material Vegetal e condições de crescimento

de tipo Selvagem e mutante plantas utilizadas neste estudo foram todos no Col-0 ecotipos com exceção do RGA-GFP–RGA lines10, que estavam a Ler ecotype. o phyB-9 seeds31 foi obtido do centro de Recursos Biológicos Arabidopsis. As linhas sobreexpressoras de PIF4 e as mutações knockouts de pif4 (mutante slr2) foram as descritas na ref. 3. Os mutantes pif4 pif5 duplos foram obtidos atravessando o alelo de inserção do ADN-T pif4-101 e o mutant18 SALK-087012 com uma inserção no gene PIF5. As linhas 20ox que transportavam uma inserção knockout T-DNA no gene AtGA20ox1 (At4g25420) foram fornecidas por P. Hedden. As linhas gai insensíveis GA expressaram a proteína GAI estável sob controlo do promotor 35S. Mutantes duplos e triplos foram gerados cruzando essas linhas e genotipando a descendência por amplificação PCR ou análises de manchas do Norte.as sementes foram esterilizadas à superfície e semeadas em placas de ágar GM sem sucrose32. As placas foram tratadas a frio durante 2 d A 4 ° C e a germinação foi sincronizada por 3 h de irradiação com luz branca e subsequente incubação na escuridão durante 22 h, antes da transferência para as diferentes condições de crescimento. As mudas cultivadas com luz branca foram cultivadas a 20 ° C sob luz branca fluorescente (taxa de fluência de 40-60 µmol m-2 s-1) com um Fotoperíodo de 16 h luz/ 8 h escuro. Para os tratamentos com luz vermelha, as mudas foram cultivadas sob luz vermelha contínua (taxa de fluência de 35 µmol m-2 s-1 fornecida por LEDs). No caso das mudas cultivadas em meio escuro, as placas foram envoltas em várias camadas de folha de alumínio. Placas foram colocadas em uma orientação vertical e digitalizadas para comprimento hipocotílico usando o software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). Para o tratamento PAC, as sementes foram transferidas para placas com o inibidor, após indução da germinação. Pelo menos 20 mudas foram medidas para cada conjunto de experimentos.

Planta de transformação

Uma complementares fragmento de DNA, incluindo o comprimento total ORF de PIF4 foi amplificado com os primers PIF4-GFPf e PIF4-GFPr, clonado na pENTR/D-TOPO vetor (Invitrogen) e inseridos no pK7FWG2 vetor binário (http://www.psb.ugent.be/gateway/) com o LR clonase (Invitrogen). Esta construção binária foi introduzida na estirpe pGV3101 de Agrobacterium e transformada em plantas do tipo selvagem Col-0 e Phyb Arabidopsis, usando o método de transformação floral dip 33. Os transformadores foram seleccionados num meio contendo canamicina e analisados para detecção de fluorescência nuclear PIF4–GFP. Linhas homozigóticas foram selecionadas para expressores fortes.as existências de paclobutrazol (PAC) foram recentemente preparadas em etanol. O inibidor do proteosoma MG132 foi dissolvido em DMSO. No tratamento com MG132, as mudas foram pré-incubadas durante 2 h numa solução do inibidor de 100 µM. Os tratamentos PAC e GA foram realizados a 0, 1 µM e 50 µM, respectivamente, a menos que indicado. A sensibilidade ao inibidor foi calculada como a razão invertida da redução do comprimento hipocotílico observada para as mudas cultivadas em PAC de 0, 1 µM relativamente à redução observada em plantas de colo-0 (100%). Os valores são a média de três experimentos independentes. A sensibilidade GA foi calculada como a razão do aumento do comprimento hipocotílico das mudas em 5,0 µM GA3 e referenciada a mudas de tipo selvagem Col-0, Como anteriormente.os repetidores são codificados em batata por pelo menos dois genes, sendo a transcrição representada pela marca de sequência expressa TC113247 a mais abundantemente expressa em tecidos vegetativos. O quadro de leitura aberto de comprimento completo para esta proteína DELLA foi amplificado usando primers FPG1 e FPG2 e inserido no quadro com o GAL4-BD no vetor de pBridge (Clontech). Para evitar a auto-ativação atividade associada a este com a duração total de construção, N-final (resíduos de 1 a 188), F1 (resíduos 1 362), M5 (resíduos 188 588) e Cter (resíduos 362 588) constrói fundida para o GAL4-BD foram obtidos por digestão em SpeI e sítios de restrição EcoRI. Plasmídeos contendo estas construções, o vetor pBridge vazio (pGB) ou uma fusão P53–GAL4BD no vetor pGBKT7 (controle) foram transformados em células de levedura AH109 e banhados em placas SD-Trp e SD-Trp-Ade, para testar a ativação basal (Fig. suplementar. 1). As estirpes de levedura que contêm as construções F1, M5 ou Cter deram a menor actividade de fundo e foram utilizadas como isco. Células de levedura contendo essas construções foram transformadas com uma biblioteca de DNA complementar de batata folha fundida ao GAL4-AD no vetor pAD-GAL4 (Stratagene) e 1-3 × 106 transformadores independentes selecionados em SD-Leu-Trp-Ade-His para interação positiva.

Um fragmento de ADN correspondente à proteína Arabidopsis PIF4 de comprimento completo foi gerado pela amplificação PCR com os iniciadores PIF4yf e PIF4yr e inserido no sítio EcoRI dos vetores pgbkt7 e pGADT7 da levedura. Constructs for the Arabidopsis PIF3-GAL4BD and PIF3-GAL4AD fusions were provided by P. Quail.

Deletation constructs for the DELLA and PIF4 proteins were obtained by inverse PCR reaction on the RGA-BD and PIF4-AD constructs in the pBridge and pAD-GAL4 vectors. Constructs del1RGA and del2RGA were generated using primers RGAdel1 or RGAdel2 and ppridbam, which introduce a BamHI restriction site at each end. Para gerar construções del1PIF4, del2PIF4 e del3PIF4, o único site XbaI no polilinker pAD-GAL4 foi deletado pelo preenchimento. Este plasmídeo foi então usado como um modelo para reações PCR inversas com primers PIF4del1, PIF4del2 ou PIF4del3 e pGADXba, introduzindo um local de restrição XbaI em cada extremidade. Os produtos PCR foram digeridos com BamHI ou XbaI, religiosos e transformados em Escherichia coli para obter as diferentes construções. Estes plasmídeos foram transformados na estirpe de levedura AH109 e revestidos em placas SD-4 para o ensaio de interacção. a actividade da β-galactosidase foi determinada em culturas líquidas destes transformadores utilizando o substrato ONPG e as condições de Protocolo padrão.

Construções equivalente a batata RGA M5 fragmento para a Arabidopsis DELLA genes RGA1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) e RGL3 (At5g17490) foram gerados pela amplificação por PCR com o primer define RGL1pGB-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r, RGApGB-f/RGApGB-r e RGApGB-f/GAIpGB – r (Complementar Tabela 1). Estes fragmentos foram inseridos no levedura pGBKT7 vetor utilizando as enzimas de restrição BamHI/SalI para RGL1, SalI/PstI para RGL3 e BamHI/PstI para RGA1 e GAI.

ensaios de tracção

um fragmento de ADN que codifica a proteína Arabidopsis RGA de comprimento completo foi obtido por amplificação PCR com os iniciadores RGAgst-f e RGAgst-r e clonado no sítio BamHI do vector pZEX, para obter uma fusão em frame com a região de codificação GST. O vetor RGA-pZEX e o vetor pzex vazio foram transformados na estirpe BL21(de3)de E. coli pLysS (Stratagene) e culturas destas células cresceram a 37 °C a um D600 = 0,8. A expressão das proteínas GST foi induzida com 1 mM de IPTG, durante 3 horas adicionais a 30 °C, e a extracção e ligação de proteínas às esferas de glutationa-Sefarose (Clontech) foi realizada de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante.

As construções de PHYA PIF4, PIF3 e carboxi-terminal no vector pGBKT7 foram usadas como modelos para transcrição/tradução in vitro, na presença de 35S-metionina, utilizando o sistema TnT (Promega). O ADN plasmídeo (1 µg) foi utilizado em cada reacção. Para a retirada, foram incubados 10 µl das reacções de Tradução durante 30 minutos com as esferas RGA-GST e GST (1 µg de proteína ligada às esferas) em PBS, 0,05% de tergitol, 10% de glicerol. As esferas foram cuidadosamente lavadas, ressuspendidas em tampão de carga de 2× e analisadas pela SDS–PAGE para a ligação às proteínas.

de expressão Transitória ensaios

fragmentos de DNA de codificação de Arabidopsis com a duração total de PIF4 e RGA de proteínas, e o ΔRGA e del1RGA eliminações foram obtidos por amplificação por PCR com os pares de primers PIF4yf e PIF4yr, RGAgst-f e RGAgst-r, ΔRGA-f e RGAgast-r e del1RGA-f e RGAgst-r, e inserido no polilynker EcoRI ou BamHI sites dos pJIT60 vetor, sob o controle do 2×promotor 35S. Um fragmento do motivo da caixa-G relatado pelos testes de gel-shift Como Sendo um elemento alvo para o reconhecimento PIF434 foi fundido ao gene GUS reporter e usado como uma construção de repórter. Não fomos capazes de detectar estimulação mediada por PIF4 desta construção de repórter, indicando que sequências de nucleótidos adicionais em torno do motivo CACGTG podem ser necessários para ativação eficiente. Para procurar um elemento promotor adequado para ser utilizado nestes ensaios, foram realizados experimentos preliminares de perfis de RNA de mutantes 35S-PIF4 e pif4, identificando assim o LTP3 (At5g59320) como uma transcrição fortemente ajustada em seedlings 35S-PIF4. A região promotora deste gene foi amplificada usando primers LT3p-f E LTP3p-r e inserida nos locais EcoRI e BamHI do vetor pGUS para obter a construção LTP3-GUS reporter. A fusão 2×35S-luciferase foi usada como um controle interno. As células de Arabidopsis foram espalhadas em papel filtrante e incubadas durante a noite em meio LT87 (4,4 g L-1 Murashige e sais de Skoog + vitaminas, 0,5 g L-1 MES, 0,5 g L-1 NAA, 30 g L-1 sacarose, 8 g de ágar l-1). Duas horas antes do bombardeamento, os filtros foram transferidos para o meio LT87 com manitol de 200 mM para induzir a retração de vácuo. A precipitação de ADN e o bombardeamento de partículas foram realizados utilizando um acelerador de partículas movido a hélio (PDS-1000; Bio-Rad), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram transformadas com 0,5 µg de LTP3-GUS repórter do plasmídeo + 0,5 µg de 2×35S-LUC padrão interno, e de 2 µg de pJIT60 vector vazio (LTP3), 1 µg de 2×35S-PIF4 efetor construir + 1 µg pJIT60 (PIF4), ou 1 µg de cada 2×35S-PIF4 e 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA ou 2×35S-del1RGA efetor construções (PIF4 + RGA, PIF4 + ΔRGA, PIF4 + del1RGA). Os filtros foram transferidos a fresco LT87 placas (GA) ou para LT87 placas + 50 µM GA3 (+GA) e incubados por 16 h. As células foram extraídos em tampão de lise celular fornecido no Ensaio de Luciferase Sistema kit (Promega) e desembaraçadas por meio de centrifugação a 12.000 g por 5 min. A actividade de LUC foi determinada de acordo com a actividade kit e GUS determinada por assay35 fluorométrico. A actividade do promotor LTP3 foi calculada como a relação entre a actividade GUS e LUC em cada amostra. Foram utilizadas quatro placas de réplica para cada tratamento.para análises de expressão genética, o RNA total foi extraído de mudas com 4 dias de idade utilizando o método guanidina-Hcl36 e subsequentemente tratado com DNaseI (Roche) antes da limpeza através de Mini colunas de QIAGEN RNeasy (Qiagen). RNA (1 µg) foi usado para a síntese cDNA de primeira linha usando o Kit de arquivo cDNA de alta capacidade (Applied Biosystems) e 1,0 µl desta reação foi usado como modelo para a amplificação PCR. Conjuntos de primers AtLTP3-f/AtLTP3-r, Atexpan-f/Atexpan-r e Atactin8-f/Atactin8-r foram utilizados para a amplificação do LTP3 (At5g59320), β-expansin (At2g20750) e actina-8 (At1g49240) transcrições.

Bimolecular de fluorescência de complementação (BiFC) ensaios

comprimento Completo de leitura aberta sequências de quadros para a Arabidopsis PIF4 e RGA proteínas foram amplificados com primers PIF4YFP-f/ PIF4YFP-r e RGAYFP-f/ RGAYFP-r, respectivamente. Os produtos PCR foram clonados no vetor pENTR/D-TOPO (Invitrogen) e inseridos pela reação LR (Invitrogen) nos vetores binários pBiFC (F. Parcy) contendo os fragmentos amino ou C terminais da proteína fluorescente eyfpn (eYFPN e eYFPC). Todas as oito combinações possíveis destas construções foram transformadas em Agrobacterium tumefaciens e co-infiltradas na superfície abaxial das plantas Nicothiana benthamiana de 2 a 3 semanas de idade, como descrito 37. O p19 protein of tomato bushy stunt virus foi usado para suprimir o silenciamento genético. As estirpes de Agrobacterium contendo as construções pBiFC e o plasmídeo silencioso p19 tinham uma relação D600 de 0, 7:0, 7:1 para infiltração. A fluorescência foi visualizada em camadas de células epidérmicas das folhas após 2 dias de infiltração, usando um microscópio fluorescente Leica DMR. As folhas foram incubadas com 1 µg ml-1 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para coloração de núcleos.

PIF4/RGA–GFP Co-imunoprecipitações

os estudos de co-imunoprecipitação das proteínas RGA e PIF4 foram realizados em sedimentos transgénicos de 7 dias de idade RGA-GFP-RGA10 cultivados sob luz branca. As mudas foram incubadas na escuridão ou transferidas para um meio contendo PAC ou GA e incubadas durante 12 horas adicionais antes da extração. Imunoprecipitação da GFP–RGA de proteína foi realizada a 4 °C por 6 h, usando um anti-GFP de anticorpos (Santa Cruz Biotechnology) em um buffer contendo 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0,5% De Triton X-100, PMSF (1 mM) e inibidores de protease (Sigma). A proteína G agarose (Sigma) foi utilizada para precipitar os complexos imunoproteicos. A detecção de PIF4 foi realizada com um anticorpo anti-PIF4.

Chromatin immunoprecipitations and PCR amplifications

Chromatin immunoprecipitation assays were performed as described previously 29. Os seedlings20 PIF4–HA foram cultivados em meio GM durante 6 dias sob luz vermelha contínua e, em seguida, foram transferidos para placas contendo GA ou PAC e mantidos durante a noite no escuro. Foram utilizadas mudas (1, 5–2 g) e 40 µl da matriz de afinidade anti-HA (Roche) para imunoprecipitação de cromatina. O ADN precipitado foi dissolvido em 50 µl de TE, e 0,5 µl foi utilizado para a amplificação da PCR utilizando os iniciadores enumerados no quadro Complementar 1. As condições da PCR foram as seguintes: 94 °C durante 2 minutos, 35 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 30 segundos, seguidos de 72 °C durante 7 minutos. O ADN de entrada com sonicato (0, 3%) foi utilizado para um controlo quantitativo. Análises Western blot foram realizadas para quantificar a quantidade de proteína PIF4 recuperada após imunoprecipitação cromatina. Blots foram imunodetectados com um anticorpo de elevada afinidade anti-HA peroxidase (Roche).foram realizados ensaios de estabilidade das proteínas por microscopia microscópica

utilizando o sistema de varrimento por Laser Radiance 2100 (Bio-Rad) acoplado a um microscópio Zeiss Axiovert 200. Para a excitação da GFP e da clorofila, foi utilizado um laser de iões de árgon a 488 nm de comprimento de onda e um díodo vermelho a 637 nm, respectivamente. A combinação de filtros utilizados foi: 560 dclpxr separador de feixe e filtro de emissão HQ 515/30 para GFP, e HQ 660LP para detecção de clorofila. As imagens foram tiradas sequencialmente usando o software LaserSharp v5. 0 (Bio-Rad) e se fundiram usando o software LaserPix v. 4 de imagem (Bio-Rad).os oligonucleotídeos pLTP-WTf/r e pLTP-MUTf / r foram utilizados para gerar as sondas LTP3 e concorrentes específicos utilizados nos ensaios EMSA. Os oligonucleótidos foram recozidos em tampão enzimático de restrição de 5× m e rotulados no final por enchimento com Klenow. Para os extractos proteicos, N. as folhas de benthamiana foram infiltradas com as estirpes de Agrobacterium para as construções 35S–PIF4-HA (PIF4) e 35S–RGA-GFP (RGA) ou com uma mistura 1:1 (PIF4 + RGA) destas estirpes e com a construção p19, como descrito acima. Folha extratos foram obtidos por homogeneização em alta sal buffer (20 mM de HEPES, pH 7.9, 0,5 M de KCl, 1 mM EDTA, 1 mM de MgCl2, 0,5% de nonidet P-40, 1 mM DTT, + inibidor da protease), compensação por meio de centrifugação e posterior diálise contra 1× BB (20 mM de HEPES, pH 7.9, 0,1 M de KCl, 1 mM EDTA, 0,05% de nonidet P-40, de 0,5 mM de DTT, 10% de glicerol). A presença de quantidades equivalentes de proteínas PIF4 e RGA nos extractos foi avaliada pela detecção western blot com anticorpos anti-HA (Roche) e anti-GFP (Santa Cruz). Quantidades crescentes destes extratos (5,0, 10,0, 15,0 µl) foram usados para a reação da EMSA. Os extractos foram incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente com a sonda marcada e 100 ng de poli (di-dIC) em 20 µl 1× BB e separados por uma página de 6% em 0,5× TBE. Para a concorrência específica foi utilizado um excesso de oligonucleótidos mutantes (mutantes) e de tipo selvagem (WT) 100 vezes superior.