El paso en serie de metástasis pulmonares in vivo enriquece para potencial metastásico
La línea PDX WU-BC3 se generó mediante el injerto de células tumorales de mama de una paciente con TNBC metastásico en las almohadillas de grasa mamaria humanizada (MFP) de NOD/Ratones SCID ratones.26,27 Diseñamos estas células tumorales para expresar de forma estable la Luciferasa Roja de Escarabajo Clic (CBR-Luc), mCherry y un ARN específico para p53 (shA2) para crear la línea PDX BC3_A2 (anteriormente conocida como BC3-p53KD28) (Suplemento Fig. 1a). Se demostró que las células tumorales hicieron metástasis de los MFP a sitios fisiológicamente relevantes, como pulmón, hígado, hueso, cerebro y ganglios linfáticos.Se aislaron 28 metástasis pulmonares (P0) de ratones replicados, se agruparon y se injertaron en los MFP de los ratones receptores. Las metástasis pulmonares (P1) resultantes se aislaron, agruparon e injertaron en los MFP de ratones adicionales. También se recogieron y agruparon las metástasis pulmonares de estos ratones (P2) (Suplemento Fig. 1b). Se realizaron imágenes de bioluminiscencia (ICB) de pulmones, huesos e hígados en la necropsia para cuantificar la magnitud relativa de la metástasis en cada pasaje (Suplemento Fig. 1c). Pases seriados enriquecidos para células tumorales con mayor capacidad de metástasis a todos los sitios (Suplemento Fig. 1d-f, h)y requiere que los ratones sean sacrificados antes (Fig. 1i). Por el contrario, los tumores pasantes seriados entre MFP no dieron lugar a un aumento de la metástasis pulmonar (Suplemento Fig. 1g), lo que indica que la adquisición de una mayor capacidad metastásica no fue simplemente una consecuencia de tumores que pasaban en serie in vivo. Además, las células tumorales con mayor capacidad metastásica no mostraron un aumento significativo de las propiedades de crecimiento cuando se aislaron de MFP y se volvieron a colocar en los MFP de ratones receptores (Suplemento Fig. 1j). En conjunto, estos resultados demuestran que el paso en serie de células tumorales de los pulmones a dispositivos multifuncionales en este modelo enriquece el potencial metastásico, pero no la localización específica de órganos.
La expresión génica mesenquimatosa se reduce en las metástasis pulmonares en relación con los tumores de MFP
Para identificar cambios en los patrones de expresión génica que acompañan a la metástasis, se realizó la secuenciación de ARN (RNAseq) en metástasis pulmonares (P0 y P2) y tumores de MFP (P0 y P2) (Fig. 1a y Cuadro complementario 1). Después de restar la asignación de lecturas de RNAseq al transcriptoma de ratón, solo se utilizaron lecturas de transcripción humana para los análisis posteriores. El análisis de componentes principales (PCA) reveló una disminución de la discordancia entre las réplicas biológicas con el paso repetido in vivo, ya que las réplicas biológicas de muestras de tumores P2 se agruparon más estrechamente entre sí que con otras subpoblaciones analizadas (Fig. 1b). El Análisis de Enriquecimiento de Conjuntos Genéticos (GSEA) reveló que la EMT fue la vía de regulación descendente más significativa en las metástasis pulmonares P0 y P2 en comparación con los tumores de MFP (Fig. 1c). La señalización del TGF-β, que regula la EMT, también se redujo significativamente en las metástasis pulmonares P0 y P2 (Fig. 1c).
Las firmas PDX de metástasis pulmonares identifican genes desregulados en metástasis. representación esquemática de tumores MPF y metástasis pulmonares aislados para RNAseq. b Análisis de componentes principales (PCA) a partir de datos de RNAseq generados a partir de tumores de MFP y metástasis pulmonares utilizados en este estudio. Cada punto de datos representa una muestra de un ratón individual. análisis de la vía GSEA en la firma de metástasis pulmonar enriquecida (P2); se muestran los 5 procesos regulados superiores hacia abajo (azul) y hacia arriba (rojo). NES, puntuación de enriquecimiento normalizada. Las casillas indican FDR < 0.1 para la significación estadística. Las gráficas de enriquecimiento para la transición mesenquimatosa epitelial (EMT) y la señalización TGF-β para P0 y P2 se muestran en el panel derecho. p < 0,001 para señalización EMT y TGF-β en P0 y P2. d Análisis qRT-PCR de la expresión de vimentina en tumores de MFP BC3_A2 y subpoblaciones metastásicas aisladas de pulmón. Pruebas t pareadas, p = 0,02 para pulmón P0, p < 0,001 para pulmón P2. Cada punto de datos representa un ratón. Las barras de error representan SEM de réplicas biológicas. Véase también la Fig. 2. la tinción IHQ se realizó en las secciones de tejido indicadas utilizando un anticuerpo que reconocía la forma humana específica de vimentina. Las barras de escala indican 100 µm. gráfico de cascada de f que muestra la expresión de genes EMT en metástasis pulmonares P0 y P2 en comparación con los tumores MFP correspondientes. los valores de p se proporcionan en la Tabla complementaria 1. Se incluyeron muestras de al menos tres ratones independientes para análisis de RNAseq
Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para monitorear la expresión de vimentina, un marcador mesenquimatoso, en tumores de MFP y metástasis pulmonares a lo largo del paso en serie. La expresión de vimentina mostró un patrón dinámico con una expresión más alta en los tumores de MFP en relación con las metástasis pulmonares correspondientes en cada pasaje (Fig. 1d) y metástasis hepáticas en P0 (Suplemento Fig. 2a). Los niveles de proteína vimentina recapitularon este patrón dinámico (Fig. 1e). Los genes EMT adicionales también se regularon a la baja en las metástasis pulmonares en relación con los tumores de MFP correspondientes (Fig. 1f). La expresión del marcador mesenquimatoso CDH2 (el gen que codifica la N-cadherina) siguió el mismo patrón que la vimentina (Suplemento Fig. 2b), mientras que la expresión del marcador epitelial CDH1 (el gen que codifica para la E-cadherina) mostró una tendencia inversa (Suplemento Fig. 2c). Los fibroblastos estromales humanos co-injertados se eliminaron en el momento de la cosecha del tumor (Suplemento Fig. 3a-f), descartando la posibilidad de que contribuyeran a la expresión de marcadores mesenquimatosos en tumores de MFP. En conjunto, estos resultados demuestran que los tumores regulan a la baja la expresión de los genes mesenquimales una vez establecidos en sitios metastásicos.
Determinación de la complejidad de la biblioteca para una pantalla de ganancia de función de alto rendimiento
Se diseñó una pantalla de ganancia de función de alto rendimiento (GOF) para identificar los impulsores funcionales de la metástasis a partir de nuestra firma de metástasis pulmonares P2. HOXA1,un conocido impulsor de metástasis, 29 sirvió como control positivo para la optimización de la pantalla, y el GFP se utilizó como control negativo. Las células BC3_A2 se transdujeron con lentivirus que codificaban HOXA1 o GFP, y las células tumorales infectadas se mezclaron en diferentes proporciones (Fig. 4a). A continuación, se injertaron poblaciones mixtas de células tumorales en los MFP de los ratones receptores y se utilizó BLI para puntuar las metástasis pulmonares en el momento de la necropsia (Suplemento Fig. 4b). En un segundo grupo de experimentos, se utilizó el conductor metastásico ID19 en combinación con GFP, pero en este caso se inyectaron poblaciones mixtas de células tumorales en la vena de la cola de ratones receptores para modelar los estadios finales de la metástasis (Suplemento Fig. 4c). Se observó un aumento significativo del flujo de fotones en tumores con una relación HOXA1: GFP o ID1: GFP de 1:10. Estas pruebas de complejidad demostraron que se podía detectar un conductor de metástasis de buena fe en nuestra pantalla si se combinaba con 9 fotogramas de lectura abiertos (ORF) para no conductores, pero un grupo de un conductor con 19 no conductores enmascaraba nuestra capacidad de detectar al conductor. En base a estos resultados, limitamos el tamaño de nuestro grupo a 12 ORF.
El cribado de ganancia de función de alto rendimiento in vivo identifica posibles impulsores funcionales de metástasis TNBC
Para determinar cuáles de los genes regulados al alza de la firma de metástasis pulmonar P2 eran capaces de impulsar la metástasis pulmonar, diseñamos bibliotecas lentivirales con códigos de barras personalizados que codifican los ORF de los 230 genes con mayor regulación al alza en metástasis pulmonares. Los ORF se expresaron individualmente en células BC3_A2 de modo que cada línea celular expresara un único ORF, las células se agruparon en grupos de 12 y los grupos se implantaron en los MFP de los ratones receptores (n = 10 ratones por grupo, Fig. 2a). En cada grupo se incluyó un plásmido de control que expresaba GFP para medir la metástasis intrínseca en este modelo de TNBC. Cada ORF estaba asociado con un código de barras de ADN único. Se congeló un pellet de referencia de células agrupadas para confirmar la representación igual de cada ORF en el momento de la implantación del tumor. Se eligieron trece semanas como criterio de valoración del estudio porque los tumores que expresan HOXA1, pero no los que expresan GFP, hicieron metástasis en el pulmón en este momento (Suplemento Fig. 5a). Trece semanas después del injerto, los pulmones se sometieron a BLI ex vivo (Suplemento Fig. 5a), se aislaron lesiones metastásicas y se extrajo ADN genómico (ADNGD) y se utilizó como plantilla para qPCR para amplificar regiones de códigos de barras únicas asociadas con cada ORF (Suplemento Fig. 5b). Los tumores de MFP también se aislaron y se sometieron a estos análisis (Fig. 2a). Se determinó la representación de cada ORF con código de barras en el MFP en relación con la muestra de referencia para cada grupo (Fig. 2b; Figuras Suplementarias. 5c, d). La representación en el pulmón se normalizó a enriquecimiento en MFP vs. la referencia (Fig. 2b, c). Los impulsores de metástasis se segregaron en tres grupos, incluidos los enriquecidos en pulmones y MFP (Fig. 2b, cuadrante superior derecho y Suplemento Fig. 5c), los enriquecidos exclusivamente en MFP (Fig. 2b, cuadrante inferior derecho) y los enriquecidos exclusivamente en pulmones (Fig. 2b, cuadrante superior izquierdo y Fig. 2c). Las células que expresaban GFP se enriquecieron en metástasis pulmonares en algunos de los grupos y la puntuación media de enriquecimiento para GFP en el pulmón fue de aproximadamente 5 (Suplemento Fig. 5e). Por lo tanto, utilizamos esto como punto de corte de la puntuación de enriquecimiento para definir una verdadera coincidencia en nuestra pantalla e identificamos 44 genes que se enriquecieron selectivamente en metástasis pulmonares en relación con tumores primarios. Estos resultados se clasificaron por puntuación de enriquecimiento (Fig. 2c y Cuadro complementario 2). Entre los cinco primeros resultados, CEACAM5 fue el único cuya expresión en tumores primarios predijo una supervivencia precaria en pacientes con cáncer de mama (Suplemento Fig. 6a). Por lo tanto, investigamos más a fondo el papel funcional de CEACAM5 en la metástasis del cáncer de mama.
El cribado de ganancia de función de alto rendimiento in vivo identifica los impulsores funcionales de la metástasis. formato de representación esquemática utilizado para la pantalla de ganancia de función (GOF). Véase también la Fig. 5. ORF, marco de lectura abierto. Se implantaron diez ratones en cada cohorte. b Gráfico de dispersión que muestra la representación relativa de cada ORF en los tumores de MFP después de la normalización a la referencia (eje x) y en los pulmones en relación con los tumores de MFP (eje y). Para la cuantificación de los datos de qPCR se utilizó el método ΔΔCT. CEACAM5 se muestra en rojo. los genes c enriquecidos en metástasis pulmonares, pero no los tumores de MFP, se clasificaron en orden descendente de enriquecimiento pulmonar. La línea de puntos indica el punto de corte de la puntuación de enriquecimiento. Véase también la Fig. 5 y Tabla Suplementaria 2
Confirmación de la expresión mejorada de CEACAM5 en modelos PDX metastásicos adicionales
Se encontró que la expresión de CEACAM5 se regulaba dinámicamente a medida que las subpoblaciones metastásicas se pasaban en serie entre pulmones y MFP in vivo (Fig. 3a), confirmando los hallazgos de RNAseq (Tabla Suplementaria 1 y Fig. Suplementaria. 6b). De manera similar, la expresión de CEACAM5 fue mayor en el hígado (Suplemento Fig. 7a) y cerebro (Suplemento Fig. 7b) metástasis relativas a los tumores MFP correspondientes. Los niveles de proteína CEACAM5 también fueron más altos en las metástasis pulmonares en comparación con los tumores de MFP (Fig. 3b). El aumento de la expresión de CEACAM5 en lesiones metastásicas no dependió del silenciamiento de p53 en esta línea PDX, ya que las metástasis pulmonares de la línea PDX isogénica que expresaba el tipo salvaje p532630,también mostraron niveles más altos de expresión de CEACAM5 (Suplemento Fig. 7c).
CEACAM5 es el alza en las metástasis, y su expresión se correlaciona inversamente con la de vimentina en PDX modelos de PURPLE. la expresión de CEACAM5 en tumores de MFP y lesiones metastásicas de ratones injertados con tumores BC3_A2 se determinó mediante PCR qRT. Pruebas t pareadas, p < 0,001 para el pulmón P0, el tumor MFP P2 y el pulmón P2. Cada punto representa un ratón individual. Las barras de error representan SEM de réplicas biológicas. Véase también la Fig. 7. b Los tumores de MFP y las metástasis correspondientes de ratones injertados con tumores BC3_A2 se analizaron mediante IHQ utilizando un anticuerpo CEACAM5. Las barras de escala indican 100 µm. c La expresión de CEACAM5 en tumores de MFP y lesiones metastásicas de ratones injertados con tumores PIM001-P se determinó mediante PCR qRT. Los datos se presentan en una escala logarítmica. Prueba t emparejada, p < 0,001. Cada punto representa un ratón individual. Las barras de error representan SEM de réplicas biológicas. d Los tumores de MFP y las metástasis pulmonares correspondientes de ratones injertados con tumores PIM001-P se analizaron mediante IHQ utilizando un anticuerpo CEACAM5. Las barras de escala indican 100 µm. e, f IHC de secciones de tejido tumoral en serie de ratones injertados con BC3_A2 (e) o PIM001-P (f) teñidos con anticuerpos específicos para CEACAM5 (panel superior) o vimentina. Las barras de escala indican 100 µm. g La expresión de CEACAM5 (panel superior) o vimentina (panel inferior) se determinó en un panel de líneas celulares de cáncer de mama. Las barras de error representan SEM de triplicados técnicos. se realizó h IHQ para monitorear p38 fosforilado en tumores de MFP y metástasis pulmonares de ratones BC3_A2. Las barras de escala indican 100 µm
Se evaluó un segundo conjunto de modelos PDX de TNBC (PIM001) para determinar si el aumento de CEACAM5 en lesiones metastásicas era una propiedad general de la metástasis. PIM001-P se estableció a partir del tumor primario sin tratamiento previo de un paciente con TNBC metastásico, mientras que PIM001-M se estableció a partir de la metástasis dérmica del mismo paciente. Las células tumorales PIM001-P se diseñaron para expresar tanto CBR-Luc como mCherry y luego se injertaron en los MFP de los ratones receptores. En el momento de la necropsia, se aislaron tumores de MFP y metástasis pulmonares. La expresión de CEACAM5 se incrementó en ambos niveles de ARNm (Fig. 3c) y los niveles de proteínas (Fig. 3d) en metástasis pulmonares PIM001-P en comparación con los tumores de MFP correspondientes. Curiosamente, los niveles de proteína CEACAM5 fueron más altos en los tumores de MFP PDX establecidos a partir de la metástasis dérmica de la paciente (PIM001-M) en comparación con los tumores de MFP PDX establecidos a partir de su tumor primario de mama (PIM001-P) (Suplemento Fig. 7d). En conjunto, estos resultados demuestran que la elevación de CEACAM5 es una propiedad común de las metástasis en modelos PDX de TNBC.
La expresión de CEACAM5 se correlaciona inversamente con la expresión de vimentina y la fosforilación de p38
Porque la expresión de CEACAM5 en modelos PDX se correlaciona inversamente con la expresión de vimentina (Figs. 1d, 3a; Figs. 2a y 7a, b), se empleó inmunohistoquímica (IHC) para vigilar las metástasis pulmonares y los tumores de MFP en busca de concentraciones relativas de vimentina y CEACAM5. Los niveles de proteínas se correlacionaron con los niveles de ARNm en ambos modelos PDX (Fig. 3e, f). La expresión de vimentina también se correlacionó inversamente con la expresión de CEACAM5 en un panel de líneas celulares de cáncer de mama (Fig. 3g). La proteína quinasa específica de serina / treonina p38alpha (también conocida como MAPK14, en lo sucesivo denominada p38) se fosforila durante la EMT.31 Curiosamente, p38 fosforilado (activo) se correlacionó con altos niveles de expresión de vimentina en tumores de MFP, y la fosforilación de p38 disminuyó en metástasis pulmonares donde los niveles de vimentina fueron bajos (Fig. 3h). En conjunto, estos datos demuestran que la expresión de CEACAM5 se correlaciona inversamente con la expresión de marcadores de EMT en metástasis pulmonares.
La sobreproducción ectópica de CEACAM5 inhibe la señalización de TGF-β y la expresión de marcadores EMT
Dado que la expresión de CEACAM5 se correlaciona inversamente con el estado mesenquimatoso, evaluamos si CEACAM5 tuvo un papel directo en la regulación de la expresión de los marcadores mesenquimatosos. Células BC3_A2 diseñadas para sobreproducer CEACAM5 o GFP humanos como control negativo (Suplemento Fig. 8a, b) se examinaron para la expresión de vimentina y CDH2/N-cadherina (marcadores mesenquimatosos) y CDH1/E-cadherina (marcador epitelial). La sobreexpresión de CEACAM5 produjo un aumento de la expresión de CDH1 (Fig. 8c) y disminución de la expresión de CDH2 (Suplemento Fig. 8d) y vimentina (Suplemento Fig. 8e). Además, la sobreproducción de CEACAM5 redujo y retrasó la fosforilación mediada por TGF-β de los Smad en células BC3_A2 (Fig. 4a, c, Suplemento Fig. 9a) y fosforilación de p38 en ambas células BC3_A2 (Fig. 4a, b, Suplemento Fig. 9a) y células MDA-MB-231 (Suplemento Fig. 8f, Suplemento Fig. 9b). Finalmente, la sobreproducción de EMT inducida por TGF-β retardada CEACAM5, evaluada por la expresión de E-cadherina y vimentina (Fig. 4d, Suplemento Fig. 9c). Estos resultados sugieren que CEACAM5 regula negativamente la EMT e identifica una función de CEACAM5 en la metástasis del cáncer de mama.
La sobreproducción de CEACAM5 reduce la expresión de los marcadores mesenquimatosos y perjudica la señalización de TGF-β y perjudica la señalización de TGF-β. a Las células BC3_A2 diseñadas para sobreproducer CEACAM5 o GFP se cultivaron en presencia o ausencia de 1 ng/ml de TGF-β durante los períodos de tiempo indicados. Los lisados celulares se sometieron a Western bloting para las proteínas indicadas. el histograma b, c muestra el cambio de pliegue (escala logarítmica) en el estado de fosforilación de p38 (b) o Smad2/3 (c) en comparación con el del punto de tiempo 0 para las células que expresan GFP. Las barras de error representan SEM de al menos tres experimentos independientes. d Las células BC3_A2 que expresaban GFP o CEACAM5 se cultivaron en presencia o ausencia de 1 ng/ml de TGF-β durante los períodos de tiempo indicados. Los lisados celulares se sometieron a Western bloting para las proteínas indicadas. Todos los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Véanse también las Figuras complementarias. 8 y 9
La sobreproducción de CEACAM5 promueve el crecimiento metastásico y reduce la EMT in vivo
La EMT se asocia con una proliferación celular reducida.19 Por lo tanto, la capacidad de CEACAM5 para inhibir la EMT sugiere que puede funcionar para promover el crecimiento tumoral en sitios metastásicos. Para probar esta hipótesis, se inyectaron células BC3_A2 diseñadas para sobreproducer CEACAM5 o GFP (control) en las venas de la cola de los ratones receptores para monitorear los efectos de la sobreproducción de CEACAM5 en el crecimiento tumoral en el pulmón. La sobreexpresión de CEACAM5 produjo un aumento del crecimiento tumoral en los pulmones (Fig. 5a y Suplemento Fig. 10a), disminución de la expresión de vimentina a nivel proteico (Suplemento Fig. 10b), y disminución de la fosforilación de p38 (Fig. 5d, e). Reducción de los niveles de CEACAM5 en BC3_A2 con dos ARN diferentes (Fig. 5b) tuvo el efecto contrario en que las células transducidas crecieron más lentamente en los pulmones que las células control después de la inyección de la vena de cola (Fig. 5c y Suplemento Fig. 10c). Además, el derribo de CEACAM5 produjo un aumento del número de lesiones pero una disminución del tamaño de la lesión (Suplemento Fig. 10d, e). Estos resultados indican que el silenciamiento de CEACAM5 promueve la TME y la extravasación de células tumorales, a la vez que inhibe el crecimiento metastásico.
La expresión de CEACAM5 promueve el crecimiento de metástasis pulmonares. se inyectaron células BC3_A2 que producían en exceso CEACAM5 o GFP en las venas de la cola de los ratones. BLI se utilizó para cuantificar el flujo de fotones en los pulmones de ratones en los puntos de tiempo indicados. Prueba t emparejada, p = 0,03. Las barras de error representan SEM de réplicas biológicas (n = 5 ratones por grupo). b Las células BC3_A2 que expresan ARS de control (shLuc) o dos ARS diferentes (#3 y #5) específicos para CEACAM5 se sometieron a QRT-PCR para monitorear la expresión de CEACAM5. Las barras de error representan SEM de triplicados técnicos. Véase también la Fig. 10. se inyectaron células c BC3_A2 que expresaban shLuc o dos shRNAs CEACAM5 diferentes en las venas de la cola de ratones. BLI se utilizó para cuantificar el flujo de fotones en los pulmones de ratones en los puntos de tiempo indicados. Pruebas t emparejadas, p = 0,01 para sh # 3 y p < 0,001 para sh#5. Los datos se normalizaron al punto de tiempo inicial y se presentan en una escala logarítmica. Las barras de error representan SEM de réplicas biológicas (n = 5 ratones por grupo). d BC3_A2 se inyectaron células que producían en exceso CEACAM5 en las venas de la cola de ratones, y se aislaron los pulmones y se sometieron a IHQ con los anticuerpos indicados. Las barras de escala indican 100 µm. las células e que dieron positivo para CEACAM5, vimentina o p-p38 en las secciones de tejido representadas en el panel d se cuantificaron utilizando el sistema de imágenes automatizado Vectra 3.0. Pruebas t pareadas, p = 0,0008 para CEACAM5, p = 0,03 para vimentina y p = 0,03 para p-p38. Las barras de error representan SEM de al menos tres réplicas biológicas independientes. el ARN f aislado de células BC3_A2 que producían en exceso CEACAM5 o GFP y cultivado in vitro o aislado del pulmón después de la inyección de la vena de cola (in vivo, a, d) se sometió al análisis de la vía GSEA (dos columnas a la izquierda). Se muestran los 5 procesos con regulación descendente superior (azul) y los 5 procesos con regulación ascendente superior (rojo). Las casillas indican FDR < 0.1 para la significación estadística. NES (puntuación de enriquecimiento normalizado). Importancia de estas vías en los tumores de MFP P0 y P2 vs. se muestran las metástasis pulmonares correspondientes para su comparación (dos columnas a la derecha). Los datos están representados por triplicados biológicos. Véase también la Fig. 11
Para monitorear cómo la sobreproducción de CEACAM5 impactó la expresión génica, las células BC3_A2 diseñadas para sobreproducer CEACAM5 o GFP se cultivaron in vitro o se aislaron del pulmón después de la inyección de la vena de cola (in vivo). El ARN se aisló y se sometió a RNAseq. Se realizó un análisis diferencial de expresión génica y la GSEA identificó la EMT como la única vía distintiva del cáncer que se reguló significativamente a la baja tanto in vitro como in vivo por la sobreproducción de CEACAM5 (Fig. 5f, Suplemento Fig. 11). Este resultado es similar al observado en las metástasis pulmonares P0 y P2 (Figs. 1c, 5f). En conjunto, estos datos indicaron que la regulación ascendente de la expresión de CEACAM5 en lesiones metastásicas induce el MET y mejora el crecimiento de las células tumorales metastásicas en sitios secundarios.
La expresión de CEACAM5 aumenta en lesiones metastásicas de pacientes con cáncer de mama
A continuación, se evaluó la expresión de CEACAM5 en lesiones metastásicas y tejido tumoral de mama obtenido de pacientes con cáncer de mama. La tinción de CIH en un conjunto de tejidos emparejados formado por un tumor primario y una metástasis pulmonar de una paciente con cáncer de mama (Tabla suplementaria 3) reveló niveles más altos de CEACAM5 en la metástasis pulmonar en relación con el tumor primario de mama (Fig. 6a y Suplemento Fig. 12a). Para ampliar estos análisis, un microarray tisular (MAT) compuesto por metástasis pulmonares de 25 pacientes con cáncer de mama (Figs suplementarias. 12b, c y Tabla Suplementaria 3) se tiñeron para CEACAM5 (Fig.Suplementaria. 12b), y se asignó una puntuación a la intensidad de tinción (Fig. 6b). Este método de puntuación también se aplicó a una MAT del Atlas de Proteínas Humanas consistente en tumores de mama humanos teñidos por CEACAM532.La mayoría de las metástasis pulmonares expresaban niveles altos de CEACAM5 (Fig. 6c) en comparación con los tumores de mama (Fig. 6d), lo que demuestra que CEACAM5 fue más alto en las lesiones metastásicas en comparación con los tumores primarios de mama.
Los niveles de proteína CEACAM5 están elevados en lesiones metastásicas de pacientes con cáncer de mama y se correlacionan inversamente con la expresión de vimentina. a El tumor primario y la metástasis pulmonar correspondiente de una paciente con cáncer de mama se sometieron a CIH para controlar las concentraciones de CEACAM5. Las barras de escala indican 100 µm. b Un microarray de tejido tumoral (MAT) compuesto de metástasis pulmonares de 25 pacientes de cáncer de mama se sometió a CIH con un anticuerpo específico de CEACAM5 y se puntuó la intensidad de la tinción. Se muestran imágenes representativas. Las barras de escala indican 100 µm. c El sistema de puntuación en b se aplicó a la MAT consistente en metástasis pulmonares de 25 pacientes con cáncer de mama para evaluar los niveles relativos de CEACAM5. d El sistema de puntuación en b se aplicó a una MAT del Atlas de Proteínas Humanas que constaba de 25 tumores primarios de mama para evaluar las concentraciones relativas de CEACAM5. e El tumor primario y la metástasis pulmonar correspondiente de una paciente con cáncer de mama (de a) se teñieron conjuntamente para CEACAM5 y vimentina y se analizaron mediante microscopía de inmunofluorescencia. Las barras de escala indican 100 µm. la tinción de células f positiva para CEACAM5, vimentina o ambas en las secciones de tejido representadas en e se cuantificó utilizando el sistema de imágenes automatizado Vectra 3.0. g La MAT consistente en metástasis pulmonares de 25 pacientes con cáncer de mama se tiñó conjuntamente para CEACAM5 y vimentina y se analizó mediante microscopía de inmunofluorescencia. Se muestran imágenes representativas. Las barras de escala indican 100 µm. la tinción de células h positiva para CEACAM5, vimentina o ambas en las secciones de tejido mostradas en g se cuantificó utilizando el sistema de imágenes automatizado Vectra 3.0. Véase también la Fig. 12
A continuación evaluamos el conjunto de tejidos emparejados para la coexpresión de CEACAM5 y vimentina. La co-tinción para CEACAM5 y vimentina reveló niveles más altos de CEACAM5 en la metástasis pulmonar en relación con el tumor de mama compatible, y se observó el patrón de tinción inversa para vimentina (Fig. 6e, f). Además, una población menor de células tumorales presentó tinción conjunta para CEACAM5 y vimentina (Fig. 6f). Esas células que dan positivo para ambas proteínas pueden representar células en un estado híbrido de EMT / MET.La MAT consistente en metástasis pulmonares de 25 pacientes con cáncer de mama también demostró una correlación inversa entre CEACAM5 y tinción de vimentina (Fig. 6g, h; Higos suplementarios. 12a-e). Estos resultados confirmaron las conclusiones de nuestros modelos PDX de TNBC y demostraron que la expresión de CEACAM5 se correlaciona inversamente con la expresión de vimentina en tumores primarios de mama y lesiones metastásicas. En conjunto, estos resultados sugieren que CEACAM5 promueve el MET para facilitar el crecimiento tumoral en los sitios metastásicos (Figura suplementaria 12a, b).
