materiały roślinne i warunki wzrostu

Dzikie i zmutowane rośliny użyte w tym badaniu znajdowały się w ekotypach Col-0 z wyjątkiem linii RGA-GFP-RGA 10, które znajdowały się w ekotypie Ler. nasiona phyB-931 pozyskano z Centrum zasobów biologicznych Arabidopsis. Linie nadekspresywne PIF4 i mutacje knockout pif4 (mutacja slr2) to te opisane w ref. 3. Podwójne mutanty pif4 pif5 uzyskano przez skrzyżowanie allelu insercyjnego t-DNA pif4-101 i mutanta SALK-08701218 z insercją w genie PIF5. P. Hedden dostarczył 20 linii z nokautującą insercją T-DNA w genie AtGA20ox1 (At4g25420). Ga-niewrażliwe linie gai ulegały ekspresji stabilnego białka GAI pod kontrolą promotora 35S. Podwójne i potrójne mutanty zostały wytworzone przez przekroczenie tych linii i genotypowanie potomstwa poprzez amplifikację PCR lub analizę northern blot.

nasiona sterylizowano powierzchniowo i wysiewano na płytkach agaru GM bez sukrose32. Płytki poddano obróbce na zimno przez 2 d w temperaturze 4 °C, a kiełkowanie zsynchronizowano przez 3 godziny napromieniowania światłem białym, a następnie inkubację w ciemności przez 22 godziny, przed przeniesieniem do różnych warunków wzrostu. Sadzonki uprawiano w temperaturze 20 °c pod wpływem fluorescencji światła białego (fluencja 40-60 µmol m-2 s-1) z 16-godzinnym światłem jasnym/ 8-godzinnym ciemnym. W przypadku zabiegów na czerwonym świetle sadzonki uprawiano w ciągłym świetle czerwonym (współczynnik fluencji 35 µmol m-2 s-1 dostarczany przez diody LED). W przypadku sadzonek ciemnozielonych płyty owinięto kilkoma warstwami folii aluminiowej. Płytki umieszczano w orientacji pionowej i skanowano pod kątem długości hipokotylu za pomocą oprogramowania ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). W przypadku leczenia PAC nasiona przenoszono na płytki z inhibitorem, po indukcji kiełkowania. Na każdy zestaw eksperymentów zmierzono co najmniej 20 sadzonek.

transformacja roślin

komplementarny fragment DNA zawierający pełną długość ORF pif4 Amplifikowano starterami PIF4-GFPf i PIF4-GFPR, sklonowano do wektora pENTR/D-TOPO (Invitrogen) i wstawiono do wektora binarnego pK7FWG2 (http://www.psb.ugent.be/gateway/) z klonazą LR (Invitrogen). Tę dwuskładnikową konstrukcję wprowadzono do szczepu pGV3101 Agrobacterium i przekształcono w dzikie rośliny Col – 0 i phyB Arabidopsis, stosując metodę transformacji dip floral33. Transformanty wyselekcjonowano na pożywce zawierającej kanamycynę i przeanalizowano pod kątem fluorescencji jądrowej PIF4-GFP. Linie homozygotyczne zostały wybrane dla silnych ekspresów.

preparaty ga, PAC i MG132

zapasy GA3 (GA) i paclobutrazolu (PAC) zostały świeżo przygotowane w etanolu. Inhibitor proteasomu MG132 rozpuszczono w DMSO. W przypadku leczenia MG132 sadzonki inkubowano wstępnie przez 2 godziny w roztworze inhibitora o wielkości 100 µM. Zabiegi PAC i GA wykonywano odpowiednio w 0,1 µM i 50 µM, o ile nie wskazano inaczej. Czułość na inhibitor obliczono jako odwrócony stosunek zmniejszenia długości hipokotylu obserwowanego dla sadzonek uprawianych w PAC 0,1 µM w stosunku do zmniejszenia obserwowanego u roślin Col-0 (100%). Wartości są średnią z trzech niezależnych eksperymentów. Czułość GA została obliczona jako stosunek wzrostu długości hipokotylowej sadzonek w 5,0 µM GA3 i odnosi się do sadzonek dzikiego typu Col-0, jak wcześniej.

dwu-hybrydowe testy drożdży

są kodowane w ziemniakach przez co najmniej dwa geny, przy czym transkrypt reprezentowany przez znacznik ekspresji sekwencji tc113247 jest najobficiej wyrażany w tkankach wegetatywnych. Pełnowymiarową otwartą ramkę odczytu dla tego białka della Amplifikowano za pomocą starterów FPG1 i FPG2 i wstawiono w ramkę z GAL4-BD do wektora PBD (Clontech). Aby uniknąć aktywności autoaktywacji związanej z tą konstrukcją o Pełnej długości, konstrukty N-end (pozostałości od 1 do 188), F1 (pozostałości od 1 do 362), M5 (pozostałości od 188 do 588) i Cter (pozostałości od 362 do 588) połączone z GAL4-BD otrzymano przez trawienie w unikalnych miejscach restrykcji SpeI i EcoRI. Plazmidy zawierające te konstrukty, pusty wektor pBridge (pGB) lub fuzję P53-GAL4BD w wektorze pGBKT7 (kontrolnym) przekształcono w komórki drożdży AH109 i pokryto płytkami SD-Trp i SD-Trp-Ade-his w celu przetestowania aktywacji bazalnej (dodatkowe rys. 1). Szczepy drożdży zawierające konstrukcje F1, M5 lub Cter dawały najniższą aktywność tła i były używane jako przynęta. Komórki drożdży zawierające te konstrukty przekształcano z biblioteką komplementarnego DNA liści ziemniaka połączoną z GAL4-AD w wektorze Pad-GAL4 (Stratagene) i niezależnymi transformantami 1-3 × 106 wybranymi na SD-Leu-Trp-Ade-His w celu pozytywnej interakcji.

fragment DNA odpowiadający pełnowymiarowemu białku Arabidopsis PIF4 został wygenerowany przez amplifikację PCR starterami PIF4yf i PIF4yr i wprowadzony do miejsca EcoRI wektorów drożdży pGBKT7 i pGADT7. Konstrukty fuzji Arabidopsis PIF3-GAL4BD i PIF3-GAL4AD dostarczył P. Quail.

konstrukty delecji dla białek DELLA i PIF4 uzyskano przez odwrotną reakcję PCR na konstrukcjach RGA–BD i PIF4–AD w wektorach pBridge i PAD-GAL4. Konstrukty del1RGA i del2RGA zostały wygenerowane przy użyciu starterów RGAdel1 lub RGAdel2 i pBridBam, które wprowadzają miejsce ograniczenia BamHI na każdym końcu. Aby wygenerować konstrukcje del1PIF4, del2PIF4 i del3PIF4, unikalna strona XbaI w pad-GAL4 polylinker została usunięta przez fill-in. Plazmid ten został następnie użyty jako szablon dla odwrotnych reakcji PCR z starterami PIF4del1, PIF4del2 lub PIF4del3 i pGADXba, wprowadzając miejsce ograniczenia XbaI na każdym końcu. Produkty PCR trawiono albo BamHI, albo XbaI, religiowano i przekształcano w Escherichia coli w celu uzyskania różnych konstruktów. Plazmidy te przekształcono w szczep drożdży AH109 i pokryto płytkami SD-4 w celu oznaczenia interakcji. aktywność β-galaktozydazy oznaczono na ciekłych hodowlach tych transformantów z wykorzystaniem substratu ONPG i standardowych warunków protokołu.

konstrukcje równoważne fragmentowi ziemniaka RGA M5 dla genów Arabidopsis DELLA RGA1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) i Rgl3 (At5g17490) zostały wygenerowane przez amplifikację PCR z zestawami podkładów RGL1pGB-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r, rgapgb-f/Rgapgb-R I Rgapgb-f/Gaipgb – R (dodatkowa tabela 1). Fragmenty te wstawiono do wektora drożdży pGBKT7 przy użyciu enzymów restrykcyjnych BamHI/SalI dla RGL1, SalI/Psti dla RGL3 i BamHI / Psti dla RGA1 i GAI.

testy Pull-down

fragment DNA kodujący pełnowymiarowe białko RGA Arabidopsis otrzymano przez amplifikację PCR starterami rgagst-f i RGAgst-r i sklonowano w miejscu BamHI wektora pZEX, aby uzyskać fuzję w ramce z regionem kodującym GST. RGA-pZEX i pusty wektor pZEX przekształcono w szczep E. coli BL21 (DE3)pLysS (Stratagene) i kultury tych komórek hodowano w temperaturze 37 °C do D600 = 0,8. Ekspresję białek GST indukowano 1 mM IPTG, przez 3 dodatkowe godziny w temperaturze 30 °C, a ekstrakcję białka i wiązanie z kulkami Gluthation-Sepharose (Clontech) przeprowadzono zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta.

konstrukcje pif4, PIF3 i karboksy-końcowe phyA w wektorze pGBKT7 zostały użyte jako szablony do transkrypcji/translacji in vitro, w obecności 35S-metioniny, przy użyciu systemu TnT (Promega). W każdej reakcji użyto plazmidu DNA (1 µg). 10 µl reakcji translacji inkubowano przez 30 minut z koralikami RGA-GST i GST (1 µg białka związanego z koralikami) w PBS, 0,05% tergitolu, 10% glicerolu. Koraliki dokładnie przemyto, ponownie zawieszono w buforze 2× załadowczym i przeanalizowano za pomocą SDS–PAGE pod kątem wiązania z białkami.

przemijające testy ekspresji

fragmenty DNA kodujące pełnowymiarowe białka Pif4 i RGA Arabidopsis oraz delecje ΔRGA i del1RGA uzyskano przez amplifikację PCR parami starterowymi PIF4yf i PIF4yr, RGAGST-f i RGAgst-r, ΔRGA-f i rgagast-r oraz del1RGA-f i Rgagst-r i wstawiono do polilynkera EcoRI lub BamHI miejsca wektora pjit60, pod kontrolą promotora 2×35S. Fragment motywu G-box zgłoszony przez testy Gel-shift jako element docelowy dla rozpoznawania PIF434 został połączony z genem reporterowym GUS i użyty jako konstrukcja reporterowa. Nie byliśmy w stanie wykryć stymulacji tej konstrukcji reporterowej za pośrednictwem PIF4, co wskazuje, że dodatkowe sekwencje nukleotydowe otaczające motyw CACGTG mogą być wymagane do skutecznej aktywacji. Aby wyszukać element promotora odpowiedni do zastosowania w tych testach, przeprowadzono wstępne eksperymenty profilowania RNA mutantów 35S-PIF4 i pif4, stąd zidentyfikowano LTP3 (At5g59320) jako silny, podwyższony transkrypt w sadzonkach 35S-PIF4. Region promotora tego genu Amplifikowano za pomocą starterów LT3p-f i LTP3p-r i wstawiono do miejsc EcoRI i BamHI wektora pGUS w celu uzyskania konstrukcji reporterowej LTP3-GUS. Fuzja 2×35S-lucyferaza została wykorzystana jako kontrola wewnętrzna. Komórki Arabidopsis rozprowadzano na papierze filtracyjnym i inkubowano przez noc na pożywce LT87 (4,4 g L-1 Murashige i sole Skoog + witaminy, 0,5 g L-1 MES, 0,5 g L-1 NAA, 30 g L-1 sacharozy, 8 G L-1 agaru). Dwie godziny przed bombardowaniem, filtry zostały przeniesione na medium LT87 o kalibrze 200 mM w celu wywołania cofania wakuoli. Wytrącanie DNA i bombardowanie cząstek przeprowadzono przy użyciu akceleratora cząstek napędzanego helem (PDS-1000; Bio-Rad), zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki przekształcono 0,5 µg plazmidu reporterowego LTP3-GUS + 0,5 µg wewnętrznego wzorca 2×35S-LUC oraz 2 µg pustego wektora PJIT60 (LTP3), 1 µg efektora 2×35S-PIF4 + 1 µg pjit60 (PIF4) lub 1 µg każdego 2×35S-PIF4 i 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA lub 2×35S-ΔRGA. – konstrukcje efektorowe del1rga (PIF4 + RGA, pif4 + δrga, pif4 + DEL1RGA). Filtry przeniesiono do świeżych płytek LT87 (- GA) lub do płytek LT87 + 50 µM GA3 (+ga) i inkubowano przez 16 godzin. komórki ekstrahowano w buforze do lizy komórek dostarczonym w zestawie do oznaczania Lucyferazy (Promega) i oczyszczano przez odwirowanie w temperaturze 12 000 g przez 5 minut. Aktywność LUC określono zgodnie z zestawem i aktywnością GUS określoną za pomocą testu fluorometrycznego35. Aktywność promotora LTP3 obliczono jako stosunek aktywności GUS do LUC w każdej próbce. Do każdego zabiegu użyto czterech płyt replik.

ekstrakcja RNA i odwrotna transkryptaza (RT)–PCR

do analizy ekspresji genów, całkowity RNA ekstrahowano z 4-dniowych sadzonek metodą guanidyny-Hcl36, a następnie poddano działaniu DNaseI (Roche) przed oczyszczeniem przez QIAGEN Rneasy mini columns (Qiagen). RNA (1 µg) użyto do syntezy pierwszej nici cDNA przy użyciu zestawu archiwum cDNA O Dużej Pojemności (Applied Biosystems), a 1,0 µl tej reakcji wykorzystano jako szablon do amplifikacji PCR. Zestawy starterów AtLTP3-f/AtLTP3-R, Atexpan-f/Atexpan-R i Atactin8-f / Atactin8-r wykorzystano do amplifikacji transkryptów LTP3 (At5g59320), β-ekspanzyny (At2g20750) i aktyny-8 (At1g49240).

bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays

FULL-length open reading frame sequences for the Arabidopsis PIF4 and RGA proteins was amplified with starters PIF4YFP-f/ PIF4YFP-r and rgayfp-f / rgayfp-r, odpowiednio. Produkty PCR sklonowano do wektora pENTR / D-TOPO (Invitrogen) i wstawiono za pomocą reakcji LR (Invitrogen) do binarnych wektorów pBiFC (F. Parcy) zawierające amino-lub C-końcowe fragmenty fluorescencyjnego białka eyfp (eYFPN i eYFPC). Wszystkie osiem możliwych kombinacji par tych konstrukcji przekształcono w Agrobacterium tumefaciens i współinfiltrowano na powierzchnię osiową 2-3-tygodniowych roślin Nicothiana benthamiana, jak opisano 37. Białko p19 wirusa tomato bushy stunt zostało użyte do tłumienia wyciszania genów. Szczepy agrobakterium zawierające konstrukty pBiFC i plazmid wyciszający P19 były w stosunku D600 0,7:0,7:1 dla infiltracji. Fluorescencję wizualizowano w warstwach komórek naskórka liści po 2 dniach infiltracji za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu Leica DMR. Liście inkubowano z 1 µg ml-1 4′, 6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) do barwienia jąder.

Ko–immunoprecypitacje PIF4/RGA-GFP

ko-immunoprecypitacje białek RGA i PIF4 przeprowadzono na 7-dniowych transgenicznych nasionkach RGA-GFP-RGA 10 hodowanych w białym świetle. Sadzonki inkubowano w ciemności lub przenoszono na podłoże zawierające PAC lub GA i inkubowano przez dodatkowe 12 godzin przed ekstrakcją. Immunoprecypitację białka GFP-RGA przeprowadzono w temperaturze 4 °C przez 6 godzin, stosując przeciwciało anty-GFP (Santa Cruz Biotechnology) w buforze zawierającym 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, PMSF (1 mM) i inhibitory proteazy (Sigma). Białko g agaroza (Sigma) było używane do wytrącania kompleksów immunoproteinowych. Wykrywanie PIF4 przeprowadzono z użyciem przeciwciała anty-PIF4.

immunoprecypitacje chromatyny i amplifikacje PCR

testy immunoprecypitacji chromatyny przeprowadzono zgodnie z opisem poprzednio 29. Sadzonki PIF4-HA20 uprawiano na pożywce GM przez 6 dni w ciągłym czerwonym świetle, a następnie przenoszono na płytki zawierające GA lub PAC i trzymano przez noc w ciemności. Do immunoprecypitacji chromatyny użyto sadzonek (1,5–2 g) i 40 µl matrycy powinowactwa anty-HA (Roche). Wytrącony DNA rozpuszczono w 50 µl TE i 0,5 µl użyto do amplifikacji PCR przy użyciu starterów wymienionych w dodatkowej Tabeli 1. Warunki PCR były następujące: 94 °C przez 2 min, 35 cykli 94 °C przez 15 s, 55 °C przez 30 s I 72 °C przez 30 s, a następnie 72 °C przez 7 min. Sonikowane DNA wejściowe (0,3%) wykorzystano do kontroli ilościowej. Przeprowadzono analizy Western blot w celu określenia ilości odzyskanego białka PIF4 po immunoprecypitacji chromatyny. Plamy były immunodetekowane przeciwciałem przeciw peroksydazie o wysokim powinowactwie anty-HA (Roche).

mikroskopia

testy stabilności białka przeprowadzono przy użyciu systemu skanowania laserowego Radiance 2100 (Bio-Rad) połączonego z mikroskopem Zeiss Axiovert 200. Do wzbudzania GFP i chlorofilu zastosowano Laser jonowy argonu o długości fali 488 nm i diodę czerwoną o długości fali 637 nm. Zastosowano kombinację filtrów: rozdzielacz wiązki 560 DCLPXR i filtr emisji HQ 515/30 do GFP oraz HQ 660LP do detekcji chlorofilu. Obrazy były kolejno wykonywane przy użyciu oprogramowania LaserSharp v5.0 (Bio-Rad) i łączone przy użyciu oprogramowania LaserPix V. 4 image software (Bio-Rad).

test przesunięcia żelu

oligonukleotydy pLTP-WTf/R i Pltp-MUTf / R zostały użyte do wytworzenia sond LTP3 i specyficznych konkurentów stosowanych w testach EMSA. Oligonukleotydy wyżarzano w buforze enzymu restrykcyjnego 5× m i znakowano na końcu przez wypełnienie Klenowem. W przypadku ekstraktów białkowych, N. liście benthamiana infiltrowano szczepami Agrobacterium dla konstrukcji 35S–PIF4-HA (PIF4) i 35S–RGA-GFP (RGA) lub mieszaniną 1:1 (PIF4 + RGA) tych szczepów i konstruktem p19, jak opisano powyżej. Ekstrakty liści uzyskano przez homogenizację w buforze o wysokiej zawartości soli (20 mm HEPES, pH 7,9, 0,5 m KCl, 1 mm EDTA, 1 mM MgCl2, 0,5% nonidet P-40, 1 mM DTT, + inhibitor proteazy), oczyszczenie przez odwirowanie i późniejszą dializę przeciwko 1× BB (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,1 m KCl, 1 mm EDTA, 0,05% nonidet P-40, 0,5 mM DTT, 10% glicerol). Obecność równoważnych ilości białek PIF4 i RGA w ekstraktach oceniano poprzez wykrywanie western blot z przeciwciałami anty-HA (Roche) i anty-GFP (Santa Cruz). Do reakcji EMSA stosowano coraz większe ilości tych ekstraktów (5,0, 10,0, 15,0 µl). Ekstrakty inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej za pomocą znakowanej sondy i 100 ng Poli (dI-dIC) w 20 µl 1× BB i oddzielano 6% PAGE w 0,5× TBE. Do specyficznej konkurencji użyto 100-krotnego nadmiaru wyżarzanych oligonukleotydów typu dzikiego (WT) i zmutowanego (MUT).