växtmaterial och tillväxtförhållanden

vildtyp och mutanta växter som användes i denna studie var alla i Col-0-ekotyper med undantag för rga–GFP-RGA-linjerna10, som var i Ler-ekotypen. phyB-9-fröer31 erhölls från Arabidopsis biologiska Resurscenter. PIF4 överexpresser linjer och pif4 knockout mutationer (slr2 mutant) var de som beskrivs i ref. 3. Dubbla pif4 pif5-mutanter erhölls genom att korsa pif4-101 T-DNA-införingsallelen och SALK-087012 mutant18 med en insättning i PIF5-genen. 20ox-linjer som bär en knockout-T-DNA-insättning i AtGA20ox1-genen (At4g25420) tillhandahölls av P. Hedden. Ga-okänsliga gai-linjer uttryckte det stabila GAI-proteinet under kontroll av 35S-promotorn. Dubbel-och trippelmutanter genererades genom att korsa dessa linjer och genotypning av avkomman genom PCR-amplifiering eller northern blot-analyser.

frön steriliserades och såddes på GM-agarplattor utan sucrose32. Plattor var kallbehandlade för 2 d vid 4 C och groning synkroniserades med 3 h bestrålning med vitt ljus och efterföljande inkubation i mörkret för 22 h, före överföring till de olika tillväxtbetingelser. Vit-ljus-odlade plantor odlades vid 20 CCB under fluorescens vitt ljus (fluens hastighet av 40-60 CCB m-2 s-1) med en 16 h ljus/ 8 h mörk fotoperiod. För rödljusbehandlingar odlades plantor under kontinuerligt rött ljus (fluenshastighet på 35 kcal m-2 s-1 som tillhandahålls av lysdioder). För mörkvuxna plantor lindades plattorna i flera lager aluminiumfolie. Plattorna placerades i vertikal orientering och skannades för hypokotyllängd med hjälp av ImageJ-programvaran (http://rsb.info.nih.gov/ij). För PAC-behandling överfördes frön till plattor med hämmaren efter induktion av spiring. Minst 20 plantor mättes för varje uppsättning experiment.

växttransformation

ett komplementärt DNA-fragment inklusive ORF i full längd av PIF4 förstärktes med primers PIF4-GFPf och PIF4-GFPr, klonades in i pENTR/D-TOPO-vektorn (Invitrogen) och infördes i binärvektorn pK7FWG2 (http://www.psb.ugent.be/gateway/) med LR-klonaset (Invitrogen). Denna binära konstruktion introducerades i pgv3101-stammen av Agrobacterium och omvandlades till vildtyp Col-0 och phyB Arabidopsis växter, med hjälp av blommigt dip transformation method33. Transformanter valdes på kanamycininnehållande medium och analyserades för pif4–GFP nukleär fluorescens. Homozygota linjer valdes för starka expressers.

ga, PAC och MG132 behandlingar

GA3 (GA) och paclobutrazol (PAC) lager var nyberedda i etanol. Proteasomhämmaren MG132 löstes i DMSO. För mg132-behandling inkuberades plantor i 2 timmar i en 100 oc-lösning av hämmaren. PAC-och GA-behandlingar utfördes vid 0,1 respektive 50, om inte annat anges. Känslighet för hämmaren beräknades som det inverterade förhållandet mellan minskningen av hypokotyllängden observerad för plantor odlade i 0,1 oc-m PAC i förhållande till minskningen observerad i Col-0-växter (100%). Värden är medelvärdet av tre oberoende experiment. Ga-känslighet beräknades som förhållandet mellan ökningen av hypokotyllängd av plantor i 5,0 occurm GA3 och hänvisade till vildtyp Col-0-plantor, som tidigare.

jäst tvåhybridanalyser

DELLA-repressorer kodas i potatis av minst två gener, varvid transkriptet representeras av den uttryckta sekvenstaggen TC113247 är den mest rikligt uttryckta i vegetativa vävnader. Den öppna läsramen i full längd för detta DELLA-protein förstärktes med primers FPG1 och FPG2 och infördes i ram med GAL4-BD i pbridge-vektorn (Clontech). För att undvika den automatiska aktiveringsaktiviteten i samband med denna konstruktion i full längd erhölls n-end (rester 1 till 188), F1 (rester 1 till 362), M5 (rester 188 till 588) och Cter (rester 362 till 588) konstruktioner smälta till GAL4-BD genom matsmältning vid de unika SpeI-och EcoRI-restriktionsställena. Plasmider innehållande dessa konstruktioner, den tomma pbridge–vektorn (pGB) eller en p53-GAL4BD-fusion i pgbkt7-vektorn (kontroll) omvandlades till AH109-jästceller och pläterades på SD-Trp och SD-Trp-Ade-His-plattor för att testa för basal aktivering (kompletterande Fig. 1). Jäststammar innehållande F1 -, M5-eller Cter-konstruktionerna gav den lägsta bakgrundsaktiviteten och användes som bete. Jästceller som innehåller dessa konstruktioner transformerades med ett bladpotatiskomplementärt DNA-bibliotek smält till GAL4-AD I pAD-GAL4-vektorn (Stratagene) och 1-3 msk 106 oberoende transformanter valda på SD-Leu-Trp-Ade-His för positiv interaktion.

ett DNA-fragment motsvarande Arabidopsis PIF4 fullängdsprotein genererades genom PCR-amplifiering med primers PIF4yf och PIF4yr och infördes i EcoRI-platsen för jäst pGBKT7-och pGADT7-vektorerna. Konstruktioner för Arabidopsis PIF3-GAL4BD och PIF3–GAL4AD fusioner tillhandahölls av P. Quail.

Deletionskonstruktioner för della-och PIF4-proteinerna erhölls genom invers PCR-reaktion på rga–BD-och PIF4-AD-konstruktionerna i pbridge-och pAD-GAL4-vektorerna. Konstruktioner del1RGA och del2RGA genererades med användning av primers RGAdel1 eller RGAdel2 och pBridBam, som inför en BamHI restriktionsstället vid varje ände. För att generera konstruktioner del1PIF4, del2PIF4 och del3PIF4, den unika xbai plats i pAD-GAL4 polylinker raderades genom fill-in. Denna plasmid användes sedan som en mall för inversa PCR-reaktioner med primers PIF4del1, PIF4del2 eller PIF4del3 och pGADXba, införa en xbai restriktionsstället vid varje ände. PCR-produkter smältes antingen med BamHI eller XbaI, religerades och omvandlades till Escherichia coli för att erhålla de olika konstruktionerna. Dessa plasmider omvandlades till AH109-jäststammen och pläterades på SD-4-plattor för analys för interaktion. aktiviteten av galaktosidas bestämdes på flytande kulturer av dessa transformanter med användning av onpg-substratet och standardprotokollbetingelser.

konstruktioner motsvarande potatisrga M5-fragmentet för Arabidopsis DELLA-generna RGA1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) och RGL3 (At5g17490) genererades genom PCR-förstärkning med primeruppsättningarna RGL1pGB-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r, rgapgb – f/rgapgb-r och rgapgb-f/gaipgb-r (kompletterande tabell 1). Dessa fragment infördes i jäst-pgbkt7-vektorn med hjälp av restriktionsenzymerna BamHI/SalI för RGL1, SalI/PstI för RGL3 och BamHI/PstI för RGA1 och GAI.

Pull-down-analyser

ett DNA-fragment som kodar för Arabidopsis rga-fullängdsprotein erhölls genom PCR-amplifiering med primers RGAgst-f och RGAgst-r och klonades in i BamHI-platsen för pzex-vektorn för att erhålla en in-frame-fusion med GST-kodningsregionen. Rga-pZEX och den tomma pzex-vektorn transformerades till E. coli-stammen BL21 (de3) pLysS (Stratagene) och kulturer av dessa celler odlade vid 37 kcal C till en D600 = 0,8. Expression av GST-proteinerna inducerades med 1 mM IPTG, i ytterligare 3 timmar vid 30 kcal C, och proteinextraktion och bindning till gluthathione-Sepharose pärlor (Clontech) utfördes enligt protokollet från tillverkaren.

PIF4 -, PIF3-och karboxiterminala phyA-konstruktioner i pgbkt7-vektorn användes som mallar för in vitro-transkription/översättning, i närvaro av 35S-metionin, med hjälp av TNT-systemet (Promega). Plasmid-DNA (1 UCG) användes i varje reaktion. För pull-down inkuberades 10 occyl av översättningsreaktionerna i 30 minuter med rga-GST-och GST-pärlorna (1 occylg protein bundet till pärlorna) i PBS, 0,05% tergitol, 10% glycerol. Pärlorna tvättades noggrant, resuspenderades i 2 kg lastbuffert och analyserades med SDS–sida för proteinbindning.

transienta expressionsanalyser

DNA-fragment som kodar för Arabidopsis fullängds-pif4-och RGA-proteinerna, och DELETIONERNA av sackaros och DEL1RGA erhölls genom PCR-amplifiering med primerpar PIF4yf och PIF4yr, RGAGST-f och RGAgst-r, ASKORRGA-F och RGAgast-r och del1RGA-f och RGAgst-r och infördes i polilynker EcoRI-eller BamHI-platserna av pjit60-vektorn, under kontroll av 2-35S-promotorn. Ett G-box-motivfragment som rapporterats av gel-shift-analyser för att vara ett målelement för PIF4-erkännande34 smältes till Gus-reportergenen och användes som reporterkonstruktion. Vi kunde inte upptäcka PIF4-medierad stimulering av denna reporter-konstruktion, vilket indikerar att ytterligare nukleotidsekvenser som omger CACGTG-motivet kan krävas för effektiv aktivering. För att söka efter ett promotorelement som är lämpligt att användas i dessa analyser utfördes preliminära RNA-profileringsexperiment av 35S-PIF4 och pif4-mutanter, vilket identifierade LTP3 (At5g59320) som ett starkt uppreglerat transkript i 35S-PIF4-plantor. Promotorregionen för denna gen förstärktes med användning av primers LT3p-f och LTP3p-r och infördes i EcoRI-och BamHI-platserna i pGUS-vektorn för att erhålla LTP3-GUS-reporterkonstruktionen. Den 2 35s-luciferas-fusionen av 35-oc användes som en intern kontroll. Arabidopsis celler spreds på filterpapper och inkuberades över natten på LT87 medium (4,4 g l-1 Murashige och Skoog salter + vitaminer, 0,5 g L-1 MES, 0,5 g l-1 NAA, 30 g l-1 sackaros, 8 g l-1 agar). Två timmar före bombardemang överfördes filter till LT87-medium med 200 mM mannitol för att inducera vakuolretraktion. DNA-utfällning och partikelbombardemang utfördes med användning av en heliumdriven partikelaccelerator (PDS-1000; Bio-Rad), enligt tillverkarens instruktioner. Celler förvandlades med 0,5 µg av LTP3-GUS reporter plasmid + 0,5 mikrogram av 2×35S-LUC intern standard, och antingen 2 µg av pJIT60 tom vektor (LTP3), 1 µg av 2×35S-PIF4 effektor konstruera + 1 µg pJIT60 (PIF4), eller 1 µg av alla 2×35S-PIF4 och 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA eller 2×35S-del1RGA effektor konstruktioner (PIF4 + RGA, PIF4 + ΔRGA, PIF4 + del1RGA). Filter överfördes till färska LT87-plattor (- GA) eller till LT87-plattor + 50 occurm GA3 (+GA) och inkuberades i 16 h. celler extraherades i celllysbufferten som tillhandahölls i luciferas Assay System kit (Promega) och rensades genom centrifugering vid 12 000 g under 5 min. LUC-aktivitet bestämdes enligt kit och GUS-aktivitet bestämd genom fluorometrisk analys35. LTP3 promotoraktivitet beräknades som förhållandet mellan Gus och LUC-aktivitet i varje prov. Fyra replika plattor användes för varje behandling.

RNA-extraktioner och omvänt transkriptas (RT)–PCR

för genuttrycksanalyser extraherades totalt RNA från 4 dagar gamla plantor med användning av guanidin-HCl-metoden36 och behandlades därefter med DNaseI (Roche) före rengöring genom Qiagen RNeasy Mini-kolumner (Qiagen). RNA (1 usci) användes för cDNA-syntes i första strängen med hjälp av cDNA-Arkivsatsen med hög kapacitet (Applied Biosystems) och 1,0 usci av denna reaktion användes som mall för PCR-amplifiering. Primeruppsättningar AtLTP3-f/AtLTP3-r, Atexpan-f/Atexpan-r och Atactin8-f / Atactin8-r användes för förstärkning av LTP3 (At5g59320), exporsin (at2g20750) och aktin-8 (At1g49240) transkript.

bimolekylär fluorescenskomplementation (BiFC) analyser

fullängds öppen läsramsekvenser för Arabidopsis PIF4-och RGA-proteinerna förstärktes med primers PIF4YFP-f/ PIF4YFP-r respektive RGAYFP-f / RGAYFP-R. PCR-produkterna klonades in i pENTR / D-TOPO-vektorn (Invitrogen) och infördes genom LR-reaktion (Invitrogen) i de binära pbifc-vektorerna (F. Parcy) innehållande amino-eller C-terminala fragment av eYFP fluorescerande protein (eYFPN och eYFPC). Alla åtta möjliga parvisa kombinationer av dessa konstruktioner omvandlades till Agrobacterium tumefaciens och saminfiltrerades i den abaxiala ytan av 2-3 veckor gamla Nicothiana benthamiana-växter enligt beskrivning37. P19-proteinet från tomatbuskigt stuntvirus användes för att undertrycka gentystning. Agrobacteriumstammar innehållande pBiFC-konstruktionerna och P19-ljuddämpande plasmid var vid ett D600-förhållande av 0,7:0,7:1 för infiltration. Fluorescens visualiserades i epidermala cellskikt av bladen efter 2 dagars infiltration, med användning av ett Leica DMR fluorescerande mikroskop. Bladen inkuberades med 1 kg ml-1 4′, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) för kärnfärgning.

PIF4/rga–GFP samimmunutfällningar

Samimmunutfällningsstudier av rga-och PIF4-proteinerna utfördes på 7 dagar gamla rga-GFP-RGA transgena plantor10 odlade under vitt ljus. Plantor inkuberades antingen i mörker eller överfördes till PAC – eller GA-innehållande medium och inkuberades i ytterligare 12 timmar före extraktion. Immunoprecipitation av GFP-RGA-proteinet utfördes vid 4 kg C under 6 timmar med användning av en anti-GFP-antikropp (Santa Cruz Biotechnology) i en buffert innehållande 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, PMSF (1 mM) och proteashämmare (Sigma). Protein g-agaros (Sigma) användes för att fälla ut immunoproteinkomplexen. Pif4-detektion utfördes med en anti-PIF4-antikropp.

Kromatinimmunutfällningar och PCR-förstärkningar

Kromatinimmunutfällningsanalyser utfördes enligt tidigare beskrivning29. PIF4-HA plantor20 odlades på GM-medium i 6 dagar under kontinuerligt rött ljus och överfördes sedan till plattor innehållande antingen GA eller PAC och hölls över natten i mörkret. Fröplantor (1,5-2 g) och 40 oC-l av anti-ha-Affinitetsmatrisen (Roche) användes för kromatinimmunutfällning. Utfällt DNA löstes i 50 oc TE, och 0,5 oc användes för PCR-amplifiering med användning av primrarna listade i kompletterande Tabell 1. PCR-betingelser var följande: 94 C i 2 min, 35 cykler av 94 C i 15 s, 55 C i 30 s och 72 C i 30 s, följt av 72 C i 7 min. Sonicated input DNA (0,3%) användes för en kvantitativ kontroll. Western blot-analyser utfördes för att kvantifiera mängden återvunnet PIF4-protein efter kromatinimmunutfällning. Blottar var immunodetekterade med en anti-ha-peroxidas Högaffinitetsantikropp (Roche).

mikroskopi

proteinstabilitetsanalyser utfördes med användning av Radiance 2100 (Bio-Rad) Laserskanningssystem kopplat till ett Zeiss Axiovert 200-mikroskop. För GFP och klorofyll excitation användes en argonjonlaser vid 488 nm våglängd och en röd diod vid 637 nm. Kombinationen av filter som användes var: 560 dclpxr beam splitter och HQ 515/30 emissionsfilter för GFP och HQ 660lp för klorofylldetektering. Bilderna togs sekventiellt med hjälp av LaserSharp v5.0-programvaran (Bio-Rad) och slogs samman med LaserPix V. 4-bildprogramvaran (Bio-Rad).

Gel-shift-analys

oligonukleotiderna pLTP-WTf/r och pLTP-MUTf / r användes för att generera LTP3-sonderna och specifika konkurrenter som användes i EMSA-analyser. Oligonukleotider glödgades i 5 msk restriktionsenzymbuffert och slutmärktes genom fyllning med Klenow. För proteinextrakt, N. benthamiana löv infiltrerades med Agrobacterium-stammarna för 35S–PIF4-HA (PIF4) och 35s–RGA-GFP (RGA) konstruktioner eller med en 1:1-blandning (PIF4 + RGA) av dessa stammar och med p19-konstruktionen som beskrivits ovan. Bladekstrakter erhölls genom homogenisering i hög saltbuffert (20 mm HEPES, pH 7,9, 0,5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0,5% nonidet P-40, 1 mM DTT, + proteashämmare), clearing genom centrifugering och efterföljande dialys mot 1 msk BB (20 mm HEPES, pH 7,9, 0,1 M KCl, 1 mM EDTA, 0,05% nonidet P-40, 0,5 mM DTT, 10% glycerol). Närvaron av ekvivalenta mängder PIF4-och RGA-proteiner i extrakten bedömdes genom western blot-detektion med anti-HA (Roche) och anti-GFP (Santa Cruz) antikroppar. Ökande mängder av dessa extrakt (5,0, 10,0, 15,0 occl) användes för EMSA-reaktionen. Extrakt inkuberades i 15 minuter vid rumstemperatur med den märkta sonden och 100 ng poly (dI-dIC) i 20 oC 1 oc BB och separerades med 6% sida i 0,5 oc TBE. Ett 100-faldigt överskott av vildtyp (WT) och mutant (MUT) glödgade oligonukleotider användes för specifik konkurrens.