Buněčné Membrány: Požehnání i Prokletí

buněčná membrána obklopuje cytosolu hemží organely, nestabilní molekuly, enzymy, a genetické informace – vše potřebné pro metabolismus a replikaci. Ale také zabraňuje všemu, co by destabilizovalo jemnou, dynamickou rovnováhu života.

zatímco membrána je nezbytná pro buňku, je často také nepříjemností pro biologické inženýry. Příprava buněk přijmout cizí DNA, získání DNA přes buněčnou membránu, a začlenit nové instrukční sady do organismu genomu jsou časově náročné a pracné úkoly. A vědci se stále více zajímají o rozšíření našeho repertoáru hostitelských organismů na exotičtější druhy, kterým chybí zjednodušené transformační protokoly.

většina procesů produkce a metabolismu bílkovin nemá žádný zásadní požadavek na zapouzdření. Pokud pro vaši aplikaci není vyžadována žádná buňka, tak proč se obtěžovat?

bezbuněčné expresní systémy, které odvádějí expresi z buňky do zkumavky, jsou řešením tohoto zdánlivě neřešitelného problému.

Tyto systémy mohou být použity k zodpovězení základních biologických otázek, jako je studium exprese v „prvobuňky“. Jsou stejně užitečné pro rychlé prototypování genetických a metabolických systémů: například rychlá optimalizace metabolických drah pro maximalizaci titrů produktu. Mohou být dokonce použity jako on-demand biosensing a biomanufacturing platformy. Pokud máte zájem dozvědět se více o tom, co jsou systémy bez buněk, proč jsou užitečné a jak můžete začít, čtěte dál!

dát vše (zpět) dohromady

jaké komponenty jsou potřebné pro překlad, aby se vyskytly mimo buňku? Všechny systémy exprese proteinů bez buněk obsahují alespoň tyto tři části.

1. translační stroje. To zahrnuje ribozomy a tRNAs, stejně jako zahájení, protažení a uvolnění faktory potřebné pro překlad, a aminoacyl tRNA synthetases účtovat tRNAs s jejich příbuzný aminokyselin.
2. energie. GTP a ATP pro napájení translačního prodloužení a nabíjení tRNA. Cukry, fosforylované glycolytic meziprodukty nebo jiné fosforylované sloučeniny jsou používány jako zdroje energie se ujistěte, že vysoké koncentrace nukleotid trifosfáty jsou udržovány v průběhu reakce, která může trvat až několik hodin.
3. messengerová RNA, která má být přeložena. To může být produkovány mimo buňky-free reakce pomocí in vitro transkripce T7, nebo v buňce-bez reakce přidáním templátu DNA a NTPs a buď pomocí T7 RNA polymerázy nebo nativní polymerázové přítomen ve buněčného lyzátu.

systémy bez buněk rekapitulují translaci a často transkripci a centrální metabolismus mimo buňku. Je však důležité si uvědomit tři hlavní rozdíly mezi systémy bez buněk a buněčnými systémy.

1. rozčlenění a prostorová organizace. Bezbuněčné expresivní systémy postrádají bariéru mezi biochemickým reakčním systémem a okolním prostředím, stejně jako bariéry mezi funkčně odlišnými kompartmenty. Všechny biochemické reakce v bezbuněčných systémech probíhají v homogenním prostředí.
2. ředění. Systémy bez buněk jsou z hlediska jejich makromolekulárního obsahu řádově zředěnější než buňky. Nejen, že jsou koncentrace genové exprese stroje nižší, ale stupeň makromolekulární shlukování je nižší, stejně, které mohou ovlivnit biochemické reakce sazby a rovnováhy.
3. genom. Chromozomální DNA je trávena nebo purifikována z bezbuněčných systémů. Protože systémy bez buněk postrádají genom pro programování chování, jediné pokyny, které reakce provede, jsou ty, které poskytnete.

proč byste měli jít bez buněk?

protože systémy bez buněk postrádají buněčnou membránu, mají oproti buněčné expresi několik výhod.

• rychleji-v experimentu Bez buněk nejsou žádné dlouhé dny transformace a růstu buněk. Typická reakce bez buněk trvá hodiny, ne dny. Rozdíl v rychlosti mezi v-buňka a buňka-free se stává ještě větší při práci v organismech s komplexní nebo neoptimalizovaných transformace protokolů, nebo delší kultury krát. Cell-free může být skvělý způsob, jak prototyp genetické dílů pro nové hostitelské organismy, genetické obvody, a dokonce i celé metabolické dráhy, aniž by museli zahrnout veškeré genetické informace do neřešitelné hostitele.
• biochemicky flexibilní-intracelulární koncentrace malých molekul, metabolitů a enzymů jsou vysoce regulovány. Může být obtížné naladit jejich koncentrace pro optimální výnos nebo výkon genetického systému, nebo dokonce sledovat, jaké jsou tyto koncentrace. Máte mnohem větší kontrolu nad biomolekulárním složením v systému bez buněk. Můžete přidat román cosolutes, nebo dokonce použít lipidových micel, aby re-zapouzdření genové exprese stroje, zjistit, jak tyto změny dopad na genovou expresi.
• Open-otevřenost systémů bez buněk je užitečná při modifikaci systémové chemie, ale je zvláště užitečná pro aplikace, které vyžadují komunikaci s vnějším prostředím,jako je snímání. V současné době je obtížné inženýr buněčné snímání platforem, které reagují na molekuly, které nemohou přes buněčnou membránu, stejně jako nukleové kyseliny. V bezbuněčném snímacím systému tato bariéra neexistuje, což umožňuje jednoduchou detekci molekul, jako je virová RNA.

…a proč byste neměli?

rozdíly mezi prostředím bez buněk a buněk mohou vést k rozdílům v experimentálním přístupu mezi dvěma expresními platformami.

• (zatím) high-propustnost – High-propustnost flow-cytometrie a NGS-na genetické charakterizace experimenty jsou dobře zavedené pro mobilní platformy, které vhodně balíček genetických instrukcí spolu s jejich výstup. Desítky tisíc genetických variant mohou být vyšetřeny na funkci pomocí průtokové cytometrie a / nebo NGS. Počet variant, které lze promítat v tradičním experimentu Bez buněk, je o několik řádů menší než ve vysoce výkonných testech in vivo.
• in vivo se (nutně) nerovná in vitro – uvědomte si, že výsledky bez buněk nemusí nutně přímo mapovat výkon systému in vivo nebo dokonce jiné systémy bez buněk. Vzhledem k rozdílům v koncentracích systémových komponent, bezbuněčný výstup mezi systémy má tendenci být srovnatelný, ale ne identický.
• není to ekonomické pro velké proteinové přípravky. Zatímco výnosy až 2.3 g / L proteinu byly hlášeny pro systémy bez buněk, což je konkurenceschopné s expresí založenou na buňkách, potřebujete kultivační objem ~1000x objem reakčního objemu bez buněk. To znamená, že se nejedná o ekonomický systém pro tvorbu velkého množství rekombinantního proteinu.

Výběr Systému

Prokaryotické nebo eukaryotické, homebrewed nebo komerční, surový extrakt-založené nebo rekonstituované? Výběr systému závisí na vašich konkrétních potřebách a omezeních.

jaký druh? Pokud prototypujete genetické části nebo nepotřebujete expresi konkrétního organismu, měl by být vaší první volbou systém bez buněk založený na E. coli. Nejstarší a nejrozšířenější rodina cell-free softwarové systémy, E. coli systémy byly optimalizovány pro spolehlivé genové exprese a high-výnos produkce proteinů.

Chystáte se komerčně? Výroba vlastního buněčného extraktu vyžaduje vybavení a odborné znalosti pro kultivaci a lyse velkých objemů buněk. Hrstka dodavatelů prodává své vlastní bezbuněčné systémy, odvozené z modelových organismů a buněčných linií, ale nejsou levné. Očekávejte, že zaplatíte alespoň $ 7 za reakci, versus centů za reakci pro homebrewed systém.

surový nebo rekonstituovaný? Většina buněk-zdarma expresní systémy jsou vyrobeny s surové buněčného lyzátu, který obsahuje mnoho více enzymů než jádro genové exprese stroje. To může být dobrá věc-moderní systémy založené na lyzátu E. coli obsahují chaperony a většinu centrálního metabolismu, což zvyšuje výtěžnost bílkovin a titry produktů. Pokud potřebujete úplně odstranit aktivitu určitého enzymu, může být správnou volbou rekonstituovaný systém známý jako čistý (syntéza proteinů pomocí rekombinantních prvků). V PURE je každý protein potřebný pro genovou expresi purifikován a přidán do reakce, což vám dává maximální kontrolu nad reakčním složením. Nedávno byly publikovány zjednodušené protokoly, které ekonomicky vyrábějí oba typy systémů,ale můžete si také zakoupit sadu.

abychom to shrnuli

systémy bez buněk jsou nekapsulované biosyntetické systémy, které jsou užitečné pro rychlý vývoj genetického systému a syntézu bioproduktů. Pokud hledáte pro urychlení vývoje nové biosyntetické dráhy, vyšetřovat biochemický proces v jednodušším systému, nebo by chtěli jednodušší způsob, jak používat výraz strojů z geneticky neřešitelné hostitele, bude buňka-zdarma může být pro vás to pravé.

další čtení

Dudley QM, Karim AS & Jewett MC. Metabolické inženýrství bez buněk: Biomanufacturing mimo buňku. Biotechnol J.(2015) 10(1): 69-82. DOI: 10.1002 / biot.201400330

Garamella J., Marshall R, Rustad M & Noireaux V. Všechny E. coli TX-TL Toolbox 2.0: Platforma pro Mobil-Zdarma Syntetické Biologie. ACS syntetická biologie (2016) 5(4):344-355. DOI: 10.1021 / acssynbio.5b00296

Thermo Fisher Scientific. Přehled exprese proteinu. Knihovna Zdrojů Biologie Bílkovin.

Shimizu Y, Kanamori T, Ueda T. syntéza proteinů čistými translačními systémy. Metod. (2005) 36(3):299-304. Doi: 10.1016 / j. ymeth.2005.04.006

Šoba. Úvod do syntézy proteinů bez buněk. Bitesize Bio. 2. Března 2009.

Shoab. Řešeno: nízké výtěžky při syntéze proteinů bez buněk. Bitesize Bio. 21. dubna 2009.