er nyttig til i sidste ende at bestemme den sekundære struktur af RNA ‘ er.

Beregningsundersøgelser af RNA-Foldeveje
RNA-foldeveje viser sig at være ret vigtige i bestemmelsen af RNA-funktion. Undersøgelser viser, at RNA kan indtaste mellemliggende konformationstilstande, der er nøglen til dens funktionalitet. Disse tilstande kan have en betydelig indvirkning på genekspression. Det er kendt, at de biologisk funktionelle tilstande af RNA-molekyler muligvis ikke svarer til deres minimale energitilstand, at der kan eksistere kinetiske barrierer, der fanger molekylet i et lokalt minimum, at foldning ofte forekommer under transkription, og der findes tilfælde, hvor et molekyle vil overgå mellem en eller flere funktionelle konformationer, inden det når sin oprindelige tilstand. Således er metoder til simulering af foldeveje for et RNA-molekyle, herunder co-transkriptionel foldning, og lokalisering af signifikante mellemtilstande vigtige for forudsigelsen af RNA-struktur og dens tilknyttede funktion. Flere biologiske RNA-foldeveje er blevet undersøgt med succes ved hjælp af MPGAfold og STRUCTURELAB. Eksempler inkluderer kartoffelspindelknold viroid, værtsdrabningsmekanismen for Escherichia coli plasmid R1, hepatitis delta-virus, HIV og dengue-virus. Disse beregningsresultater er i overensstemmelse med dem, der stammer fra biologiske eksperimenter. Ud over, nye strukturelle interaktioner og vigtige funktionelle mellemliggende og indfødte stater er blevet forudsagt. Disse har ført til yderligere vellykkede bekræftende eksperimenter.vi har også udviklet programmer CovaRna og CovStat til at udforske langtrækkende co-varierende RNA-interaktionsnetværk ved hjælp af hele genomjusteringer. Denne nye metode, der blev anvendt på Drosophila-genomer, anvendes i øjeblikket på andre genomer. En parallel version af programmet blev udtænkt for at fremskynde behandlingen, og algoritmerne er også afhængige af hurtige indekseringsordninger og konservative statistiske metoder til at bestemme meget signifikante interaktioner. Metoden har fundet interessante interaktioner, der er relateret til endogene sirna ‘ er, gentransport og gener relateret til morfogenese.Beregningsundersøgelser af tredimensionelle RNA-strukturer nogle strukturelle elementer af RNA-molekyler er blevet undersøgt ved hjælp af molekylær mekanik og molekylær dynamik simuleringer. De undersøgte strukturer inkluderer en RNA-tetraloop, hvor temperaturafhængig denaturering af tetraloop og den efterfølgende refolding til den oprindelige krystalstruktur blev udført. Et trevejskryds fra det centrale centrale domæne i 30s ribosomal underenhed fra Thermus thermophilus blev udforsket. Det er eksperimentelt bestemt, at de intermolekylære interaktioner mellem trevejskrydset og S15 ribosomalproteinet initierer processen med samlingen af 30s ribosomal underenhed. Ved at bruge molekylære dynamiksimuleringer opnåede vi indsigt i konformationsovergange af krydset forbundet med bindingen af S15. Vi bestemte ved hjælp af molekylære dynamiksimuleringer de strukturelle virkninger af at anvende nye typer modificerede RNA-nukleotider indeholdende carbocykliske sukkerarter, der er begrænset til nord-eller sydkonformationer (C2′ eller C3’ ekso). Derudover viste vi ved hjælp af molekylær dynamik simuleringer, hvordan ioner og flankerende baser spiller en meget vigtig rolle i human immunodeficiency virus (HIV) kysse loop monomer konformationer. Disse resultater korrelerer godt og kan forklare i detaljer eksperimentelle undersøgelser, der angiver betydningen af ioner for HIV-1-dimerisering.

Vi har også undersøgt pseudoknot-domænet for telomerase. Molekylær modellering og molekylær dynamik i pseudoknot-domænet, inklusive dets hårnålsløjfe, blev udført. Resultaterne viste, hvordan hårnålsløjfedynamikken påvirkede åbningen og lukningen af de ikke-kanoniske U-u-basepar, der findes i stammen. Åbningen foreslog nukleationspunkter for dannelsen af pseudoknoten. Vi har også undersøgt effekten af dyskeratosis congenita (DKC) mutationer i sløjfen, og hvordan de reducerede tilbøjeligheden til åbningen af stammen ved at danne et relativt stabilt hydrogenbindingsnetværk i hårnålsløjfen. Vi modellerede pseudoknoten selv ved hjælp af vores rna2d3d-program kombineret med fylogenetisk analyse. Vi studerede den dynamiske virkning af DKC-mutationerne på pseudoknoten med det resultat, at pseudoknoten blev ustabil, mens hårnåleformen blev mere stabil.

vi opdagede og belyste 3D-strukturer af nye typer translationsforstærkere, der findes i 3′ UTR ‘ erne af majroe Crinkle-virussen (den første af sin art fundet) og Pea enation Mosaic Virus. Opdagelsen af disse strukturelle elementer har afsløret nye mekanismer til translationel forbedring i eukaryote plantevirus, der kan have bredere konsekvenser for forståelsen af translationelle mekanismer generelt. Dette blev opnået med den kombinerede brug af MPGAfold, vores 3D molekylære modelleringsprogram RNA2D3D og tætte interaktioner med vores eksperimentelle samarbejdspartnere. Vi modellerede også en roman pseudoknot fundet i CCR5 mRNA. Denne pseudoknot er involveret i frameshifting og ser ud til at være stabiliseret af en microRNA, en ny funktion for en microRNA.
derudover har vi anvendt metoder baseret på elastisk netværksinterpolation for at reducere beregningsomkostningerne i forbindelse med RNA 3D-dynamik. Tredimensionelle dynamikbaner kan bestemmes ved hjælp af en reduceret atomrepræsentation og givet konformationstilstande. Beregningstiden kan reduceres fra uger til timer ved hjælp af denne tilgang.RNA NANOBIOLOGI repræsenterer en ny modalitet til udvikling af nanodevices, der har potentiale til anvendelse på en række områder, herunder terapeutiske midler. På baggrund af vores erfaring som beskrevet ovenfor udviklede vi flere beregnings-og eksperimentelle teknikker (se nedenfor), der giver et middel til at bestemme et sæt nukleotidsekvenser, der kan samles i ønskede nanokomplekser. Et af disse værktøjer er en relationsdatabase kaldet Rnajunktion. Databasen indeholder struktur-og sekvensinformation for kendte RNA-spiralformede kryds og kyssesløjfeinteraktioner. Disse motiver kan søges efter på forskellige måder, hvilket giver en kilde til RNA nano byggesten. Et andet beregningsværktøj, NanoTiler, tillader en bruger at konstruere specificerede RNA-baserede nanoskalaformer. NanoTiler giver en 3D grafisk visning af de objekter, der designes, og giver midlerne til at arbejde interaktivt eller med computerskripter på designprocessen, selvom de nøjagtige RNA-sekvenser muligvis endnu ikke er specificeret, og en all-atom-model ikke er tilgængelig. NanoTiler kan bruge de 3d-motiver, der findes i rnajunktionsdatabasen med dem, der stammer fra specificerede RNA-sekundære strukturmønstre til at opbygge en defineret RNA-nanoform. En kombinatorisk søgning kan også anvendes til at opregne strukturer, der normalt ikke ville blive overvejet.et andet værktøj til RNA-nanostrukturdesign er NanoFolder, som er et af de få værktøjer, der er i stand til at forudsige strukturen og sekvensattributterne for MULTISTRENGEDE RNA-konstruktioner. Med dette program er det muligt at specificere de ønskede sekundære strukturmotiver og få programmet til at forudsige det sæt sekvenser, der genererer disse ønskede motiver med de korrekte intra – og inter-streng foldeegenskaber.baseret på de ovenfor beskrevne beregningsmetoder til RNA nanodesign har vi demonstreret evnen til eksperimentelt selvmontering og funktionalisering af flere RNA-baserede nanopartikler. Dette blev opnået med tætte interaktioner mellem de eksperimentelle og beregningsmæssige tilgange, der førte til forbedringer af begge sæt metoder. Eksempler inkluderer selvmontering af 6 og 10 strandede terninger; selvmontering af sekskantede ringe i forskellige størrelser og dobbeltringe ved hjælp af et RNA-motiv ekstraheret fra naturen; modifikationen af sekvenser i motivet for at forbedre udbyttet og samtidig opretholde passende geometrier; og selvmontering af trekantede strukturer. Vi udviklede også teknikker, der definerer selvmonteringsprotokoller, og som muliggør co-transkriptionel samling af konstruktioner, der også kan omfatte modificerede baser for at øge den kemiske stabilitet af disse nanopartikler. Derudover har vi funktionaliseret disse partikler med op til seks forskellige sirna ‘ er for at muliggøre kontrolleret støkiometri og genhæmning og viste, at disse partikler faktisk tavler de udpegede gener, når de transficeres til forskellige cellelinjer.

vi har også udforsket et andet paradigme baseret på brugen af RNA/DNA hybrid nanokonstruktioner indeholdende split funktionaliteter. Dette tillader for eksempel opdeling af et Diceable siRNA i to DNA/RNA-hybridkomponenter med DNA-tåhold, som, når de transficeres til celler, samles igen i en DNA-dupleks og en Diceable siRNA. Denne hybrid tilgang er blevet indarbejdet i vores sekskantede nanoringer og nanocubes. Nytten af denne tilgang tillader blandt andet kontrolleret aktivering af funktionaliteter, inkorporering af molekylære beacons på DNA-strengene uden intefering med RNA-funktionalitet og modstand mod nuklease nedbrydning. Denne tilgang er blevet forsøgt med succes i cellekulturer og fremmedgjorte tumormusemodeller.
mange af beregningssystemerne er tilpasset andre miljøer inden for og uden for vores laboratorium og NIH og er tilgængelige via vores hjemmeside på http://www-CCRNP.ncifcrf.gov/~bshapiro.