növényi anyagok és növekedési feltételek

Az ebben a vizsgálatban használt vad típusú és mutáns növények mind a Col-0 ökotípusba tartoztak, kivéve az RGA-GFP-RGA vonalakat10, amelyek a Ler ökotípusba tartoztak. a phyB-9 magokat31 az Arabidopsis biológiai erőforrás központból nyerték. A pif4 overexpresser vonalak és a pif4 knockout mutációk (slr2 mutáns) voltak a ref. 3. Kettős pif4 pif5 mutánsokat kaptunk a pif4-101 T-DNS inszerciós allél és a SALK-087012 mutáns18 keresztezésével a PIF5 génbe történő beillesztéssel. Az atga20ox1 génben (At4g25420) kiütéses t-DNS-beillesztést hordozó 20ox vonalakat P. Hedden biztosította. A ga-érzéketlen gai vonalak a stabil Gai fehérjét expresszálták a 35S promoter irányítása alatt. Kettős és hármas mutánsok keletkeztek ezen vonalak átlépésével és az utódok genotipizálásával PCR amplifikációval vagy northern blot analízissel.

a magokat felületsterilizálták és GM agar lemezekre vetették szukróz nélkül32. A lemezeket 2 D-ig hidegen kezeltük 4CC-nél, és a csírázást 3 h besugárzással szinkronizáltuk fehér fénnyel,majd ezt követően 22 órán át sötétben inkubáltuk, mielőtt a különböző növekedési körülményekbe kerültünk. A fehér fényben termesztett palántákat 20cc-n termesztettük fluoreszcens fehér fény alatt (fluencia Arány 40-60 kb m-2 s-1) 16 órás fény/ 8 órás sötét fotoperiódussal. A vörös fényű kezelésekhez a palántákat folyamatos vörös fény alatt termesztették (a LED-ek által biztosított fluenciasebesség 35 Kb m-2 s-1). A sötét termesztésű palánták esetében a lemezeket több réteg alumíniumfóliába csomagolták. A lemezeket függőleges helyzetben helyezték el, és az ImageJ szoftver segítségével szkennelték a hypocotyl hosszát (http://rsb.info.nih.gov/ij). A PAC-kezeléshez a magokat a csírázás indukálása után az inhibitorral ellátott lemezekre helyeztük át. Minden kísérletsorozathoz legalább 20 palántát mértünk.

növényi transzformáció

a pif4 teljes hosszúságú ORF-jét tartalmazó komplementer DNS-fragmenst pif4-GFPf és PIF4-GFPr primerekkel amplifikáltuk, a pENTR/D-TOPO vektorba (Invitrogen) klónoztuk, és a pk7fwg2 bináris vektorba (http://www.psb.ugent.be/gateway/) illesztettük az LR klonázzal (Invitrogen). Ezt a bináris konstrukciót az Agrobacterium pGV3101 törzsébe vezették be, és vad típusú Col-0 és phyB Arabidopsis növényekké alakították át a virágos dip transzformációs módszer33 alkalmazásával. A transzformánsokat kanamicint tartalmazó táptalajon választottuk ki, és pif4–GFP nukleáris fluoreszcencia szempontjából elemeztük. Homozigóta vonalakat választottak ki az erős expresszorok számára.

ga, PAC és MG132 kezelések

a GA3 (GA) és a paklobutrazol (PAC) készleteket frissen etanolban készítettük el. Az MG132 proteaszóma inhibitort DMSO-ban oldottuk. Az MG132 kezeléshez a palántákat 2 órán át előre inkubáltuk az inhibitor 100 MHz-es oldatában. A PAC és GA kezeléseket 0,1, illetve 50, hacsak nem indokolt. Az inhibitorral szembeni érzékenységet a 0,1 km PAC-ban termesztett palántáknál megfigyelt hypocotyl hossz csökkenésnek a Col-0 növényeknél megfigyelt csökkenéshez viszonyított fordított arányaként számították ki (100%). Az értékek három független kísérlet átlaga. A GA-érzékenységet a palánták hypocotyl hosszának növekedésének arányaként számítottuk ki 5,0 MHz GA3-ban, és a vad típusú col-0 palántákra vonatkoztattuk, mint korábban.

élesztő két hibrid vizsgálatok

A Della represszorokat legalább két gén kódolja a burgonyában, a transzkriptumot a tc113247 expresszált szekvenciacímke képviseli, amely a vegetatív szövetekben a leginkább expresszálódik. Ennek a DELLA proteinnek a teljes hosszúságú nyitott olvasási keretét fpg1 és FPG2 primerekkel erősítettük fel, majd a GAL4-BD-vel együtt a PBRIDGE vektorba (Clontech) illesztettük be. Az ehhez a teljes hosszúságú konstrukcióhoz kapcsolódó autoaktivációs aktivitás elkerülése érdekében az n-end (1-188.maradék), az F1 (1-362. maradék), az M5 (188-588. maradék) és a Cter (362-588. maradék) konstrukciókat a GAL4-BD-hez fuzionálva az egyedi SpeI és EcoRI restrikciós helyeken történő emésztéssel nyertük. Az ilyen konstrukciókat tartalmazó plazmidokat, az üres pBridge vektort (pGB) vagy egy p53–GAL4BD fúziót a pgbkt7 vektorban (kontroll) AH109 élesztősejtekké alakítottuk át, és SD-Trp és SD-Trp-Ade-his lemezeken bevontuk a bazális aktiváció tesztelésére (kiegészítő ábra. 1). Az F1, M5 vagy Cter konstrukciókat tartalmazó élesztőtörzsek adták a legalacsonyabb háttéraktivitást, és csaliként használták őket. Az ezeket a konstrukciókat tartalmazó élesztősejteket egy levél burgonya komplementer DNS könyvtárral transzformáltuk, amely a gal4-AD-hez kapcsolódott a pAD-GAL4 vektorban (Stratagene) és az SD-Leu-Trp-Ade-His-en kiválasztott 1-3-3 606 független transzformánssal a pozitív kölcsönhatás érdekében.

az Arabidopsis PIF4 teljes hosszúságú proteinnek megfelelő DNS-fragmentumot PIF4yf és PIF4yr primerekkel végzett PCR-amplifikációval állítottuk elő, és a pgbkt7 és pGADT7 élesztő Vektorok EcoRI helyére helyeztük. Az Arabidopsis PIF3–GAL4BD és PIF3–GAL4AD fúziók konstrukcióit P. Quail készítette.

A DELLA és PIF4 fehérjék deléciós konstrukcióit inverz PCR reakcióval nyertük az RGA–BD és PIF4–AD konstrukciókon a pbridge és pAD-GAL4 vektorokban. A del1RGA és del2RGA konstrukciókat rgadel1 vagy RGAdel2 és pBridBam primerekkel generálták, amelyek mindkét végén egy bamhi restrikciós helyet vezetnek be. A del1PIF4, del2PIF4 és del3PIF4 konstrukciók létrehozásához a pAD-GAL4 polilinker egyedi xbai webhelyét kitöltéssel törölték. Ezt a plazmidot ezután a PIF4del1, PIF4del2 vagy PIF4del3 és pGADXba primerekkel végzett inverz PCR reakciók sablonjaként használták, mindkét végén XbaI restrikciós helyet vezetve be. A PCR-termékeket bamhi-val vagy XbaI-val emésztettük, religáltuk és Escherichia coli-vá alakítottuk át, hogy megkapjuk a különböző konstrukciókat. Ezeket a plazmidokat AH109 élesztőtörzzé alakítottuk át, és SD-4 lemezeken bevontuk a kölcsönhatás vizsgálatára. a galaktozidáz aktivitást ezen transzformánsok folyékony tenyészetein határoztuk meg ONPG szubsztrát és standard protokoll feltételek alkalmazásával.

az Arabidopsis DELLA rga1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) és RGL3 (At5g17490) gének potato RGA M5 fragmentumával egyenértékű konstrukcióit PCR amplifikációval állítottuk elő az rgl1pgb-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r, RGApGB primer készletekkel-F/rgapgb-R és rgapgb-F/gaipgb – R (1.kiegészítő táblázat). Ezeket a fragmenseket az élesztő pgbkt7 vektorába helyeztük a bamhi/SalI restrikciós enzimek alkalmazásával az RGL1, a SalI/PstI az RGL3, a BamHI/PstI az RGA1 és a GAI esetében.

lehúzási vizsgálatok

az Arabidopsis RGA teljes hosszúságú fehérjét kódoló DNS-fragmentumot RGAgst-f és RGAgst-r primerekkel végzett PCR-amplifikációval nyertük, majd a pZEX vektor BamHI helyére klónoztuk, hogy képkockán belüli fúziót kapjunk a GST kódoló régióval. Az rga-pZEX és az üres pzex vektor átalakult az E. coli bl21(DE3)plyss (Stratagene) törzsévé, és ezeknek a sejteknek a tenyészeteit 37 600 = 0,8-ra növeltük. A GST-fehérjék expresszióját 1 mM-es IPTG-vel indukáltuk további 3 órán keresztül 30 6CC-on, és a fehérje extrakciót és a gluthation-Szefaróz gyöngyökhöz (Clontech) való kötődést a gyártó által biztosított protokoll szerint végeztük.

a PGBKT7 vektorban lévő PIF4, PIF3 és karboxi-terminális phyA konstrukciókat használták in vitro transzkripció/transzláció sablonjaként, 35S-metionin jelenlétében, a TNT rendszer (Promega) alkalmazásával. Minden reakcióban plazmid DNS-t (1 6G) használtunk. A lehúzáshoz a transzlációs reakciók közül 10-et 30 percen át inkubáltunk RGA-GST és GST gyöngyökkel (a gyöngyökhöz kötött fehérje 1g) PBS-ben, 0,05% tergitolban, 10% glicerinben. A gyöngyöket alaposan megmossuk, reszuszpendáljuk 2 6db betöltő pufferben, és SDS–PAGE-vel elemezzük a fehérje kötődését.

tranziens expressziós vizsgálatok

az Arabidopsis teljes hosszúságú PIF4 és RGA fehérjéket, valamint az EMONITRGA és del1RGA deléciókat kódoló DNS-fragmenseket PCR-amplifikációval nyertük, primer PIF4yf és PIF4yr, RGAGST-f és RGAgst-r, ANONITRGA-f és RGAgast-r és del1RGA-f és RGAgst-r párokkal, és a polilynker EcoRI vagy BamHI helyekbe helyeztük a pjit60 vektorból, a 2 65s-es promóter irányítása alatt. A G-box motívum fragmentum jelentett gel-shift vizsgálatok, hogy a cél eleme PIF4 felismerés34 összeolvadt a Gus reporter gén és használják, mint egy riporter konstrukció. Nem tudtuk kimutatni ennek a riporterkonstrukciónak a PIF4 által közvetített stimulációját, jelezve, hogy a cacgtg motívumot körülvevő további nukleotidszekvenciákra lehet szükség a hatékony aktiváláshoz. Az ezekben a vizsgálatokban használható promoter elem kereséséhez 35S-PIF4 és pif4 mutánsok előzetes RNS profilozási kísérleteit végeztük, így az LTP3 (At5g59320) erős, upregulált transzkriptumként azonosítható a 35S-PIF4 palántákban. Ennek a génnek a promoter régióját LT3p-f és LTP3p-r primerekkel amplifikáltuk, majd a pGUS vektor EcoRI és BamHI helyeibe illesztettük, hogy megkapjuk az LTP3-GUS reporter konstrukciót. A 2 db 35S-luciferáz fúziót használták belső kontrollként. Az Arabidopsis sejteket szűrőpapírra szórtuk, és egy éjszakán át LT87 táptalajon inkubáltuk (4,4 g L-1 Murashige és Skoog sók + vitaminok, 0,5 g l-1 MES, 0,5 g l-1 NAA, 30 g l-1 szacharóz, 8 g l-1 agar). Két órával a bombázás előtt a szűrőket átvittük LT87 közegbe 200 mM-es mannittal, hogy indukálják a vakuolák visszahúzódását. A DNS kicsapását és a részecskék bombázását hélium-meghajtású részecskegyorsítóval (PDS-1000; Bio-Rad) végezték, a gyártó utasításainak megfelelően. Sejtek átalakult 0,5 µg LTP3-GUS riporter plazmid + 0.5 µg a 2×35S-LUC belső standard, vagy 2 µg pJIT60 üres vektor (LTP3), 1 µg a 2×35S-PIF4 effektor konstrukció + 1 µg pJIT60 (PIF4), vagy 1 µg minden 2×35S-PIF4 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA vagy 2×35S-del1RGA effektor konstrukciók (PIF4 + RGA, PIF4 + ΔRGA, PIF4 + del1RGA). A szűrőket átvisszük friss LT87 lemezekre (- GA) vagy LT87 lemezekre + 50 MHz GA3 (+GA), és 16 órán át inkubáljuk. a sejteket a Luciferase Assay System kit (Promega) által biztosított sejtlízis pufferben extraháljuk, majd 12 000 g-os centrifugálással 5 percig tisztítjuk. A LUC aktivitást a kit, A Gus aktivitást pedig fluorometriás vizsgálattal határoztuk meg35. Az LTP3 promoter aktivitást az egyes mintákban a GUS és a LUC aktivitás arányaként számítottuk ki. Minden kezeléshez négy replika lemezt használtunk.

RNS extrakciók és reverz transzkriptáz (RT)–PCR

a génexpressziós elemzésekhez a teljes RNS-t 4 napos palántákból kivontuk a guanidin-HCl módszer36 alkalmazásával, majd ezt követően DNaseI-vel (Roche) kezeltük, mielőtt a QIAGEN Rneasy Mini oszlopokon (Qiagen) keresztül megtisztítottuk. Az első szálú cDNS-szintézishez RNS-t (1 ~ g) használtunk a nagy kapacitású cDNS archív készlet (Applied Biosystems) felhasználásával, és ebből a reakcióból 1,0 ~ l-t használtunk a PCR amplifikáció sablonjaként. Az ATLTP3-f/AtLTP3-r, az Atexpan-f/Atexpan-r és az Atactin8-f/Atactin8-r Primer készleteket használták az LTP3 (At5g59320), a ons-expansin (At2g20750) és az aktin-8 (at1g49240) átiratok amplifikálásához.

Bimolekuláris fluoreszcencia komplementációs (bifc) vizsgálatok

az Arabidopsis PIF4 és RGA fehérjék teljes hosszúságú nyitott leolvasási képsorozatait pif4yfp-f/ PIF4YFP-r és rgayfp-f/ RGAYFP-r primerekkel amplifikáltuk. A PCR-termékeket a pENTR/D-TOPO vektorba (Invitrogen) klónoztuk, majd LR-reakcióval (Invitrogen) a bináris pBiFC vektorokba (F. Parcy), amely az eyfp fluoreszcens fehérje (eYFPN és eYFPC) amino – vagy C-terminális fragmenseit tartalmazza. Ezeknek a konstrukcióknak mind a nyolc lehetséges páros kombinációja Agrobacterium tumefacienssé alakult át, és a 2-3 hetes Nicothiana benthamiana növények abaxiális felületébe beszivárgott a leírtak szerint37. A tomato bushy stunt vírus p19 fehérjét használták a géncsendesítés elnyomására. A pBiFC konstrukciókat és a p19 hangtompító plazmidot tartalmazó Agrobacterium törzsek D600 aránya 0,7:0,7:1 volt az infiltrációhoz. A fluoreszcenciát a levelek epidermális sejtrétegeiben vizualizáltuk 2 napos infiltráció után, Leica DMR fluoreszcens mikroszkóp segítségével. A leveleket inkubáltuk 1 6G ml-1 4′,6-diamidino-2-fenilindollal (DAPI) a magok festéséhez.

PIF4/RGA–GFP co-immunprecipitáció

az RGA és PIF4 fehérjék Co-immunprecipitációs vizsgálatait 7 napos rga-GFP-RGA transzgenikus palántákon10 végezték fehér fényben. A palántákat vagy sötétben inkubáltuk, vagy PAC – vagy GA-tartalmú táptalajba helyeztük, és az extrakció előtt további 12 órán át inkubáltuk. A GFP–RGA protein immunprecipitációját 4 ca 6 órán át egy anti-GFP antitest (Santa Cruz Biotechnológia) alkalmazásával végezték egy pufferben, amely 50 mM-es Tris-HCl-t, 7,5 pH-t, 150 mM NaCl-t, 0,5% Triton X-100-at, PMSF-et (1 mM) és proteáz inhibitorokat (Sigma) tartalmazott. Protein G agarózt (Sigma) használtunk az immunoprotein komplexek kicsapására. A PIF4 kimutatást anti-PIF4 antitesttel végeztük.

kromatin immunprecipitáció és PCR amplifikáció

a kromatin immunprecipitációs vizsgálatokat az előzőekben leírtak szerint végeztük29. A PIF4-HA palántákat20 GM táptalajon termesztettük 6 napig folyamatos vörös fényben, majd GA-t vagy PAC-ot tartalmazó lemezekre helyeztük, és egy éjszakán át sötétben tartottuk. A kromatin immunprecipitációhoz magoncokat (1,5–2 g) és 40 hektár anti-ha affinitási mátrixot (Roche) használtunk. A kicsapódott DNS-t feloldottuk 50 MHz-es TE – ben, és 0,5 ml-t használtunk PCR-amplifikációhoz az 1.Kiegészítő táblázatban felsorolt primerek felhasználásával. A PCR-feltételek a következők voltak: 94-2 perc C, 35 ciklus 94-15 perc C, 55-30 perc C, 72-30 perc C, majd 72-7 perc C. Szonikált bemeneti DNS-t (0,3%) használtunk kvantitatív kontrollhoz. Western blot elemzéseket végeztünk a kromatin immunprecipitáció után visszanyert PIF4 fehérje mennyiségének számszerűsítésére. A blot-okat egy anti-ha peroxidáz nagy affinitású antitesttel (Roche) immundetektálták.

mikroszkópia

fehérje stabilitási vizsgálatokat végeztünk a Radiance 2100 (Bio-Rad) Lézerszkennelő rendszer Zeiss Axiovert 200 mikroszkóppal összekapcsolva. A GFP és klorofill gerjesztéshez 488 nm hullámhosszúságú argonion lézert, illetve 637 nm-es vörös diódát alkalmaztunk. Az alkalmazott szűrők kombinációja: 560 DCLPXR sugárelosztó és HQ 515/30 emissziós szűrő a GFP-hez, és HQ 660LP a klorofill kimutatására. A képeket egymás után a LaserSharp v5.0 szoftver (Bio-Rad) alkalmazásával készítették, majd a LaserPix V.4 képszoftver (Bio-Rad) segítségével egyesítették.

Gel-shift assay

a pltp-WTf/r és a pLTP-MUTf/r oligonukleotidokat használtuk az LTP3 próbák és az EMSA vizsgálatokban használt specifikus versenytársak előállításához. Az oligonukleotidokat 5 6DC restrikciós enzim pufferben lágyítottuk, és a végjelölést klenow-val töltöttük ki. Fehérje kivonatok esetében N. a benthamiana leveleket a 35S-PIF4–HA (PIF4) és a 35S-RGA–GFP (RGA) konstrukciók Agrobacterium törzseivel vagy e törzsek 1:1 arányú keverékével (PIF4 + RGA) és a fent leírt p19 konstrukcióval infiltráltuk. A levélkivonatokat magas sótartalmú pufferben történő homogenizálással (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0,5% nonidet P-40, 1 mM DTT, + proteáz inhibitor), centrifugálással történő tisztítással és az azt követő dialízissel nyertük 1 ons bb ellen (20 mM HEPES, pH 7,9, 0,1 M KCl, 1 mM EDTA, 0,05% nonidet P-40, 0,5 mM DTT, 10% glicerin). Az ekvivalens mennyiségű PIF4 és RGA fehérje jelenlétét az extraktumokban western blot kimutatással értékelték anti-ha (Roche) és anti-GFP (Santa Cruz) antitestekkel. Ezeknek az extraktumoknak a növekvő mennyiségét (5,0, 10,0, 15,0 Ft) használtuk az EMSA reakcióhoz. Az extraktumokat 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáltuk a jelzett szondával és 100 ng poli (dI-dIC) – val 20 ~ 1 ~ bb-ben, majd 6% – os oldallal elválasztottuk 0,5 ~ ~ tbe-ben. A vad típusú (WT) és mutáns (Mut) lágyított oligonukleotidok 100-szoros feleslegét alkalmazták specifikus versengéshez.