Materiali vegetali e condizioni di crescita
Piante Wild-type e mutanti utilizzate in questo studio erano tutte negli ecotipi Col-0 ad eccezione delle linee RGA-GFP–rga10, che erano nell’ecotipo Ler. I semi phyB-931 sono stati ottenuti dal Centro di risorse biologiche Arabidopsis. Linee di overexpresser PIF4 e mutazioni di knockout pif4 (mutante slr2) erano quelle descritte in ref. 3. I doppi mutanti pif4 pif5 sono stati ottenuti incrociando l’allele di inserimento del T-DNA pif4-101 e il mutante SALK-08701218 con un inserimento nel gene PIF5. le linee 20ox che trasportano un inserimento di T-DNA knockout nel gene AtGA20ox1 (At4g25420) sono state fornite da P. Hedden. Le linee gai GA-insensibili esprimevano la proteina GAI stabile sotto il controllo del promotore 35S. Mutanti doppi e tripli sono stati generati attraversando queste linee e genotipizzando la prole mediante amplificazione PCR o analisi northern blot.
I semi sono stati sterilizzati in superficie e seminati su piastre di agar GM senza sucrose32. Le piastre sono state trattate a freddo per 2 d a 4 ° C e la germinazione è stata sincronizzata da 3 h di irradiazione con luce bianca e successiva incubazione al buio per 22 h, prima del trasferimento alle diverse condizioni di crescita. Le piantine coltivate a luce bianca sono state coltivate a 20 ° C sotto luce bianca a fluorescenza (tasso di fluenza di 40-60 µmol m-2 s-1) con un fotoperiodo scuro chiaro 16 h/ 8 h. Per i trattamenti a luce rossa, le piantine sono state coltivate sotto luce rossa continua (tasso di fluenza di 35 µmol m-2 s-1 fornito da LED). Per le piantine scure, le piastre sono state avvolte in diversi strati di foglio di alluminio. Le piastre sono state posizionate in un orientamento verticale e scansionate per la lunghezza dell’ipocotile utilizzando il software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). Per il trattamento PAC, i semi sono stati trasferiti su piastre con l’inibitore, dopo l’induzione della germinazione. Almeno 20 piantine sono state misurate per ogni serie di esperimenti.
Trasformazione vegetale
Un frammento di DNA complementare comprendente l’ORF integrale di PIF4 è stato amplificato con primer PIF4-GFPf e PIF4-GFPr, clonato nel vettore pENTR/D-TOPO (Invitrogen) e inserito nel vettore binario pK7FWG2 (http://www.psb.ugent.be/gateway/) con la clonasi LR (Invitrogen). Questo costrutto binario è stato introdotto nel ceppo pGV3101 di Agrobacterium e trasformato in piante wild-type Col-0 e phyB Arabidopsis, utilizzando il metodo di trasformazione floreale dip33. I trasformanti sono stati selezionati su un mezzo contenente kanamicina e analizzati per la fluorescenza nucleare PIF4–GFP. Le linee omozigoti sono state selezionate per i forti espressi.
I trattamenti di GA, PAC e MG132
Le scorte di GA3 (GA) e paclobutrazol (PAC) sono state preparate di recente in etanolo. L’inibitore del proteasoma MG132 è stato sciolto in DMSO. Per il trattamento con MG132, le piantine sono state pre-incubate per 2 h in una soluzione 100 µM dell’inibitore. I trattamenti PAC e GA sono stati eseguiti rispettivamente a 0,1 µM e 50 µM, salvo indicazione. La sensibilità all’inibitore è stata calcolata come il rapporto invertito della riduzione della lunghezza dell’ipocotile osservata per le piantine coltivate in PAC 0,1 µM rispetto alla riduzione osservata nelle piante Col-0 (100%). I valori sono la media di tre esperimenti indipendenti. La sensibilità GA è stata calcolata come il rapporto tra l’aumento della lunghezza ipocotilica delle piantine in 5,0 µM GA3 e si fa riferimento alle piantine wild-type Col-0, come prima.
Lieviti a due ibridi
I repressori DELLA sono codificati nella patata da almeno due geni, la trascrizione rappresentata dal tag di sequenza espresso TC113247 è la più abbondantemente espressa nei tessuti vegetativi. Il frame di lettura aperto a tutta lunghezza per questa proteina DELLA è stato amplificato utilizzando primer FPG1 e FPG2 e inserito nel frame con il GAL4-BD nel vettore pBridge (Clontech). Per evitare l’attività di auto-attivazione associata a questo costrutto a tutta lunghezza, i costrutti N-end (residui da 1 a 188), F1 (residui da 1 a 362), M5 (residui da 188 a 588) e Cter (residui da 362 a 588) fusi al GAL4-BD sono stati ottenuti mediante digestione presso gli unici siti di restrizione SpeI ed EcoRI. Plasmidi contenenti questi costrutti, il vettore pBridge vuoto (pGB) o una fusione p53–GAL4BD nel vettore pGBKT7 (controllo) sono stati trasformati in cellule di lievito AH109 e placcati su piastre SD-Trp e SD-Trp-Ade-His, per testare l’attivazione basale (Fig. 1). Ceppi di lievito contenenti i costrutti F1, M5 o Cter hanno dato l’attività di fondo più bassa e sono stati utilizzati come esca. Le cellule di lievito contenenti questi costrutti sono state trasformate con una libreria di DNA complementare di patate fuse al GAL4-AD nel vettore pAD-GAL4 (Stratagene) e 1-3 × 106 trasformanti indipendenti selezionati su SD-Leu-Trp-Ade-His per un’interazione positiva.
Un frammento di DNA corrispondente alla proteina Arabidopsis PIF4 full-length è stato generato mediante amplificazione PCR con primer PIF4yf e PIF4yr e inserito nel sito EcoRI dei vettori lievito pGBKT7 e pGADT7. I costrutti per le fusioni Arabidopsis PIF3–GAL4BD e PIF3–GAL4AD sono stati forniti da P. Quail.
I costrutti di delezione per le proteine DELLA e PIF4 sono stati ottenuti mediante reazione PCR inversa sui costrutti RGA–BD e PIF4–AD nei vettori pBridge e pAD-GAL4. Costrutti del1RGA e del2RGA sono stati generati utilizzando primer RGAdel1 o RGAdel2 e pBridBam, che introducono un sito di restrizione BamHI a ciascuna estremità. Per generare costrutti del1PIF4, del2PIF4 e del3PIF4, il sito XbaI unico nel polylinker pAD-GAL4 è stato eliminato da fill-in. Questo plasmide è stato quindi utilizzato come modello per reazioni PCR inverse con primer PIF4del1, PIF4del2 o PIF4del3 e pGADXba, introducendo un sito di restrizione XbaI a ciascuna estremità. I prodotti PCR sono stati digeriti con BamHI o XbaI, religed e trasformati in Escherichia coli per ottenere i diversi costrutti. Questi plasmidi sono stati trasformati nel ceppo di lievito AH109 e placcati su piastre SD-4 per analizzare l’interazione. l’attività della β-galattosidasi è stata determinata su colture liquide di questi trasformanti utilizzando il substrato ONPG e le condizioni del protocollo standard.
Costrutti equivalente alla patata RGA M5 frammento per il Arabidopsis geni DELLA RGA1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) e RGL3 (At5g17490) sono stati generati dall’amplificazione di PCR con i primer set RGL1pGB-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r, RGApGB-f/RGApGB-r e RGApGB-f/GAIpGB – r (Tabella Supplementare 1). Questi frammenti sono stati inseriti nel vettore pGBKT7 del lievito usando gli enzimi di restrizione BamHI / SalI per RGL1, SalI / PstI per RGL3 e BamHI / PstI per RGA1 e GAI.
Test pull-down
Un frammento di DNA che codifica la proteina Arabidopsis RGA full-length è stato ottenuto mediante amplificazione PCR con primer RGAgst-f e RGAgst-r e clonato nel sito BamHI del vettore pZEX, per ottenere una fusione in-frame con la regione di codifica GST. Il vettore RGA-pZEX e vuoto pZEX sono stati trasformati nel ceppo di E. coli BL21 (DE3) pLysS (Stratagene) e colture di queste cellule coltivate a 37 °C ad un D600 = 0.8. L’espressione delle proteine GST è stata indotta con 1 mm IPTG, per 3 ore aggiuntive a 30 °C, e l’estrazione delle proteine e il legame con le perle di gluthathione-Sepharose (Clontech) è stata eseguita secondo il protocollo fornito dal produttore.
I costrutti PIF4, PIF3 e carbossi-terminali phyA nel vettore pGBKT7 sono stati utilizzati come modelli per la trascrizione / traduzione in vitro, in presenza di 35S-metionina, utilizzando il sistema TnT (Promega). Il DNA plasmidico (1 µg) è stato utilizzato in ogni reazione. Per il pull-down, 10 µl delle reazioni di traduzione sono state incubate per 30 min con le perle RGA-GST e GST (1 µg di proteina legata alle perle) in PBS, 0,05% tergitolo, 10% glicerolo. Le perle sono state accuratamente lavate, risospese in 2× buffer di caricamento e analizzate da SDS-PAGE per il legame proteico.
dosaggi di espressione Transitoria
frammenti di DNA che codifica per la Arabidopsis full-length PIF4 e RGA proteine, e il ΔRGA e del1RGA eliminazioni sono stati ottenuti dall’amplificazione di PCR con primer coppie PIF4yf e PIF4yr, RGAgst-f e RGAgst-r, ΔRGA-f e RGAgast-r e del1RGA-f e RGAgst-r, e inserito nel polilynker EcoRI o BamHI siti di pJIT60 vettoriale, sotto il controllo di 2×promotore 35S. Un frammento di motivo G-box riportato dai test gel-shift come elemento bersaglio per il riconoscimento PIF434 è stato fuso al gene GUS reporter e utilizzato come costrutto reporter. Non siamo stati in grado di rilevare la stimolazione mediata da PIF4 di questo costrutto reporter, indicando che potrebbero essere necessarie ulteriori sequenze nucleotidiche che circondano il motivo CACGTG per un’attivazione efficiente. Per cercare un elemento promotore adatto per essere utilizzato in questi test, sono stati eseguiti esperimenti preliminari di profilazione dell’RNA di mutanti 35S-PIF4 e pif4, identificando quindi LTP3 (At5g59320) come una forte trascrizione sovraregolata nelle piantine 35S-PIF4. La regione promotrice di questo gene è stata amplificata utilizzando primer LT3p-f e LTP3p-r e inserita nei siti EcoRI e BamHI del vettore pGUS per ottenere il costrutto reporter LTP3-GUS. La fusione 2×35S-luciferasi è stata utilizzata come controllo interno. Le cellule di arabidopsis sono state diffuse su carta da filtro e incubate durante la notte su mezzo LT87 (4,4 g l-1 Sali di Murashige e Skoog + vitamine, 0,5 g l-1 MES, 0,5 g l-1 NAA, 30 g l-1 saccarosio, 8 g l-1 agar). Due ore prima del bombardamento, i filtri sono stati trasferiti al mezzo LT87 con mannitolo da 200 mm per indurre la retrazione del vacuolo. La precipitazione del DNA e il bombardamento di particelle sono stati eseguiti utilizzando un acceleratore di particelle azionato da elio (PDS-1000; Bio-Rad), secondo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state trasformate con 0,5 µg dei LTP3-GUS plasmide reporter + 0,5 µg di 2×35S-LUC standard interno, e di 2 µg di pJIT60 vettore vuoto (LTP3), 1 µg di 2×35S-PIF4 effettrici costruire + 1 µg pJIT60 (PIF4), o 1 µg di ogni 2×35S-PIF4 e 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA o 2×35S-del1RGA effettrici costrutti (PIF4 + RGA, PIF4 + ΔRGA, PIF4 + del1RGA). I filtri sono stati trasferiti a piastre LT87 fresche (- GA) o a piastre LT87 + 50 µM GA3 (+GA) e incubati per 16 h. Le cellule sono state estratte nel tampone di lisi cellulare fornito nel kit del sistema di dosaggio Luciferasi (Promega) e eliminate mediante centrifugazione a 12.000 g per 5 min. L’attività LUC è stata determinata in base all’attività kit e GUS determinata mediante analisi fluorometrica35. L’attività del promotore LTP3 è stata calcolata come il rapporto tra l’attività di GUS e LUC in ciascun campione. Quattro piastre di replica sono state utilizzate per ogni trattamento.
Estrazioni di RNA e trascrittasi inversa (RT)–PCR
Per le analisi di espressione genica, l’RNA totale è stato estratto da piantine di 4 giorni utilizzando il metodo guanidina-hcl36 e successivamente trattato con DNaseI (Roche) prima della pulizia attraverso Qiagen RNeasy Mini columns (Qiagen). L’RNA (1 µg) è stato utilizzato per la sintesi di cDNA di primo filamento utilizzando il kit di archiviazione cDNA ad alta capacità (Applied Biosystems) e 1,0 µl di questa reazione è stato utilizzato come modello per l’amplificazione PCR. I set di primer AtLTP3-f/AtLTP3-r, Atexpan-f/Atexpan-r e Atactin8-f/Atactin8-r sono stati utilizzati per l’amplificazione dei trascritti LTP3 (At5g59320), β-expansin (At2g20750) e actin-8 (At1g49240).
I test BiFC (Bimolecular fluorescence Complementation)
Le sequenze full-length open reading frame per le proteine Arabidopsis PIF4 e RGA sono state amplificate con primer PIF4YFP-f/ PIF4YFP-r e RGAYFP-f / RGAYFP-r, rispettivamente. I prodotti PCR sono stati clonati nel vettore pENTR / D-TOPO (Invitrogen) e inseriti per reazione LR (Invitrogen) nei vettori binari pBiFC (F. Parcy) contenente i frammenti amminici o C-terminali della proteina fluorescente eYFP (eYFPN ed eYFPC). Tutte le otto possibili combinazioni a coppie di questi costrutti sono state trasformate in Agrobacterium tumefaciens e co-infiltrate nella superficie abassiale delle piante di Nicothiana benthamiana di 2-3 settimane come descritto37. La proteina p19 del virus stunt bushy del pomodoro è stata utilizzata per sopprimere il silenziamento genico. I ceppi di Agrobacterium contenenti i costrutti pBiFC e il plasmide di silenziamento p19 erano a un rapporto D600 di 0,7: 0,7: 1 per infiltrazione. La fluorescenza è stata visualizzata negli strati cellulari epidermici delle foglie dopo 2 giorni di infiltrazione, utilizzando un microscopio fluorescente Leica DMR. Le foglie sono state incubate con 1 µg ml-1 4′, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per la colorazione dei nuclei.
Co–immunoprecipitazioni PIF4/RGA-GFP
Studi di co-immunoprecipitazione delle proteine RGA e PIF4 sono stati eseguiti su piantine transgeniche RGA-GFP-RGA di 7 giorni10 coltivate sotto luce bianca. Le piantine sono state incubate al buio o trasferite in un terreno contenente PAC o GA e incubate per 12 ore aggiuntive prima dell’estrazione. L’immunoprecipitazione della proteina GFP–RGA è stata eseguita a 4 °C per 6 ore, utilizzando un anticorpo anti-GFP (Santa Cruz Biotechnology) in un tampone contenente 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mm NaCl, 0,5% Triton X-100, PMSF (1 mM) e inibitori della proteasi (Sigma). La proteina G agarosio (Sigma) è stata utilizzata per precipitare i complessi immunoproteici. Il rilevamento PIF4 è stato eseguito con un anticorpo anti-PIF4.
Immunoprecipitazioni alla cromatina e amplificazioni della PCR
I test di immunoprecipitazione alla cromatina sono stati eseguiti come descritto in precedenza29. Le piantine PIF4–ha20 sono state coltivate su terreno GM per 6 giorni sotto luce rossa continua e poi sono state trasferite su piastre contenenti GA o PAC e tenute per una notte al buio. Piantine (1,5-2 g) e 40 µl della matrice di affinità anti-HA (Roche) sono state utilizzate per l’immunoprecipitazione della cromatina. Il DNA precipitato è stato sciolto in 50 µl di TE e 0,5 µl è stato utilizzato per l’amplificazione della PCR utilizzando i primer elencati nella Tabella supplementare 1. Le condizioni di PCR erano le seguenti: 94 ° C per 2 min, 35 cicli di 94 ° C per 15 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 30 s, seguiti da 72 °C per 7 min. Il DNA di ingresso sonicato (0,3%) è stato utilizzato per un controllo quantitativo. Le analisi di Western blot sono state eseguite per quantificare la quantità di proteina PIF4 recuperata dopo immunoprecipitazione della cromatina. Le macchie sono state immunodettificate con un anticorpo ad alta affinità anti-HA perossidasi (Roche).
Microscopia
I test di stabilità delle proteine sono stati eseguiti utilizzando il sistema di scansione laser Radiance 2100 (Bio-Rad) accoppiato a un microscopio Zeiss Axiovert 200. Per l’eccitazione della clorofilla e di GFP, un laser dello arg dell’argon alla lunghezza d’onda di 488 nanometro ed un diodo rosso a 637 nanometro sono stati impiegati, rispettivamente. La combinazione di filtri utilizzati era: 560 DCLPXR beam splitter e filtro di emissione HQ 515/30 per GFP e HQ 660LP per il rilevamento della clorofilla. Le immagini sono state scattate in sequenza utilizzando il software LaserSharp v5.0 (Bio-Rad) e fuse utilizzando il software di immagine LaserPix v. 4 (Bio-Rad).
Gel-shift assay
Gli oligonucleotidi pLTP-WTf/r e pLTP-MUTf / r sono stati utilizzati per generare le sonde LTP3 e i concorrenti specifici utilizzati nei saggi EMSA. Gli oligonucleotidi sono stati ricotti in un tampone enzimatico di restrizione 5× M e etichettati con il riempimento di Klenow. Per gli estratti proteici, N. le foglie di benthamiana sono state infiltrate con i ceppi Agrobacterium per i costrutti 35S–PIF4-HA (PIF4) e 35S–RGA-GFP (RGA) o con una miscela 1:1 (PIF4 + RGA) di questi ceppi e con il costrutto p19 come descritto sopra. Gli estratti di foglie sono stati ottenuti mediante omogeneizzazione in tampone ad alto contenuto di sale (20 mm HEPES, pH 7,9, 0,5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mm MgCl2, 0,5% nonidet P-40, 1 mM DTT, + inibitore della proteasi), compensazione mediante centrifugazione e successiva dialisi contro 1× BB (20 mm HEPES, pH 7,9, 0,1 M KCl, 1 mM EDTA, 0,05% glicerolo). La presenza di quantità equivalenti di proteine PIF4 e RGA negli estratti è stata valutata mediante rilevazione western blot con anticorpi anti-HA (Roche) e anti-GFP (Santa Cruz). Quantità crescenti di questi estratti (5,0, 10,0, 15,0 µl) sono state utilizzate per la reazione EMSA. Gli estratti sono stati incubati per 15 minuti a temperatura ambiente con la sonda etichettata e 100 ng poli (DI-dIC) in 20 µl 1× BB e separati da 6% di PAGINA in 0,5× TBE. Un eccesso di 100 volte di oligonucleotidi ricotti wild-type (WT) e mutanti (MUT) è stato utilizzato per una competizione specifica.
