植物材料と成長条件

本研究で使用された野生型および変異体植物は、LerエコタイプにあったRGA-GFP-RGA lines10を除いて、Col-0エコタイプであった。 phyB-9種子31は、シロイヌナズナ生物資源センターから得られた。 PIF4過剰発現株およびpif4ノックアウト変異（slr2変異体）は、参考文献に記載されているものであった。 3. 二重pif4pif5変異体は、pif4-101T-DNA挿入対立遺伝子およびSALK-087012変異体18をPIF5遺伝子に挿入して交差させることによって得られた。 Ａｔｇａ２ ０Ｏｘ１遺伝子中にノックアウトＴ−ＤＮＡ挿入を担持する２ ０ｏｘ系統（Ａｔ４Ｇ２ ５ ４ ２ ０）は、Ｐ． GA非感受性gaiラインは、35Sプロモーターの制御下で安定したGAIタンパク質を発現した。 二重および三重変異体は、これらの系統を交配し、PCR増幅またはノーザンブロット分析によって子孫をジェノタイピングすることによって生成された。

種子を表面滅菌し、sucrose32なしでGM寒天プレートに播種した。 プレートは、2℃で4dのために冷処理し、発芽は、異なる成長条件に転送する前に、白色光と22hの暗闇の中でその後のインキュベーションと照射の3hに 白色光成長苗は、蛍光白色光（40-60μ mol m-2s-1のフルエンス速度）の下で20℃で16時間の光/8時間の暗い光周期で成長させた。 赤色光処理のために、苗を連続赤色光（Ｌｅｄによって提供される３ ５μ ｍｏｌ ｍ−２ｓ−１のフルエンス速度）の下で成長させた。 暗色の苗の場合、プレートはアルミニウム箔のいくつかの層で包まれた。 プレートを垂直方向に配置し、ｉｍａｇｅｊソフトウェア（＜ｄｉｖ ｉｄ＝”０ ０ｃｄｅ１ ６ ０ｂ５”＞＜／ｄｉｖ＞）を使用してはい軸の長さをスキャンした。 ＰＡＣ処理のために，発芽の誘導後，種子を阻害剤を有するプレートに移した。 少なくとも20苗は、実験の各セットのために測定されました。PIF4の全長ORFを含む相補的DNA断片をプライマー PIF4-GFPfおよびPIF4-GFPrで増幅し、pENTR/D-TOPOベクター（Invitrogen）にクローニングし、lrクロナーゼ（Invitrogen）でpk7fwg2バイナリーベクター（http://www.psb.ugent.be/gateway/）に挿入した。 このバイナリ構築物は、Agrobacteriumのpgv3101株に導入され、花のディップ変換method33を使用して、野生型Col-0とphyBシロイヌナズナ植物に変換されました。 形質転換体は、カナマイシン含有培地上で選択され、PIF4-GFP核蛍光のために分析した。 強い発現剤のためにホモ接合株を選択した。

GA、PACおよびMG132処置

GA3（GA）およびpaclobutrazol（PAC）在庫はエタノールで新たに準備されました。 プロテアソーム阻害剤MG132をDMSOに溶解した。 MG132処理のために、苗を阻害剤の100μ m溶液中で2時間予備インキュベートした。 示されていない限り、PACおよびGA処理は、それぞれ0.1μ mおよび50μ mで行われた。 阻害剤に対する感度は、Col-0植物（100％）で観察された減少に比べて0.1μ m PACで成長した苗のために観察されたはい軸長の減少の反転比として計算された。 値は、3つの独立した実験の平均値です。 GA感度は、5.0μ m GA3における苗のはい軸長の増加の比として計算され、以前のように野生型Col-0苗に参照されました。

酵母ツーハイブリッドアッセイ

DELLAリプレッサーは、少なくとも二つの遺伝子によってジャガイモにコードされており、発現された配列タグTC113247によ このＤＬＡタンパク質の全長開放読取フレームを、プライマー ＦＰＧ１およびＦＰＧ２を使用して増幅し、ＧＡＬ４−ＢＤと共にフレーム中にｐＢｒｉｄｇｅベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入した。 この全長構築物に関連する自己活性化活性を回避するために、Gal4-BDに融合したN末端（残基1〜188）、F1（残基1〜362）、M5（残基188〜588）およびCter（残基362〜588）構築物を、固有のSpeIおよびEcoRI制限部位で消化することにより得た。 これらの構築物を含むプラスミド、空のｐＢｒｉｄｇｅベクター（ｐｇｂ）またはｐＧＢＫＴ７ベクター（対照）中のｐ５ ３−ＧＡＬ４ＢＤ融合物を、Ａ Ｈ１ ０ ９酵母細胞に形質転換し、ＳＤ−ＴｒｐおよびＳＤ−Ｔｒｐ−Ａｄ Ｅ−Ｈｉｓプレート 1). F1、M5またはCter構築物を含む酵母株は、最低の背景活性を与え、餌として使用された。 これらの構築物を含有する酵母細胞を、ｐａｄ−ＧＡＬ４ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中のＧＡＬ４−ＡＤと融合した葉ジャガイモ相補的ＤＮＡライブラリーと、正の相互作用のためにＳＤ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｄｅ−Ｈｉｓ上で選択された１〜３×１ ０ ６個の独立した形質転換体で形質転換した。

シロイヌナズナPIF4全長タンパク質に対応するDNA断片は、プライマー Pif4YfとPif4YrとPCR増幅によって生成され、酵母pgbkt7とpgadt7ベクターのEcoRIサイトに挿入 シロイヌナズナＰＩＦ３−ＧＡＬ４Ｂ ＤおよびＰＩＦ３−ＧＡＬ４ＡＤ融合のための構築物は、Ｐ．Ｑｕａｉｌによって提供された。

dellaおよびPIF4タンパク質の欠失構築物は、pBridgeおよびpAD–GAL4ベクターのRGA–BDおよびPIF4-AD構築物上の逆PCR反応によって得られた。 構築物ＤＥＬ１ＲＧＡおよびＤＥＬ２ＲＧＡは、プライマー Ｒｇａｄｅｌ１またはＲｇａｄｅｌ２およびＰＢＲＩＤＢＡＭを使用して生成され、これは、各末端にＢａｍｈｉ制限部位を導入する。 構築物ＤＥＬ１ＰＩＦ４、ＤＥＬ２ＰＩＦ４およびＤＥＬ３ＰＩＦ４を生成するために、ｐａｄ−ＧＡＬ４ポリリンカー中の固有のＸｂａｉ部位をフィルインによって削除した。 次いで、このプラスミドをプライマー Ｐｉｆ４Ｄｅｌ１、Ｐｉｆ４Ｄｅｌ２またはＰｉｆ４Ｄｅｌ３およびｐＧＡＤＸＢＡを用いて逆ＰＣＲ反応の鋳型として使用し、各末端にＸｂａｉ制限部位を導入した。 ＰＣＲ産物をＢａｍｈｉまたはＸｂａｉのいずれかで消化し、religatedし、大腸菌に形質転換して、異なる構築物を得た。 これらのプラスミドをAH109酵母株に形質転換し、相互作用のアッセイのためにSD-4プレート上にめっきした。 β-ガラクトシダーゼ活性は，ONＰＧ基質および標準プロトコル条件を用いてこれらの形質転換体の液体培養について決定した。プライマーセットRgl1Pgb-f/Rgl1Pgb-r、Rgl3Pgb-f/Rgl3Pgb-r、RGApGB-f/RGL3Pgb-r、Rgl3Pgb-f/RGL3Pgb-r、Rgl3PGB-f/RGL3Pgb-r、Rgl3PGB-f/RGL3Pgb-r、Rgl3PGB-f/RGL3Pgb-r、Rgl3Pgb-f/RGL3Pgb-r、RGL3Pgb-f/RGL3Pgb-r、RGL3Pgb-f/RGL3Pgb-r、RGL3Pgb-f/RGL3Pgb-r、RGL3PGB-f/RGL3Pgb-r、RGL3PGB-f/RGL3Pgb-r、RGL3PGB-f/RGL3Pgb-r、RGL3PGB-f/RGL3Pgb-r、RGL3PGB-f/RGL3RGAPGB-RおよびRGAPGB-f/GAIPGB-r(補足表1)。 これらの断片を、制限酵素Ｂａｍｈｉ／Ｓａｌｉ（ＲＧＬ１）、Ｓａｌｉ／Ｐｓｔｉ（ＲＧＬ３）、およびＢＡＭＨＩ／Ｐｓｔｉ（ＲＧＡ１およびＧＡＩ）を使用して酵母ｐＧＢＫＴ７ベクターに挿入した。

プルダウンアッセイ

シロイヌナズナRGA全長タンパク質をコードするDNA断片をプライマー RGAgst-fおよびRGAgst-rでPCR増幅し、pZEXベクターのBamHI部位にクローニングし、GSTコード領域とのインフレーム融合を得た。 ＲＧＡ−ｐＺｅｘおよび空のｐｚｅｘベクターを、ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２ １（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、これらの細胞の培養物を、３ ７℃でＤ６ ０ ０＝０． ＧＳＴタンパク質の発現は、１ｍ Ｍ ＩＰＴＧで、３ ０℃でさらに３時間誘導され、タンパク質の抽出およびｇｌｕｔｈａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）への結合は、製造業者によって供給されるプロトコＰｇｂｋｔ７ベクター中のＰＩＦ４、ＰＩＦ３およびカルボキシ末端ｐＨＹＡ構築物を、３ ５Ｓ−メチオニンの存在下、Ｔｎｔ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳のための鋳型として使用した。＜／ｐ＞＜ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞ プラスミドＤＮＡ（１μ ｇ）を各反応に使用した。 プルダウンのために、10μ lの翻訳反応物を、PBS、0.05％テルギトール、10％グリセロール中のRGA–GSTおよびGSTビーズ（ビーズに結合した1μ gのタンパク質）と共に30分間インキュベー ビーズを十分に洗浄し、２×負荷緩衝液中に再懸濁し、タンパク質結合についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

一過性発現アッセイ

シロイヌナズナ全長PIF4およびRGAタンパク質をコードするDNA断片、およびΔ RGAおよびdel1rga欠失は、プライマー対Pif4YfおよびPif4Yr、RGAGST-fおよびRGAgst-r、Δ RGA-fおよびrgagast-rおよびdel1rga-fおよびrgagst-rでPCR増幅することによって得られ、ポリリンカー EcoRIまたはBamHIサイトに挿入された。pjit60ベクターは、2×35sプロモーターの制御下にある。 PIF4recognition34の標的要素であることをゲルシフトアッセイによって報告されたGボックスモチーフ断片は、GUSレポーター遺伝子に融合し、レポーター構築物として使 我々は、CACGTGモチーフを囲む追加のヌクレオチド配列が効率的な活性化のために必要とされるかもしれないことを示す、このレポーター構築物のPIF4を介した刺激を検出することができませんでした。 これらのアッセイで使用するのに適したプロモーター要素を検索するには、35S-PIF4とpif4変異体の予備RNAプロファイリング実験は、それゆえ35S-PIF4苗 この遺伝子のプロモーター領域をプライマー Ｌｔ３Ｐ−ｆおよびＬｔｐ３Ｐ−ｒを用いて増幅し、ｐＧＵＳベクターのＥｃｏｒｉおよびＢａｍｈｉ部位に挿入して、ＬＴＰ３−ＧＵＳレポーター構築物を得た。 2×35S-ルシフェラーゼ融合は、内部対照として使用されました。 シロイヌナズナ細胞を濾紙上に広げ、LT87培地（4.4g l-1MurashigeおよびSkoog塩+ビタミン、0.5g l-1MES、0.5g l-1NAA、30g l-1ショ糖、8g l-1寒天）上で一晩インキュベー 砲撃の二時間前に、フィルターは液胞の後退を誘導するために200mMマンニトールとLT87培地に転送されました。 ＤＮＡ沈殿および粒子衝撃は、ヘリウム駆動粒子加速器（ＰＤＳ−１ ０ ０ ０；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、製造業者の説明書に従って実施した。 ２μ ｇのｐｊｉｔ６ ０空ベクター（ＬＴＰ３）、１μ ｇの２×３ ５Ｓ−ＰＩＦ４エフェクター構築物＋１μ ｇのｐＪＩＴ６ ０（ＰＩＦ４）、または１μ ｇの各２×３ ５Ｓ−ＰＩＦ４および２×３ ５Ｓ−ＲＧＡ、２×３ ５Ｓ−Δ ＲＧＡまたは２×３ ５Ｓ−Δ ＲＧＡ ｄｅｌ１ｒｇａエフェクター構築物（ｐｉｆ４＋ＲＧＡ、ＰＩＦ４＋Δ ＲＧＡ、ｐｉｆ４＋ＤＥＬ１ＲＧＡ）。 細胞を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に提供されたｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ中で抽出し、１ ２，０ ０ ０ｇで５分間遠心分離により除去した。 キットに従ってＬＵＣ活性を測定し、蛍光測定法によりＧＵＳ活性を測定した３ ５。 ＬＴＰ３プロモーター活性を、各試料中のＧＵＳ活性に対するＬＵＣ活性の比として計算した。 各処理に四つのレプリカプレートを用いた。

RNA抽出および逆転写酵素（RT）–PCR

遺伝子発現解析のために、グアニジン-HCl法36を用いて4日齢の苗から総RNAを抽出し、続いてDNaseI（Roche）で処理し、Qiagen RNeasy Mini columns（Qiagen）を介して洗浄した。 ＲＮＡ（１μ ｇ）を、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃ ＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた第１鎖ｃ ＤＮＡ合成に使用し、この反応の１． プライマーセットAtltp3-f/Atltp3-r、Atexpan-f/Atexpan-rおよびAtactin8-f/Atactin8-rを、LTP3(At5G59320)、β-エクスパンシン(At2G20750)およびアクチン-8(At1G49240)転写物の増幅に使用した。

二分子蛍光相補性（BiFC）アッセイ

シロイヌナズナPIF4とRGAタンパク質のための全長オープンリーディングフレームシーケンスは、それぞれ、プライマー PIF4YFP-f/PIF4YFP-rとRGAYFP-f/rgayfp-rで増幅した。 ＰＣＲ産物をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＬＲ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりバイナリｐＢＩＦＣベクター（Ｆ． Ｅｙｆｐ蛍光タンパク質（ＥＹＦＰＮおよびＥＹＦＰＣ）のアミノ末端断片またはＣ末端断片を含有するｐａｒｃｙ）。 これらの構築物のすべての可能なペアワイズの組み合わせは、Agrobacterium tumefaciensに変換され、記載されているように2-3週齢のNicothiana benthamiana植物のabaxial表面に共浸潤した37。 トマトブッシュスタントウイルスのp19タンパク質は、遺伝子サイレンシングを抑制するために使用された。 PBiFC構築物とp19サイレンシングプラスミドを含むアグロバクテリウム株は、浸潤のためのD600比0.7：0.7：1であった。 Leica DMR蛍光顕微鏡を用いて、浸潤の2日後に葉の表皮細胞層中の蛍光を可視化した。 葉を核染色のために１μ ｇ ｍｌ−１ ４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）とインキュベートした。

PIF4/RGA–GFP共免疫沈降RGAおよびPIF4タンパク質の共免疫沈降研究は、白色光下で成長した7日齢のRGA-GFP-RGAトランスジェニックシードリング10に 苗を暗所でインキュベートするか、またはPACまたはGA含有培地に移し、抽出前にさらに12時間インキュベートした。 ５、１ ５ ０ｍ Ｍ Ｎａｃｌ、０.５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０、ＰＭＳＦ（１ｍ Ｍ）およびプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を含む緩衝液中の抗ＧＦＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、４℃で６時間、ｇｆｐ−ＲＧＡタンパク質の免疫沈降を行った。 蛋白質Ｇアガロース（Ｓｉｇｍａ）を用いて免疫蛋白質複合体を沈殿させた。 ＰＩＦ４検出は、抗ＰＩＦ４抗体を用いて行った。

クロマチン免疫沈降およびPCR増幅

クロマチン免疫沈降アッセイは、前に記載されているように行った29。 ＰＩＦ４−Ｈ Ａ種子２ ０を、連続赤色光下でＧＭ培地上で６日間成長させ、次いで、Ｇ ＡまたはＰＡＣのいずれかを含有するプレートに移し、暗所で一晩保持した。 苗（1.5–2g）と抗HA親和性マトリックス（Roche）の40μ lは、クロマチン免疫沈降のために使用されました。 沈殿したDNAを50μ lのTEに溶解し、0.5μ lを補足表1に記載したプライマーを用いたPCR増幅に使用した。 ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９ ４℃で２分間、３ ５サイクルの９ ４℃で１ ５秒間、５ ５℃で３ ０秒間、および７ ２℃で３ ０秒間、続いて７ ２℃で７分間であった。 超音波処理された入力DNA（0.3％）は、定量的対照のために使用されました。 西部のしみの分析はクロマチンのimmunoprecipitationの後で回復されたPIF4蛋白質の量を定量するために行われました。 ブロットを抗Ｈ ａペルオキシダーゼ高親和性抗体（Ｒｏｃｈｅ）で免疫検出した。

顕微鏡

タンパク質安定性アッセイは、Zeiss Axiovert200顕微鏡に結合されたRadiance2100（Bio-Rad）レーザー走査システムを使用して行われました。 GFPおよびクロロフィル励起のために、488nmの波長のアルゴンイオンレーザーおよび637nmの赤いダイオードは、それぞれ用いられた。 使用されたフィルターの組合せは次のとおりだった:GFPのための560DCLPXRのビームスプリッターおよびHQ515/30の放出フィルター、およびクロロフィルの検出のためのHQ660LP。 画像は、LaserSharp v5.0ソフトウェア（Bio-Rad）を使用して順次撮影され、LaserPix v.4画像ソフトウェア（Bio-Rad）を使用してマージされた。

ゲルシフトアッセイ

オリゴヌクレオチドpLTP-WTf/rおよびpLTP-MUTf/rは、LTP3プローブおよびEMSAアッセイで使用される特定の競合他社を生成す オリゴヌクレオチドを5×M制限酵素緩衝液中でアニールし、Klenowで充填することによってエンド標識した。 蛋白質のエキスのため、N. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉に、３ ５Ｓ−ＰＩＦ４−Ｈ Ａ（ＰＩＦ４）および３ ５Ｓ−ＲＧＡ−ＧＦＰ（ＲＧＡ）構築物のためのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株、またはこれらの株の１：１混合物（ＰＩＦ４＋ＲＧＡ）および上記のようなｐ１ ９構築物を浸潤させた。 葉抽出物は、高塩緩衝液（20mM HEPES、pH7.9、0.5M KCl、1mM EDTA、1mM Mgcl2、0.5%nonidet P-40、1mM DTT、+プロテアーゼ阻害剤）中で均質化し、遠心分離および1×BB（20mM HEPES、pH7.9、0.1M KCl、1mM EDTA、0.05%nonidet P-40、0.5mM DTT、10%グリセロール）に対するその後の透析によって除去することによって得た。 抽出物中の同等量のＰＩＦ４およびＲＧＡタンパク質の存在を、抗Ｈ Ａ（Ｒｏｃｈｅ）および抗ＧＦＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）抗体を用いたウェスタンブロット検出によって評価した。 これらの抽出物の増加量（5.0、10.0、15.0μ l）は、EMSA反応のために使用されました。 抽出物を、標識プローブおよび１ ０ ０ｎｇポリ（ＤＩ−ＤＩＣ）を用いて室温で１ ５分間インキュベートし、２ ０μ ｌの１×ＢＢ中に入れ、０.５×ＴＢＥ中で６％ＰＡＧＥで分離した。 野生型（WT）と変異体（MUT）アニールオリゴヌクレオチドの100倍過剰は、特定の競争のために使用されました。