Plantematerialer og vekstforhold
Villtype-og mutantplanter som ble brukt i denne studien, var alle i Col-0-økotypene med unntak AV RGA-GFP – rga-linjene10, som var I Ler-økotypen. phyB-9 frø31 ble hentet fra Arabidopsis Biologiske Ressurssenter. Pif4 overexpresser linjer og pif4 knockout mutasjoner (slr2 mutant)var de som er beskrevet i ref. 3. Doble pif4 pif5-mutanter ble oppnådd ved å krysse pif4-101 t-DNA-innsettingsallelet og SALK-087012-mutanten18 med en innsetting I pif5-genet. 20ox linjer som bærer en knockout T-DNA-innsetting I atga20ox1-genet (At4g25420) ble levert Av P. Hedden. GA-ufølsomme gai-linjer uttrykte det stabile GAI-proteinet under kontroll AV 35s-promotoren. Dobbelt-og trippelmutanter ble generert ved å krysse disse linjene og genotyping av avkom VED PCR-forsterkning eller northern blot-analyser.
Frø ble overflatesterilisert og sådd på GM agarplater uten sucrose32. Plater ble kaldbehandlet for 2 d ved 4 °C og spiring ble synkronisert med 3 h bestråling med hvitt lys og påfølgende inkubasjon i mørket i 22 h, før overføring til de forskjellige vekstforholdene. Hvit-lys-vokst frøplanter ble dyrket på 20 °C under fluorescens hvitt lys (fluence rate på 40-60 µ m-2 s-1) med en 16 h lys/ 8 h mørk fotoperiode. For behandlinger med rødt lys ble frøplanter dyrket under kontinuerlig rødt lys(fluence rate på 35 µ m-2 s-1 levert av Led). For mørkvoksne frøplanter ble platene pakket inn i flere lag aluminiumsfolie. Plater ble plassert i vertikal retning og skannet for hypokotyllengde ved Hjelp Av ImageJ-programvaren (http://rsb.info.nih.gov/ij). For PAC-behandling ble frøene overført til plater med inhibitoren etter induksjon av spiring. Minst 20 frøplanter ble målt for hvert sett med eksperimenter.
Plantetransformasjon
et komplementært DNA-fragment inkludert FULL lengde ORF AV PIF4 ble forsterket med primere PIF4-GFPf OG PIF4-GFPr, klonet inn i pENTR/D-TOPO vektoren (Invitrogen) og satt inn i pk7fwg2 binær vektor (http://www.psb.ugent.be/gateway/) MED LR-klonasen (Invitrogen). Denne binære konstruksjonen ble introdusert i pgv3101-stammen Av Agrobacterium og forvandlet til villtype Col-0 og phyB Arabidopsis planter, ved hjelp av floral dip transformation method33. Transformanter ble valgt på kanamycinholdig medium og analysert FOR pif4-GFP nukleærfluorescens. Homozygote linjer ble valgt for sterke expressers.
GA, PAC og MG132 behandlinger
ga3 (GA) og paclobutrazol (PAC) aksjer ble nylaget i etanol. Proteasomhemmeren MG132 ble oppløst i DMSO. For mg132-behandling ble frøplanter pre-inkubert i 2 timer i en 100 µ oppløsning av inhibitoren. Pac og GA behandlinger ble utført til henholdsvis 0.1 µ og 50 µ, med mindre annet er angitt. Sensitivitet overfor inhibitoren ble beregnet som det inverterte forholdet mellom reduksjon i hypokotyllengde observert for frøplanter dyrket i 0,1 µ PAC i forhold til reduksjonen observert i Col-0 planter (100%). Verdier er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. GA-sensitivitet ble beregnet som forholdet mellom økningen i hypokotyllengde av frøplanter i 5,0 µ GA3 og referert til Villtype Col-0-frøplanter, som tidligere.
Gjær to-hybridanalyser
DELLA repressorer er kodet i potet med minst to gener, transkripsjonen representert ved den uttrykte sekvensmerket TC113247 er den mest uttrykte i vegetative vev. Den åpne leserammen i full lengde for DETTE della-proteinet ble forsterket ved hjelp av primere FPG1 og FPG2 og satt inn i rammen MED GAL4-BD i pbridge-vektoren (Clontech). For å unngå autoaktiveringsaktiviteten forbundet med DENNE full lengde konstruksjonen, Ble N-end (rester 1 til 188), F1 (rester 1 til 362), M5 (rester 188 til 588) og Cter (rester 362 til 588) konstruksjoner smeltet TIL GAL4-BD oppnådd ved fordøyelse på de unike SpeI-og EcoRI-restriksjonsstedene. Plasmider som inneholdt disse konstruksjonene, den tomme pbridge-vektoren (pGB) eller en p53-GAL4BD-fusjon i pgbkt7-vektoren (kontroll) ble omdannet TIL AH109 gjærceller og belagt PÅ SD-Trp og SD-Trp-Ade-his-platene for å teste for basal aktivering (Supplerende Fig. 1). Gjærstammer som inneholder F1, M5 eller Cter konstruksjonene ga den laveste bakgrunnsaktiviteten og ble brukt som agn. Gjærceller som inneholder disse konstruksjonene ble transformert med et bladpotetkomplementært DNA-bibliotek smeltet TIL GAL4-AD i pAD-GAL4-vektoren (Stratagene) og 1-3 × 106 uavhengige transformanter valgt PÅ SD-Leu-Trp-Ade-His for positiv interaksjon.ET DNA-fragment som svarer Til Arabidopsis pif4-proteinet i full lengde ble generert VED PCR-forsterkning med primere PIF4yf Og PIF4yr og satt inn I EcoRI-stedet for gjær – pgbkt7-og pGADT7-vektorene. Konstruksjoner For Arabidopsis PIF3-GAL4BD OG PIF3-GAL4AD fusjoner ble levert Av P. Quail.Delesjonskonstruksjoner for della-og PIF4-proteinene ble oppnådd ved invers PCR–reaksjon på rga–BD-og PIF4-AD-konstruksjonene i pbridge-og pAD-GAL4-vektorene. Konstruerer del1RGA og del2RGA ble generert ved hjelp av primere RGAdel1 eller RGAdel2 og pBridBam, som introduserer Et BamHI-restriksjonssted i hver ende. For å generere konstruksjoner del1PIF4, del2PIF4 og del3PIF4 ble det unike XbaI-nettstedet i pAD-GAL4 polylinker slettet ved utfylling. Dette plasmidet ble deretter brukt som en mal for inverse PCR-reaksjoner Med primere PIF4del1, PIF4del2 eller PIF4del3 og pGADXba, og introduserte Et xbai-restriksjonssted i hver ende. PCR-produkter ble fordøyd enten Med BamHI eller XbaI, religiert og forvandlet Til Escherichia coli for å oppnå de forskjellige konstruksjonene. Disse plasmidene ble omdannet TIL AH109 gjærstammen og belagt PÅ SD-4-plater for å analysere for interaksjon. β-galaktosidaseaktivitet ble bestemt på flytende kulturer av disse transformantene ved BRUK AV onpg-substratet og standardprotokollbetingelser.Konstruksjoner som tilsvarer potet-rga M5-fragmentet for Arabidopsis della-genene RGA1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) og RGL3 (At5g17490) ble generert VED PCR-forsterkning med primersettene RGL1pGB-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB – r, rgapgb-f/Rgapgb-r OG Rgapgb-F/Gaipgb-R (SUPPLERENDE TABELL 1). Disse fragmentene ble satt inn i gjær pgbkt7-vektoren ved hjelp av restriksjonsenzymene BamHI / SalI FOR RGL1, SalI / PstI FOR RGL3 og BamHI/PstI FOR RGA1 og GAI.
Nedtrekksanalyser
ET DNA-fragment som koder For Arabidopsis rga-proteinet i full lengde ble oppnådd VED PCR-forsterkning med primere RGAgst-f og RGAgst-r og klonet inn I BamHI-stedet for pzex-vektoren for å oppnå en in-frame-fusjon med GST-kodingsområdet. Rga-pZEX og den tomme pzex-vektoren ble omdannet TIL e. coli-stammen BL21(DE3)pLysS (Stratagene) og kulturer av disse cellene dyrket ved 37 °C Til a D600 = 0,8. Ekspresjon AV GST-proteinene ble indusert med 1 mM IPTG, i ytterligere 3 timer ved 30 °C, og proteinekstraksjon og binding til gluthathione-Sepharose perler (Clontech) ble utført i henhold til protokollen levert av produsenten.pif4 -, PIF3-og karboksyterminale phyA-konstruksjoner i pgbkt7-vektoren ble brukt som maler for in vitro transkripsjon / oversettelse, i nærvær AV 35s-metionin, ved Bruk Av TnT-systemet (Promega). Plasmid-DNA (1 µ) ble brukt i hver reaksjon. Ved nedtrekk ble 10 µ av oversettelsesreaksjonene inkubert i 30 minutter med rga-GST og GST-perlene (1 µ proteinbundet til perlene) I PBS, 0,05% tergitol, 10% glyserol. Perlene ble grundig vasket, resuspendert i 2× lastebuffer og analysert av SDS-PAGE for proteinbinding.
Transient expression assays
DNA-fragmenter som koder For Arabidopsis-PIF4-og rga-proteinene i full lengde, og ③GA-og del1RGA-slettingene ble oppnådd VED PCR-forsterkning Med primerpar PIF4yf og PIF4yr, RGAGST-f og RGAgst-r, Δ-f og rgagast-r og del1RGA-f og rgagst-r, og satt inn i polilynker EcoRI eller BamHI nettsteder av pjit60-Vektoren, under kontroll av 2×35s-PROMOTOREN. En G-boks motiv fragment rapportert av gel-shift analyser for å være et mål element FOR PIF4 recognition34 ble smeltet til gus reporter genet og brukes som en reporter konstruere. Vi var ikke i stand TIL å oppdage PIF4-mediert stimulering av denne reporterkonstruksjonen, noe som indikerer at ytterligere nukleotidsekvenser rundt CACGTG-motivet kan være nødvendig for effektiv aktivering. For å søke etter et promotorelement som er egnet til bruk i disse analysene, ble foreløpige rna-profileringseksperimenter av 35s-PIF4-og pif4-mutanter utført, og dermed identifisert LTP3 (At5g59320) som et sterkt oppregulert transkripsjon i 35s-PIF4-frøplanter. Promotorregionen for dette genet ble forsterket ved hjelp Av primere LT3p-f Og LTP3p-r og satt inn I EcoRI-og BamHI-stedene i pgus-vektoren for å oppnå LTP3-GUS reporter-konstruksjonen. Den 2×35S-luciferase fusion ble brukt som intern kontroll. Arabidopsis-celler ble spredt på filterpapir og inkubert over natten på LT87 medium (4.4 g l-1 Murashige og Skoog salter + vitaminer, 0.5 g l-1 MES, 0.5 g l-1 NAA, 30 g l – 1 sukrose, 8 g l-1 agar). To timer før bombardement ble filtre overført TIL LT87 medium med 200 mM mannitol for å indusere vakuoltrekning. DNA-nedbør og partikkelbombardement ble utført ved hjelp av en heliumdrevet partikkelakselerator (PDS-1000; Bio-Rad), i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble transformert med 0,5 µg av LTP3-GUS reporter plasmider + 0.5 µg av 2×35S-LUC intern standard, og enten 2 µg av pJIT60 tom vektor (LTP3), 1 µg av 2×35S-PIF4 effector konstruere + 1 µg pJIT60 (PIF4), eller 1 µg av hver 2×35S-PIF4 og 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA eller 2×35S-del1RGA effector konstruksjoner (PIF4 + RGA, PIF4 + ΔRGA, PIF4 + del1RGA). Filtre ble overført til FRISKE LT87-plater (- GA) eller TIL LT87-plater + 50 µ GA3 (+GA)og inkubert i 16 timer. Celler ble ekstrahert i cellelysebufferen som ble gitt i Luciferase Assay System kit (Promega) og fjernet ved sentrifugering ved 12 000 g i 5 min. LUC-aktivitet ble bestemt i henhold til kit-og GUS-aktivitet bestemt ved fluorometrisk analyse35. LTP3 promoter aktivitet ble beregnet som forholdet MELLOM GUS OG LUC aktivitet i hver prøve. Fire kopi plater ble brukt for hver behandling.
rna-ekstraksjoner og revers transkriptase (RT)–PCR
for genuttrykksanalyser ble totalt RNA ekstrahert fra 4 dager gamle frøplanter ved hjelp av guanidin-HCl-metoden36 og deretter behandlet Med DNaseI (Roche) før rengjøring gjennom Qiagen Rneasy Minikolonner (Qiagen). RNA (1 µ) ble brukt for første-tråd cDNA syntese ved Hjelp av høy Kapasitet cDNA Arkiv Kit (Applied Biosystems) og 1,0 µ av denne reaksjonen ble brukt som mal FOR PCR forsterkning. Primersett AtLTP3-f / AtLTP3-r, Atexpan-f/Atexpan-r og Atactin8-f/Atactin8-r ble brukt til forsterkning AV LTP3 (AT5G59320), β-expansin (At2g20750) og actin-8 (At1g49240) transkripsjoner.
Bimolekylære fluorescens komplement (BiFC) analyser
full lengde åpne leseramme sekvenser For Arabidopsis PIF4 og RGA proteiner ble forsterket med primere PIF4YFP-f/ PIF4YFP-r og rgayfp-f/ RGAYFP-r, henholdsvis. PCR-produktene ble klonet i pENTR / D-TOPO-vektoren (Invitrogen) og satt inn VED LR-reaksjon (Invitrogen) i de binære pbifc-vektorene (F. Parcy) som inneholder amino – eller C-terminale fragmenter av eYFP fluorescerende protein (eYFPN og eYFPC). Alle åtte mulige parvise kombinasjoner av disse konstruksjonene ble omdannet Til Agrobacterium tumefaciens og co-infiltrert i abaksial overflaten av 2-3 uker Gamle Nicothiana benthamiana planter som beskrevet 37. P19-proteinet av tomatbushy stuntvirus ble brukt til å undertrykke gendeaktivering. Agrobacterium-stammer som inneholdt pbifc-konstruksjonene og p19-silencing-plasmidet var I Et D600-forhold på 0,7: 0,7: 1 for infiltrasjon. Fluorescens ble visualisert i epidermale cellelag av bladene etter 2 dager med infiltrasjon, ved Hjelp Av Et Leica DMR-fluorescerende mikroskop. Bladene ble inkubert med 1 µ ml-1 4′, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for kjernefarging.
pif4/RGA–GFP co-immunoprecipitations
co-immunoprecipitation studier AV RGA og PIF4 proteiner ble utført på 7-dagers GAMLE rga–GFP-rga transgene frøplanter10 dyrket under hvitt lys. Frøplanter ble enten inkubert i mørket eller overført TIL PAC – eller GA-holdig medium og inkubert i 12 ekstra timer før ekstraksjon. Immunopresipitasjon AV gfp-RGA-proteinet ble utført ved 4 °c i 6 timer ved bruk av et anti-GFP-antistoff (Santa Cruz Bioteknologi) i en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, PMSF (1 mM) Og proteasehemmere (Sigma). Protein g agarose (Sigma) ble brukt til å utfelle immunoproteinkompleksene. Pif4-deteksjon ble utført med et ANTI-PIF4-antistoff.
Kromatinimmunprecipitasjoner og PCR-forsterkninger
kromatinimmunprecipitasjonsanalyser ble utført som beskrevet tidligere29. Pif4-HA seedlings20 ble dyrket PÅ GM medium for 6 dager under kontinuerlig rødt lys og deretter ble overført til plater som inneholder ENTEN GA ELLER PAC og holdt over natten i mørket. Frøplanter (1,5–2 g) og 40 µ Av Anti-HA Affinitetsmatrisen (Roche) ble brukt til kromatinimmunopresipitasjon. Utfelt DNA ble oppløst i 50 hryvnias av TE, og 0,5 µ ble brukt TIL PCR-forsterkning ved bruk av primere listet opp i Tilleggstabell 1. PCR-forholdene var som følger: 94 hryvnias C i 2 min, 35 sykluser av 94 hryvnias C i 15 s, 55 hryvnias C i 30 s og 72 hryvnias C i 30 s, etterfulgt av 72 hryvnias C i 7 min. Sonikert input-DNA (0,3%) ble brukt til kvantitativ kontroll. Western blot-analyser ble utført for å kvantifisere mengden gjenvunnet PIF4-protein etter kromatinimmunopresipitasjon. Blottene ble immundetektert med Et Anti-HA peroxidase High Affinity antistoff (Roche).
Mikroskopi
proteinstabilitetsanalyser ble utført ved Bruk Av Radiance 2100 (Bio-Rad) Laserskanningssystem koblet til Et Zeiss Axiovert 200-mikroskop. FOR GFP og klorofyll eksitasjon, en argon ion laser ved 488 nm bølgelengde og en rød diode ved 637 nm ble anvendt, henholdsvis. Kombinasjonen av filtre som ble brukt var: 560 dclpxr stråle splitter OG HQ 515/30 utslipp filter FOR GFP, OG HQ 660LP for klorofyll deteksjon. Bildene ble sekvensielt tatt med LaserSharp v5. 0-programvaren (Bio-Rad) og slått sammen med LaserPix v. 4 image software (Bio-Rad).
Gel-shift assay
oligonukleotidene pLTP-WTf/r og pLTP-MUTf / r ble brukt til å generere LTP3-prober og spesifikke konkurrenter brukt I EMSA-analyser. Oligonukleotider ble glødet i 5× m restriksjon enzymbuffer og sluttmerket ved utfylling Med Klenow. For proteinekstrakter, N. benthamiana blader ble infiltrert Med Agrobacterium stammer FOR 35s-PIF4–HA (PIF4) og 35s-RGA–GFP (RGA) konstruksjoner eller med en 1:1 blanding (PIF4 + RGA) av disse stammene og med p19 konstruere som beskrevet ovenfor. Bladekstrakter ble oppnådd ved homogenisering i høy saltbuffer (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0,5% nonidet P-40, 1 mM DTT, + proteasehemmer), clearing ved sentrifugering og påfølgende dialyse mot 1× BB (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,1 M KCl, 1 mM EDTA, 0,05% nonidet P-40, 0,5 mM DTT, 10% glyserol). Tilstedeværelsen av ekvivalente mengder PIF4-og RGA-proteiner i ekstraktene ble vurdert ved påvisning av western blot med anti-HA (Roche) og anti-Gfp (Santa Cruz) antistoffer. Økende mengder av disse ekstraktene (5,0, 10,0, 15,0 µ) ble brukt TIL EMSA-reaksjonen. Ekstrakter ble inkubert i 15 min ved romtemperatur med den merkede sonden og 100 ng poly (dI-dIC) i 20 µ 1× BB og separert med 6% SIDE i 0.5× tbe. Et 100 ganger overskudd av villtype (WT) og mutant (MUT) glødet oligonukleotider ble brukt til spesifikk konkurranse.
