Le firme delle metastasi polmonari PDX identificano i geni de-regolati nelle metastasi. una rappresentazione schematica di tumori MPF e metastasi polmonari isolati per RNAseq. b Analisi dei componenti principali (PCAs) da dati RNAseq generati da tumori MFP e metastasi polmonari utilizzati in questo studio. Ogni punto dati rappresenta un campione da un singolo mouse. c GSEA pathway analysis on the enriched lung metastasis signature (P2); la parte superiore 5 giù (blu)- e su (rosso)processi regolati sono mostrati. NES, punteggio di arricchimento normalizzato. Le caselle indicano FDR < 0.1 per la significatività statistica. I grafici di arricchimento per la transizione mesenchimale epiteliale (EMT) e la segnalazione TGF-β per P0 e P2 sono mostrati nel pannello di destra. p < 0.001 per segnalazione EMT e TGF-β a P0 e P2. d qRT-PCR analisi dell’espressione di vimentina nei tumori MFP BC3_A2 e sottopopolazioni metastatiche isolate dal polmone. T-test accoppiati, p = 0,02 per P0 lung, p < 0,001 per P2 lung. Ogni punto dati rappresenta un mouse. Le barre di errore rappresentano SEM di repliche biologiche. Vedi anche Fig. 2. la colorazione e IHC è stata eseguita sulle sezioni di tessuto indicate utilizzando un anticorpo che riconosce la forma umana specifica di vimentina. Le barre della scala indicano 100 µm. f Diagramma a cascata che mostra l’espressione dei geni EMT nelle metastasi polmonari P0 e P2 rispetto ai corrispondenti tumori MFP. i valori p sono riportati nella Tabella supplementare 1. Sono stati inclusi campioni di almeno tre topi indipendenti per le analisi RNAseq

È stato eseguito un tempo reale quantitativo (qRT-PCR) per monitorare l’espressione di vimentina, un marker mesenchimale, nei tumori MFP e nelle metastasi polmonari durante il passaggio seriale. L’espressione di Vimentina ha mostrato un pattern dinamico con maggiore espressione nei tumori MFP rispetto alle corrispondenti metastasi polmonari ad ogni passaggio (Fig. 1d) e alle metastasi epatiche a P0 (Fig. 2 bis). I livelli di proteine di Vimentina hanno ricapitolato questo modello dinamico (Fig. 1e). Geni EMT aggiuntivi sono stati anche downregulated in metastasi polmonari rispetto ai corrispondenti tumori MFP (Fig. 1f). L’espressione del marcatore mesenchimale CDH2 (il gene che codifica per N-caderina) ha seguito lo stesso schema della vimentina (Fig. 2b), mentre l’espressione del marcatore epiteliale CDH1 (il gene che codifica E-caderina) ha mostrato una tendenza inversa (Fig. 2 quater). I fibroblasti stromali umani co-attecchiti sono stati eliminati al momento della raccolta del tumore (Fig. 3a-f), escludendo la possibilità che abbiano contribuito all’espressione di marcatori mesenchimali nei tumori MFP. Presi insieme, questi risultati dimostrano che i tumori riducono l’espressione dei geni mesenchimali una volta stabiliti nei siti metastatici.

Determinazione della complessità della libreria per un elevato throughput gain of function screen

Uno schermo GOF (High throughput Gain-of-Function) è stato progettato per identificare i driver funzionali delle metastasi dalla nostra firma di metastasi polmonari P2. HOXA1, un driver noto di metastasi, 29 servito come un controllo positivo per l’ottimizzazione dello schermo, e GFP è stato utilizzato come un controllo negativo. Le cellule BC3_A2 sono state trasdotte con lentivirus che codifica per HOXA1 o GFP e le cellule tumorali infette sono state mescolate in diversi rapporti (Fig. 4 bis). Popolazioni miste di cellule tumorali sono state quindi attecchite nelle MFP dei topi riceventi e BLI è stato utilizzato per segnare metastasi polmonari al momento della necroscopia (Fig. 4 ter). In una seconda serie di esperimenti, il driver metastatico ID19 è stato utilizzato in combinazione con GFP, ma in questo caso popolazioni miste di cellule tumorali sono state iniettate nella vena della coda di topi riceventi per modellare gli stadi finali della metastasi (Fig. 4 quater). Un aumento significativo del flusso di fotoni è stato osservato da tumori con un rapporto HOXA1: GFP o ID1: GFP di 1:10. Questi test di complessità hanno dimostrato che un driver di metastasi in buona fede potrebbe essere rilevato nel nostro schermo se raggruppato con 9 non-driver open reading frames (ORFs), ma un pool di un driver con 19 non-driver mascherato la nostra capacità di rilevare il driver. Sulla base di questi risultati abbiamo limitato la nostra dimensione del pool a 12 ORFs.

High throughput gain-of-function screening in vivo identifica i driver funzionali candidati di metastasi TNBC

Per determinare quali dei geni sovraregolati dalla firma di metastasi polmonari P2 erano in grado di guidare metastasi polmonari, abbiamo progettato librerie lentivirali personalizzate con codice a barre che codificano gli ORF dei geni 230 che erano più altamente sovraregolati nelle metastasi polmonari. Gli ORF sono stati espressi individualmente in cellule BC3_A2 in modo che ogni linea cellulare esprimesse un singolo ORF, le cellule sono state quindi raggruppate in gruppi di 12 e i pool sono stati impiantati nelle MFP dei topi riceventi (n = 10 topi per pool, Fig. 2 bis). Un plasmide di controllo che esprime GFP è stato incluso in ogni pool per valutare le metastasi intrinseche in questo modello TNBC. Ogni ORF è stato associato con un codice a barre DNA unico. Un pellet di riferimento di cellule raggruppate è stato congelato a scatto per confermare la rappresentazione uguale di ciascun ORF al momento dell’impianto del tumore. Tredici settimane sono state scelte come endpoint dello studio perché HOXA1, ma non i tumori che esprimono GFP, metastatizzati al polmone entro questo punto temporale (Fig. 5 bis). Tredici settimane dopo l’attecchimento, i polmoni sono stati sottoposti a BLI ex vivo (Fig. 5a), le lesioni metastatiche sono state isolate e il DNA genomico (gDNA) è stato estratto e utilizzato come modello per qPCR per amplificare le regioni di codici a barre uniche associate a ciascuna ORF (Fig. 5 ter). Anche i tumori MFP sono stati isolati e sottoposti a queste analisi (Fig. 2 bis). La rappresentazione di ciascun ORF con codice a barre nell’MFP rispetto al campione di riferimento è stata determinata per ciascun pool (Fig. 2b; Fichi supplementari. 5 quater, d). La rappresentazione nel polmone è stata poi normalizzata all’arricchimento in MFP rispetto al riferimento (Fig. 2 ter, lettera c). Driver di metastasi segregati in tre gruppi, compresi quelli arricchiti in entrambi i polmoni e MFP (Fig. 2b, quadrante superiore destro e supplementare Fig. 5c), quelli arricchiti esclusivamente in MFP (Fig. 2b, quadrante inferiore destro) e quelli arricchiti esclusivamente in polmoni (Fig. 2b, quadrante superiore sinistro e Fig. 2 quater). Le cellule che esprimono GFP sono state arricchite nelle metastasi polmonari in alcuni pool e il punteggio medio di arricchimento per GFP nel polmone è stato di circa 5 (Fig.supplementare. 5 e). Pertanto, abbiamo usato questo come un cutoff punteggio di arricchimento per definire un vero successo nel nostro schermo e identificato 44 geni che sono stati selettivamente arricchiti in metastasi polmonari rispetto ai tumori primari. Questi successi sono stati classificati per punteggio di arricchimento (Fig. 2c e Tabella supplementare 2). Tra i primi cinque successi, CEACAM5 è stato l’unico la cui espressione nei tumori primari è stata trovata per predire una scarsa sopravvivenza nei pazienti con cancro al seno (Fig. 6 bis). Pertanto, abbiamo ulteriormente studiato il ruolo funzionale di CEACAM5 nelle metastasi del cancro al seno.

High throughput gain-of-function screening in vivo identifica i driver funzionali delle metastasi. uno schema raffigurante formato utilizzato per gain-of-function (GOF) schermo. Vedi anche Fig. 5. ORF, aprire la cornice di lettura. Dieci topi sono stati impiantati in ogni coorte. b Grafico a dispersione che mostra la rappresentazione relativa di ciascun ORF nei tumori MFP dopo la normalizzazione al riferimento (asse x) e nei polmoni rispetto ai tumori MFP (asse y). Il metodo ΔΔCT è stato utilizzato per la quantificazione dei dati qPCR. CEACAM5 è mostrato in rosso. i geni c arricchiti nelle metastasi polmonari ma non nei tumori MFP sono stati classificati in ordine decrescente di arricchimento nel polmone. Linea tratteggiata indica arricchimento punteggio cutoff. Vedi anche Fig. 5 e Tabella supplementare 2

Conferma dell’espressione avanzata di CEACAM5 in modelli PDX metastatici aggiuntivi

Abbiamo scoperto che l’espressione di CEACAM5 era regolata dinamicamente mentre le sottopopolazioni metastatiche venivano passate in serie tra polmoni e MFP in vivo (Fig. 3a), confermando i risultati di RNAseq (Tabella supplementare 1 e Fig. 6 ter). Allo stesso modo, l’espressione di CEACAM5 era più alta nel fegato (Fig. 7a) e cervello (Fig. 7b) metastasi relative ai corrispondenti tumori MFP. I livelli di proteina CEACAM5 erano anche più alti nelle metastasi polmonari rispetto ai tumori MFP (Fig. 3 ter). L’aumento dell’espressione di CEACAM5 nelle lesioni metastatiche non era dipendente dal silenziamento di p53 in questa linea PDX, poiché anche le metastasi polmonari della linea PDX isogenica che esprimevano il tipo selvaggio p5326, 30 mostravano livelli di espressione più elevati di CEACAM5 (Fig. 7 quater).

CEACAM5 è sovraregolato nelle metastasi e la sua espressione è inversamente correlata con quella di vimentina nei modelli PDX di TNBC. un’espressione di CEACAM5 in tumori MFP e lesioni metastatiche di topi innestati con tumori BC3_A2 è stata determinata da qRT-PCR. Accoppiato t-test, p < 0.001 per P0 polmone, P2 MFP tumore, e P2 polmone. Ogni punto rappresenta un singolo mouse. Le barre di errore rappresentano SEM di repliche biologiche. Vedi anche Fig. 7. i tumori b MFP e le metastasi corrispondenti da topi innestati con tumori BC3_A2 sono stati analizzati da IHC utilizzando un anticorpo CEACAM5. Le barre della scala indicano 100 µm. l’espressione di c di CEACAM5 nei tumori di MFP e nelle lesioni metastatiche dei topi innestati con i tumori di PIM001-P è stata determinata da qRT-PCR. I dati sono presentati su una scala di log. T-test accoppiato, p < 0.001. Ogni punto rappresenta un singolo mouse. Le barre di errore rappresentano SEM di repliche biologiche. i tumori d MFP e le corrispondenti metastasi polmonari da topi innestati con tumori PIM001-P sono stati analizzati da IHC utilizzando un anticorpo CEACAM5. Le barre della scala indicano 100 µm. e, f IHC di sezioni di tessuto tumorale seriale da topi innestati con BC3_A2 (e) o PIM001-P (f) macchiato con anticorpi specifici per CEACAM5 (pannello superiore) o vimentin. Le barre della scala indicano 100 µm. g L’espressione di CEACAM5 (pannello superiore) o vimentin (pannello inferiore) è stata determinata in un pannello di linee cellulari di cancro al seno. Le barre di errore rappresentano SEM di triplicati tecnici. h IHC è stato eseguito per monitorare p38 fosforilato in tumori MFP e metastasi polmonari di topi BC3_A2. Le barre di scala indicano 100 µm

È stata valutata una seconda serie di modelli PDX di TNBC (PIM001) per determinare se l’aumento di CEACAM5 nelle lesioni metastatiche fosse una proprietà generale della metastasi. PIM001-P è stato stabilito dal tumore primario naïve al trattamento di un paziente con TNBC metastatico, mentre PIM001-M è stato stabilito dalla metastasi dermica dello stesso paziente. Le cellule tumorali PIM001-P sono state progettate per esprimere sia CBR-Luc che mCherry e quindi innestate nelle MFP dei topi riceventi. Al momento della necroscopia, sono stati isolati tumori MFP e metastasi polmonari. L’espressione di CEACAM5 è stata aumentata ad entrambi i livelli di mRNA (Fig. 3c) e livelli proteici (Fig. 3d) nelle metastasi polmonari PIM001-P rispetto ai corrispondenti tumori MFP. È interessante notare che i livelli di proteina CEACAM5 erano più alti nei tumori PDX MFP stabiliti dalla metastasi dermica del paziente (PIM001-M) rispetto ai tumori PDX MFP stabiliti dal suo tumore al seno primario (PIM001-P) (Fig supplementare. 7d). Collettivamente, questi risultati dimostrano che l’elevazione di CEACAM5 è una proprietà comune delle metastasi nei modelli PDX di TNBC.

L’espressione di CEACAM5 è inversamente correlata con l’espressione di vimentina e la fosforilazione di p38

Perché l’espressione di CEACAM5 nei modelli PDX era inversamente correlata con l’espressione di vimentina (Figs. 1d, 3a; Fichi supplementari. 2a e 7a, b), immunoistochimica (IHC) è stato impiegato per monitorare metastasi polmonari e tumori MFP per i livelli relativi di vimentina e CEACAM5. Livelli proteici correlati con i livelli di mRNA in entrambi i modelli PDX (Fig. 3 sexies, f). L’espressione di Vimentin è stata anche inversamente correlata con l’espressione di CEACAM5 in un pannello di linee cellulari di cancro al seno (Fig. 3g). La serina / treonina-specifica protein chinasi p38alpha (noto anche come MAPK14, di seguito denominato p38) è fosforilata durante EMT.31 È interessante notare che la fosforilazione (attiva) p38 è correlata con alti livelli di espressione di vimentina nei tumori MFP e la fosforilazione p38 è diminuita nelle metastasi polmonari in cui i livelli di vimentina erano bassi (Fig. 3h). Collettivamente, questi dati dimostrano che l’espressione di CEACAM5 è inversamente correlata con l’espressione dei marcatori EMT nelle metastasi polmonari.

La sovrapproduzione ectopica di CEACAM5 inibisce la segnalazione TGF-β e l’espressione dei marcatori EMT

Dato che l’espressione di CEACAM5 è inversamente correlata allo stato mesenchimale, abbiamo valutato se CEACAM5 avesse un ruolo diretto nella regolazione dell’espressione dei marcatori mesenchimali. Cellule BC3_A2 progettate per sovrapprodurre CEACAM5 umano o GFP come controllo negativo (Fig. 8a, b) sono stati esaminati per l’espressione di vimentina e CDH2 / N-caderina (marcatori mesenchimali) e CDH1/E-caderina (marcatore epiteliale). La sovraespressione di CEACAM5 ha portato ad una maggiore espressione di CDH1 (Fig. 8c) e diminuzione dell’espressione di CDH2 (Fig. 8d) e vimentin (Fig. 8 e). Inoltre, la sovrapproduzione di CEACAM5 ha ridotto e ritardato la fosforilazione mediata da TGF-β degli SMAD nelle cellule BC3_A2 (Fig. 4a, c, Fig. supplementare 9a) e fosforilazione p38 in entrambe le cellule BC3_A2 (Fig. 4a, b, Fig. supplementare 9a) e celle MDA-MB-231 (Fig. 8f, Fig. supplementare 9 ter). Infine, la sovrapproduzione di CEACAM5 ha ritardato l’EMT indotto da TGF-β come valutato dall’espressione di E-caderina e vimentina (Fig. 4d, Fig.supplementare. 9 quater). Questi risultati suggeriscono che CEACAM5 regola negativamente l’EMT e identifica una funzione per CEACAM5 nelle metastasi del cancro al seno.

CEACAM5 sovrapproduzione downregulates espressione di marcatori mesenchimali e compromette TGF-β segnalazione e compromette TGF-β segnalazione. le cellule BC3_A2 progettate per sovrapprodurre CEACAM5 o GFP sono state coltivate in presenza o assenza di 1 ng/ml TGF-β per i periodi di tempo indicati. I lisati cellulari sono stati sottoposti a Western blotting per le proteine indicate. b, c istogramma mostra il cambiamento piega (scala log) nello stato di fosforilazione di p38 (b) o Smad2/3 (c) rispetto a quello al punto di tempo 0 per le cellule che esprimono GFP. Le barre di errore rappresentano SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. le cellule d BC3_A2 che esprimono GFP o CEACAM5 sono state coltivate in presenza o assenza di 1 ng/ml TGF-β per i periodi di tempo indicati. I lisati cellulari sono stati sottoposti a Western blotting per le proteine indicate. Tutti i risultati sono rappresentativi di almeno tre esperimenti indipendenti. Vedi anche Fichi supplementari. 8 e 9

La sovrapproduzione di CEACAM5 promuove l’escrescenza metastatica e riduce l’EMT in vivo

L’EMT è associato a una ridotta proliferazione cellulare.19 Pertanto, la capacità di CEACAM5 di inibire l’EMT ha suggerito che potrebbe funzionare per promuovere la crescita tumorale nei siti metastatici. Per testare questa ipotesi, le cellule BC3_A2 progettate per sovrapprodurre CEACAM5 o GFP (controllo) sono state iniettate nelle vene della coda di topi riceventi per monitorare gli effetti della sovrapproduzione di CEACAM5 sulla crescita del tumore nel polmone. La sovraespressione di CEACAM5 ha portato ad un aumento della crescita tumorale nei polmoni (Fig. 5a e supplementari Fig. 10a), diminuzione dell’espressione di vimentina a livello proteico (Fig. 10b), e diminuzione della fosforilazione di p38 (Fig. 5d, e). Riduzione dei livelli di CEACAM5 in BC3_A2 con due diversi SHRNA (Fig. 5b) ha avuto l’effetto opposto in quanto le cellule trasdotte crescevano più lentamente nei polmoni rispetto alle cellule di controllo dopo l’iniezione della vena della coda (Fig. 5c e supplementari Fig. 10 quater). Inoltre, l’abbattimento di CEACAM5 ha determinato un aumento del numero di lesioni ma una diminuzione delle dimensioni della lesione (Fig. 10d, e). Questi risultati suggeriscono che il silenziamento di CEACAM5 promuove l’EMT e lo stravaso delle cellule tumorali inibendo allo stesso tempo l’escrescenza metastatica.

L’espressione di CEACAM5 favorisce la crescita delle metastasi polmonari. a cellule BC3_A2 sovrapproduzione CEACAM5 o GFP sono stati iniettati nelle vene coda di topi. BLI è stato utilizzato per quantificare il flusso di fotoni nei polmoni dei topi nei punti temporali indicati. T-test accoppiato, p = 0,03. Le barre di errore rappresentano SEM di repliche biologiche (n = 5 topi per gruppo). b Le cellule BC3_A2 che esprimono shRNA di controllo (shLuc) o due diversi SHRNA (#3 e #5) specifici per CEACAM5 sono state sottoposte a QRT-PCR per monitorare l’espressione di CEACAM5. Le barre di errore rappresentano SEM di triplicati tecnici. Vedi anche Fig. 10. le cellule c BC3_A2 che esprimono shLuc o due diversi SHRNA CEACAM5 sono state iniettate nelle vene della coda dei topi. BLI è stato utilizzato per quantificare il flusso di fotoni nei polmoni dei topi nei punti temporali indicati. T-test accoppiati, p = 0,01 per sh # 3 e p < 0,001 per sh#5. I dati sono stati normalizzati al punto temporale iniziale e sono presentati su una scala di log. Le barre di errore rappresentano SEM di repliche biologiche (n = 5 topi per gruppo). le cellule d BC3_A2 che sovraproducevano CEACAM5 sono state iniettate nelle vene della coda dei topi e i polmoni sono stati isolati e sottoposti a IHC con gli anticorpi indicati. Le barre della scala indicano 100 µm. le cellule e che presentano una colorazione positiva per CEACAM5, vimentina o p-p38 nelle sezioni di tessuto rappresentate nel pannello d sono state quantificate utilizzando il sistema di imaging automatizzato Vectra 3.0. T-test accoppiati, p = 0,0008 per CEACAM5, p = 0,03 per vimentin e p = 0,03 per p-p38. Le barre di errore rappresentano il SEM di almeno tre repliche biologiche indipendenti. l’RNA f isolato dalle cellule BC3_A2 che sovraproducono CEACAM5 o GFP e coltivato in vitro o isolato dal polmone dopo l’iniezione della vena della coda (in vivo, a, d) è stato sottoposto all’analisi della via GSEA (a sinistra due colonne). Vengono mostrati i primi 5 processi down-regulated (blu) e top 5 up-regulated (rosso). Le caselle indicano FDR < 0.1 per la significatività statistica. NES (punteggio di arricchimento normalizzato). Significato di questi percorsi nei tumori P0 e P2 MFP vs. le metastasi polmonari corrispondenti sono mostrate per il confronto (due colonne a destra). I dati sono rappresentati da triplicati biologici. Vedi anche Fig. 11

Per monitorare come la sovrapproduzione di CEACAM5 ha influenzato l’espressione genica, le cellule BC3_A2 ingegnerizzate per sovrapproduzione di CEACAM5 o GFP sono state coltivate in vitro o isolate dal polmone dopo l’iniezione della vena di coda (in vivo). L’RNA è stato isolato e sottoposto a RNAseq. È stata eseguita un’analisi differenziale dell’espressione genica e GSEA ha identificato l’EMT come l’unica via del segno distintivo del cancro che è stata significativamente ridotta sia in vitro che in vivo dalla sovrapproduzione CEACAM5 (Fig. 5f, Fig. supplementare 11). Questo risultato è simile a quello osservato nelle metastasi polmonari P0 e P2 (Fig. 1 quater, 5 septies). Collettivamente, questi dati hanno indicato che la sovraregolazione dell’espressione di CEACAM5 nelle lesioni metastatiche induce il MET e migliora l’escrescenza delle cellule tumorali metastatiche nei siti secondari.

L’espressione di CEACAM5 è sovraregolata nelle lesioni metastatiche di pazienti affetti da tumore al seno

Successivamente, l’espressione di CEACAM5 è stata valutata nelle lesioni metastatiche e nel tessuto tumorale mammario ottenuto da pazienti affetti da tumore al seno. La colorazione IHC su un insieme di tessuto abbinato costituito da un tumore primario e una metastasi polmonare di un paziente con cancro al seno (Tabella supplementare 3) ha rivelato livelli più elevati di CEACAM5 nella metastasi polmonare rispetto al tumore al seno primario (Fig. 6a e supplementari Fig. 12 bis). Per espandere queste analisi, un microarray tissutale (TMA) costituito da metastasi polmonari da 25 pazienti affetti da cancro al seno (Figs supplementari. 12b, c e Tabella supplementare 3) è stato macchiato per CEACAM5 (Fig.supplementare. 12b), e l’intensità di colorazione è stato assegnato un punteggio (Fig. 6 ter). Questo metodo di punteggio è stato applicato anche a un TMA dall’Atlante delle proteine umane costituito da tumori al seno umani colorati per CEACAM5. 32 La maggior parte delle metastasi polmonari ha espresso alti livelli di CEACAM5 (Fig. 6c) rispetto ai tumori al seno (Fig. 6d), dimostrando che CEACAM5 era più alto nelle lesioni metastatiche rispetto ai tumori mammari primari.

I livelli di proteina CEACAM5 sono elevati nelle lesioni metastatiche di pazienti affetti da tumore al seno e sono inversamente correlati con l’espressione di vimentina. a Il tumore primario e la corrispondente metastasi polmonare di un paziente con cancro al seno sono stati sottoposti a IHC per monitorare i livelli di CEACAM5. Le barre della scala indicano 100 µm. b Un tessuto tumorale microarray (TMA) costituito da metastasi polmonari da 25 pazienti con cancro al seno è stato sottoposto a IHC con un anticorpo CEACAM5-specifico e l’intensità della colorazione è stata valutata. Vengono mostrate immagini rappresentative. Le barre della scala indicano 100 µm. c Il sistema di punteggio in b è stato applicato alla TMA costituita da metastasi polmonari di 25 pazienti affetti da cancro al seno per valutare i livelli relativi di CEACAM5. d Il sistema di punteggio in b è stato applicato a un TMA dell’Atlante proteico umano costituito da tumori mammari primari 25 per valutare i livelli relativi di CEACAM5. e Il tumore primario e la corrispondente metastasi polmonare di un paziente con cancro al seno (da a) sono stati co-colorati per CEACAM5 e vimentina e analizzati mediante microscopia a immunofluorescenza. Le barre della scala indicano 100 µm. le cellule f con colorazione positiva per CEACAM5, vimentina o entrambe nelle sezioni di tessuto rappresentate in e sono state quantificate utilizzando il sistema di imaging automatizzato Vectra 3.0. g La TMA costituita da metastasi polmonari di 25 pazienti affetti da cancro al seno è stata co-colorata per CEACAM5 e vimentina e analizzata mediante microscopia a immunofluorescenza. Vengono mostrate immagini rappresentative. Le barre della scala indicano 100 µm. le cellule h con colorazione positiva per CEACAM5, vimentina o entrambe nelle sezioni di tessuto mostrate in g sono state quantificate utilizzando il sistema di imaging automatizzato Vectra 3.0. Vedi anche Fig. 12

Abbiamo quindi valutato il set di tessuti abbinato per la co-espressione di CEACAM5 e vimentin. La co-colorazione per CEACAM5 e vimentin ha rivelato livelli più elevati di CEACAM5 nella metastasi polmonare rispetto al tumore al seno abbinato e il pattern di colorazione inverso è stato osservato per vimentin (Fig. 6 sexies, f). Inoltre, una popolazione minore di cellule tumorali ha mostrato co-colorazione sia per CEACAM5 che per vimentin (Fig. 6 septies). Quelle cellule colorazione positiva per entrambe le proteine possono rappresentare le cellule in uno stato ibrido EMT / MET.33 La TMA costituita da metastasi polmonari di 25 pazienti affetti da cancro al seno ha anche dimostrato una correlazione inversa tra la colorazione CEACAM5 e vimentina (Fig. 6g, h; Fichi supplementari. 12 bis-e). Questi risultati hanno confermato le conclusioni fatte con i nostri modelli PDX di TNBC e hanno dimostrato che l’espressione di CEACAM5 è inversamente correlata con l’espressione di vimentina nei tumori mammari primari e nelle lesioni metastatiche. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che CEACAM5 promuove il MET per facilitare la crescita tumorale nei siti metastatici (Figura supplementare 12a, b).