a tüdőmetasztázisok Soros áthaladása in vivo gazdagítja a metasztatikus potenciált
a PDX Wu-BC3 vonalat úgy hozták létre, hogy áttétes TNBC-ben szenvedő beteg melldaganat sejtjeit beültetik a nod/SCID humanizált emlő zsírpárnáiba (MFP-k) egerek egerek.26,27 ezeket a tumorsejteket úgy terveztük, hogy stabilan expresszálják a Click Beetle Red Luciferase-t (CBR-Luc), az mCherry-t és a p53-ra (shA2) specifikus shRNS-t, hogy létrehozzák a BC3_A2 PDX vonalat (korábban BC3-p53KD28 néven ismert) (kiegészítő ábra. 1a). Kimutattuk, hogy a tumorsejtek metasztatizálódtak az MFP-ktől fiziológiailag releváns helyekre, beleértve a tüdőt, a májat, a csontot, az agyat és a nyirokcsomókat.28 Tüdőmetasztázist (P0) izoláltunk replikált egerekből, összevontuk és beültettük a recipiens egerek MFP-jébe. A kapott tüdőmetasztázisokat (P1) izoláltuk, összevontuk, és további egerek MFP-jébe ágyaztuk. Ezekből az egerekből (P2) származó tüdőmetasztázisokat is összegyűjtöttük és összegyűjtöttük (kiegészítő ábra. 1b). A tüdő, a csontok és a máj biolumineszcencia képalkotását (BLI) végeztük a boncolásnál, hogy számszerűsítsük a metasztázis relatív nagyságát az egyes átjáróknál (kiegészítő ábra. 1c). A tumorsejtek számára dúsított soros áthaladás megnövekedett metasztázisképességgel minden helyre (kiegészítő ábra. 1d-f, h) és a szükséges egereket hamarabb el kell altatni (kiegészítő ábra. 1i). Ezzel szemben az MFP-k közötti soros áthaladó daganatok nem eredményeztek fokozott tüdőáttétet (kiegészítő ábra. 1g), jelezve, hogy a fokozott metasztatikus kapacitás megszerzése nem egyszerűen a sorozatosan áthaladó daganatok következménye volt in vivo. Továbbá a megnövekedett metasztatikus kapacitással rendelkező tumorsejtek nem mutattak szignifikáns növekedést a növekedési tulajdonságokban, amikor az MFP-kből izolálták és visszahelyezték a recipiens egerek MFP-jébe (kiegészítő ábra. 1j). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a tumorsejtek soros áthaladása a tüdőből az MFP – kbe ebben a modellben gazdagítja a metasztatikus potenciált, de nem szervspecifikus homing.
A mezenchimális génexpresszió csökken a tüdőmetasztázisokban az MFP tumorokhoz képest
a metasztázist kísérő génexpressziós minták változásainak azonosítása érdekében RNS-szekvenálást (RNAseq) végeztünk tüdőmetasztázisokon (P0 és P2) és MFP (P0 és P2) tumorokon (ábra. 1a. és 1. Kiegészítő táblázat). Kivonása után RNAseq olvas leképezés az egér transzkriptom, csak az emberi átirat olvas használtunk downstream elemzések. A főkomponens-elemzés (PCA) csökkent diszkordanciát tárt fel a biológiai replikációk között az ismételt áthaladással in vivo, mivel a P2 tumorminták biológiai replikációi szorosabban csoportosultak egymással, mint más elemzett alcsoportokkal (ábra. 1b). A génkészlet dúsítási elemzése (GSEA) kimutatta, hogy az EMT volt a legjelentősebb csökkent útvonal mind a P0, mind a P2 tüdőmetasztázisokban az MFP tumorokhoz képest (ábra. 1c). Az EMT-t szabályozó TGF-6 jelátvitel szintén jelentősen csökkent mind a p0, mind a P2 tüdőmetasztázisokban (ábra. 1c).
a Pdx tüdőmetasztázis aláírások azonosítják a metasztázisokban szabályozatlan géneket. az RNASEQ-re izolált MPF tumorok és tüdőmetasztázisok sematikus ábrázolása. B főkomponens elemzések (Pcaseq) az ebben a vizsgálatban használt MFP tumorokból és tüdőmetasztázisokból származó rnaseq adatokból. Minden adatpont egy egyedi egérből származó mintát képvisel. c GSEA útvonal elemzés a dúsított tüdőmetasztázis aláírásáról (P2); a felső 5 lefelé (kék) és felfelé (piros)szabályozott folyamatok jelennek meg. NES, normalizált dúsítási pontszám. A dobozok az FDR <0.1 értéket jelzik a statisztikai szignifikancia szempontjából. Az epithelialis mesenchymalis átmenet (EMT) és a P0 és P2 esetében a TGF-6 jelzés dúsítási diagramjai a jobb oldali panelen láthatók. p < 0,001 az EMT és a TGF-a p0 és P2 jelzéseknél. d QRT-a vimentin expresszió PCR analízise bc3_a2 MFP tumorokban és tüdőből izolált metasztatikus szubpopulációkban. Párosított t-tesztek, p = 0,02 P0 tüdő esetén, p < 0,001 P2 tüdő esetén. Minden adatpont egy egeret jelent. A hibasávok a biológiai ismétlések SEM-jét képviselik. Lásd még kiegészítő ábra. 2. e IHC festést végeztünk a jelzett szövetszakaszokon olyan antitest alkalmazásával, amely felismeri a vimentin humán-specifikus formáját. A skála sávok 100 db-ot jeleznek. f vízesés grafikon, amely az EMT gének expresszióját mutatja A p0 és P2 tüdőmetasztázisokban, összehasonlítva a megfelelő MFP tumorokkal. a p-értékeket az 1. Kiegészítő táblázat tartalmazza. Legalább három független Egerből vett mintákat vontak be az RNAseq analízishez
Kvantitatív valós idejű (qRT-PCR) vizsgálatot végeztek a vimentin, egy mesenchymalis marker expressziójának monitorozására MFP tumorokban és tüdőmetasztázisokban a Soros áthaladás során. A Vimentin expresszió dinamikus mintázatot mutatott, nagyobb expresszióval az MFP tumorokban a megfelelő tüdőmetasztázisokhoz képest az egyes átjáróknál (ábra. 1D), valamint a máj áttétek p0 (kiegészítő ábra. 2a). A Vimentin fehérje szintje összefoglalta ezt a dinamikus mintát (ábra. 1e). További EMT géneket is szabályoztak a tüdőmetasztázisokban a megfelelő MFP tumorokhoz képest (ábra. 1f). A mezenchimális marker CDH2 (az N-kadherint kódoló gén) expressziója ugyanazt a mintát követte, mint a vimentin (kiegészítő ábra. 2b), míg az epitheliális marker CDH1 (az e-kadherint kódoló gén) expressziója fordított tendenciát mutatott (kiegészítő ábra. 2c). Az egyidejűleg beültetett humán stromális fibroblasztokat a tumor betakarításának idejére megtisztítottuk (kiegészítő ábra. 3a-f), kizárva annak lehetőségét, hogy hozzájárultak a mezenchimális markerek expressziójához az MFP tumorokban. Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a daganatok csökkentik a mezenchimális gének expresszióját, ha metasztatikus helyeken jöttek létre.
A könyvtár komplexitásának meghatározása a funkció képernyő nagy áteresztőképességű nyereségéhez
a nagy áteresztőképességű funkcióerősítő (GOF) képernyőt úgy tervezték, hogy azonosítsa a metasztázis funkcionális mozgatórugóit a P2 tüdőmetasztázisok aláírásából. A hoxa1, a metasztázis ismert mozgatórugója, 29 pozitív kontrollként szolgált a képernyő optimalizálásához, a GFP-t pedig negatív kontrollként használták. A BC3_A2 sejteket hoxa1 vagy GFP kódolású lentivírussal transzdukáltuk, és a fertőzött tumorsejteket különböző arányokban kevertük (kiegészítő ábra. 4a). A tumorsejtek vegyes populációit ezután beültettük a recipiens egerek MFP-jébe, a bli-t pedig a tüdő metasztázisainak pontozására használták a boncolás idején (kiegészítő ábra. 4b). Egy második kísérletsorozatban a metasztatikus id19 illesztőprogramot GFP-vel kombinálva alkalmazták, de ebben az esetben a tumorsejtek vegyes populációit injektáltuk a recipiens egerek farokvénájába a metasztázis végső szakaszának modellezésére (kiegészítő ábra. 4c). A fotonfluxus jelentős növekedését figyelték meg a hoxa1: GFP vagy ID1: GFP arányú daganatoknál 1:10. Ezek a komplexitási tesztek azt mutatták, hogy egy jóhiszemű metasztázis-illesztőprogram kimutatható a képernyőn, ha 9 nem illesztőprogram nyitott olvasási kerettel (ORF) egyesítjük, de egy 19 nem illesztőprogramból álló illesztőprogram-készlet elfedte az illesztőprogram észlelésének képességét. Ezen eredmények alapján korlátoztuk a medence méretét 12 ORFs.
nagy áteresztőképességű funkcióerősítő szűrés in vivo azonosítja a TNBC metasztázis jelölt funkcionális mozgatórugóit
annak meghatározására, hogy a P2 tüdőmetasztázis aláírásából származó felszabályozott gének közül melyik volt képes vezetni a tüdőmetasztázist, egyedi vonalkódos lentivirális könyvtárakat terveztünk, amelyek kódolják a 230 gén ORF-jét, amelyek a tüdőmetasztázisokban a leginkább szabályozottak voltak. Az ORF-eket külön-külön expresszáltuk a BC3_A2 sejtekben, így minden sejtvonal egyetlen ORF-et expresszált, a sejteket ezután 12-es csoportokba egyesítettük, majd a poolokat beültettük a recipiens egerek MFP-jébe (n = 10 egér medencénként, ábra. 2a). A GFP-t expresszáló kontroll plazmidot minden medencébe bevontuk a belső metasztázis felmérésére ebben a TNBC modellben. Minden ORF-et egyedi DNS-vonalkóddal társítottak. Az összevont sejtek referencia pelletjét bepattanva fagyasztottuk, hogy megerősítsük az egyes ORF-ek egyenlő ábrázolását a tumor beültetésekor. Tizenhárom hetet választottak a vizsgálat végpontjának, mert a HOXA1, de nem a GFP-t expresszáló daganatok, áttétet képeztek a tüdőbe ebben az időpontban (kiegészítő ábra. 5a). Tizenhárom héttel a beültetés után a tüdőt bli ex vivo-nak vetettük alá (kiegészítő ábra. 5A), metasztatikus elváltozásokat izoláltunk, és a genomi DNS-t (Gdns) extraháltuk és a QPCR sablonjaként használtuk az egyes ORF-hez kapcsolódó egyedi vonalkód-régiók erősítésére (kiegészítő ábra. 5b). Az MFP tumorokat is izoláltuk és alávetettük ezeknek az elemzéseknek (ábra. 2a). Az MFP-ben az egyes vonalkódos ORF-ek ábrázolását a referenciamintához viszonyítva minden egyes készletre meghatároztuk (ábra. 2b; kiegészítő füge. 5c, d). A tüdőben való ábrázolás ezután normalizálódott az MFP-k dúsítására vs. a referencia (ábra. 2b, c). A metasztázis-illesztőprogramok három csoportra oszthatók, beleértve azokat is, amelyek mind a tüdőben, mind az MFP-kben dúsultak (ábra. 2b, jobb felső kvadráns és kiegészítő ábra. 5c), kizárólag MFP-kben dúsítottak (ábra. 2b, jobb alsó kvadráns), valamint a kizárólag tüdőben dúsítottakat (ábra. 2b, bal felső negyed és Fig. 2c). A GFP-t expresszáló sejtek tüdőmetasztázisokban dúsultak egyes medencékben, és a GFP átlagos dúsítási pontszáma a tüdőben körülbelül 5 volt (kiegészítő ábra. 5e). Ezért ezt dúsítási ponthatárként használtuk, hogy meghatározzuk a valódi találatot a képernyőn, és azonosítottunk 44 gént, amelyek szelektíven dúsultak a tüdő áttétekben az elsődleges daganatokhoz képest. Ezeket a találatokat dúsítási pontszám szerint rangsorolták (ábra. 2c és 2. Kiegészítő táblázat). Az első öt találat közül a CEACAM5 volt az egyetlen, amelynek expressziója az elsődleges daganatokban azt mutatta, hogy megjósolja a mellrákos betegek rossz túlélését (kiegészítő ábra. 6a). Ezért tovább vizsgáltuk a ceacam5 funkcionális szerepét az emlőrák metasztázisában.
a nagy áteresztőképességű funkcióerősítő szűrés in vivo azonosítja a metasztázis funkcionális mozgatórugóit. a sematikus ábrázoló használt formátum gain-of-function (GOF) képernyőn. Lásd még kiegészítő ábra. 5. ORF, nyissa meg az olvasási keretet. Minden kohorszba tíz egeret ültettek be. B szórási diagram, amely az egyes ORF relatív ábrázolását mutatja az MFP tumorokban a referencia (x tengely) normalizálását követően, a tüdőben pedig az MFP tumorokhoz viszonyítva (y tengely). A QPCR-adatok számszerűsítésére az ONCT-módszert alkalmaztuk. A CEACAM5 piros színnel jelenik meg. a tüdőmetasztázisokban dúsított C géneket, de az MFP daganatokat nem, a tüdő dúsulásának csökkenő sorrendjében rangsorolták. A szaggatott vonal a dúsítási pontszám levágását jelzi. Lásd még kiegészítő ábra. 5 és a Kiegészítő 2. táblázat
a fokozott CEACAM5 expresszió megerősítése további metasztatikus PDX modellekben
azt találtuk, hogy a CEACAM5 expresszió dinamikusan szabályozott volt, mivel a metasztatikus szubpopulációk sorosan áthaladtak a tüdő és az MFP-k között in vivo (ábra. 3a), megerősítve az RNAseq megállapításait (kiegészítő 1.táblázat és kiegészítő ábra. 6b). Hasonlóképpen, a ceacam5 expressziója magasabb volt a májban (kiegészítő ábra. 7a) és az agy (kiegészítő ábra. 7b) metasztázisok a megfelelő MFP daganatokhoz viszonyítva. A ceacam5 fehérje szintje szintén magasabb volt a tüdőmetasztázisokban az MFP tumorokhoz képest (ábra. 3b). A metasztatikus léziókban a ceacam5 expresszió növekedése nem függött a p53 elnémításától ebben a PDX vonalon, mivel az izogén PDX vonalból származó tüdőmetasztázisok vad típusú p5326, 30 szintén magasabb ceacam5 expressziós szintet mutattak (kiegészítő ábra. 7c).
a CEACAM5 a metasztázisokban fel van szabályozva, expressziója fordítottan korrelál a vimentinnel a TNBC PDX modelljeiben. a CEACAM5 expresszióját MFP tumorokban és a BC3_A2 tumorokkal beültetett egerek metasztatikus lézióiban QRT-PCR-rel határoztuk meg. Párosított t-tesztek, p < 0,001 P0 tüdő, P2 MFP tumor és P2 tüdő esetén. Minden pont egy egyedi egeret képvisel. A hibasávok a biológiai ismétlések SEM-jét képviselik. Lásd még kiegészítő ábra. 7. a BC3_A2 tumorokkal beültetett egerekből származó MFP tumorokat és a hozzájuk tartozó metasztázisokat IHC-vel elemezték CEACAM5 antitest alkalmazásával. A skála sávok 100 db-ot jeleznek. a ceacam5 expresszióját MFP tumorokban és pim001-P tumorokkal beültetett egerek metasztatikus lézióiban QRT-PCR-rel határoztuk meg. Az adatokat napló skálán mutatjuk be. Párosított t-teszt, p < 0.001. Minden pont egy egyedi egeret képvisel. A hibasávok a biológiai ismétlések SEM-jét képviselik. a pim001-P tumorokkal beültetett egerekből származó MFP tumorokat és a hozzájuk tartozó tüdőmetasztázisokat IHC-vel elemezték CEACAM5 antitest alkalmazásával. A skála sávok 100 db-ot jeleznek. e, f a ceacam5-re (felső panel) vagy vimentinre specifikus antitestekkel festett bc3_a2 (e) vagy PIM001-P (f) beültetett egerek soros tumorszövet-szakaszainak IHC-je. A skála sávok 100 db-ot jeleznek. a CEACAM5 (felső panel) vagy a vimentin (Alsó panel) G expresszióját emlőrákos sejtvonalak paneljén határoztuk meg. A hibasávok a technikai hármasok SEM-jét jelentik. H IHC-t végeztek a foszforilált p38 monitorozására MFP tumorokban és bc3_a2 egerek tüdőmetasztázisaiban. A skála sávok 100 db-ot jeleznek
a TNBC (PIM001) PDX modelljeinek egy második csoportját értékelték annak megállapítására, hogy a metasztatikus léziókban a ceacam5 növekedése a metasztázis általános tulajdonsága volt-e. A pim001-P-t metasztatikus TNBC-ben szenvedő beteg kezelés-na ~ fő daganatából állapították meg, míg a pim001-M-t ugyanazon beteg dermális metasztázisából állapították meg. A pim001-P tumorsejteket úgy tervezték, hogy mind a CBR-Luc-t, mind az mCherry-t expresszálják, majd beültetik a recipiens egerek MFP-jébe. A boncolás idején MFP tumorokat és tüdőmetasztázisokat izoláltak. A CEACAM5 expressziója mindkét mRNS-szinten növekedett (ábra. 3C) és a fehérje-szintek (ábra. 3d) a pim001-P tüdőmetasztázisokban a megfelelő MFP daganatokkal összehasonlítva. Érdekes módon a ceacam5 fehérje szintje magasabb volt a Pdx MFP tumorokban, amelyeket a beteg dermális metasztázisából (PIM001-M) állapítottak meg, összehasonlítva az elsődleges melldaganatából (Pim001-P) létrehozott PDX MFP tumorokkal (kiegészítő ábra. 7d). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a ceacam5 emelkedése a metasztázisok közös tulajdonsága a TNBC PDX modelljeiben.
A CEACAM5 expressziója fordítottan korrelál a vimentin expresszióval és a p38 foszforilezésével
mivel a CEACAM5 expressziója PDX modellekben fordítottan korrelált a vimentin expressziójával (ábra. 1d, 3a; kiegészítő füge. 2a és 7a, b), immunhisztokémiát (IHC) alkalmaztak a tüdőmetasztázisok és az MFP tumorok monitorozására a vimentin és a CEACAM5 relatív szintje szempontjából. A fehérje szintje korrelált az mRNS szinttel mindkét PDX modellben (ábra. 3e, f). A Vimentin expresszió fordítottan korrelált a ceacam5 expresszióval az emlőrákos sejtvonalak paneljén (ábra. 3g). A szerin / treonin-specifikus protein-kináz p38alpha (más néven MAPK14, a továbbiakban p38) az EMT során foszforilálódik.31 érdekes módon a foszforilált (aktív) p38 korrelált a vimentin magas expressziós szintjével az MFP tumorokban, és a p38 foszforiláció csökkent a tüdő metasztázisában, ahol a vimentin szintje alacsony volt (ábra. 3 óra). Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy a CEACAM5 expressziója fordítottan korrelál az EMT markerek expressziójával a tüdőmetasztázisokban.
A CEACAM5 ektopiás túltermelése gátolja a TGF-6 jelátvitelt és az EMT markerek expresszióját
tekintettel arra, hogy a ceacam5 expressziója fordítottan korrelál a mezenchimális státusszal, értékeltük, hogy a CEACAM5 közvetlen szerepet játszott-e a mezenchimális markerek expressziójának szabályozásában. BC3_A2 sejtek, amelyeket úgy terveztek, hogy negatív kontrollként túltermeljék az emberi CEACAM5-et vagy GFP-t (kiegészítő ábra. 8A, b) a vimentin és a CDH2/N-kadherin (mesenchymalis markerek) és a CDH1/E-kadherin (epithelialis marker) expresszióját vizsgálták. A CEACAM5 túlzott expressziója a CDH1 fokozott expressziójához vezetett (kiegészítő ábra. 8C) és a CDH2 csökkent expressziója (kiegészítő ábra. 8d) és vimentin (kiegészítő ábra. 8e). Ezenkívül a ceacam5 túltermelése csökkentette és késleltette az SMAD-ok foszforilációját a bc3_a2 sejtekben (ábra. 4A, C, kiegészítő ábra. 9a) és p38 foszforiláció mindkét BC3_A2 sejtben (ábra. 4a, B, kiegészítő ábra. 9a) és MDA-MB-231 cellák (kiegészítő ábra. 8f, kiegészítő ábra. 9b). Végül a ceacam5 túltermelése késlelteti a TGF-indukált EMT-t az E-kadherin és a vimentin expresszió alapján (ábra. 4D, kiegészítő ábra. 9c). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CEACAM5 negatívan szabályozza az EMT-t, és azonosítja a ceacam5 funkcióját az emlőrák metasztázisában.
a CEACAM5 túltermelés csökkenti a mezenchimális markerek kifejeződését, és rontja a TGF-KB jelzést és rontja a TGF-KB jelzést. a ceacam5 vagy GFP túltermelésére tervezett BC3_A2 sejteket tenyésztettük 1 ng/ml TGF-6 jelenlétében vagy hiányában a megadott időszakokban. A sejtes lizátumokat Western blotnak vetettük alá a jelzett fehérjék számára. a B, c hisztogram a p38 (b) vagy az Smad2/3 (c) foszforilációs állapotának hajtásváltozását (log skála) mutatja a GFP-t expresszáló sejtek 0.időpontjához képest. A hibasávok legalább három független kísérlet SEM-jét képviselik. d BC3_A2 GFP-t vagy CEACAM5-et expresszáló sejteket tenyésztettünk 1 ng/ml TGF-6 jelenlétében vagy hiányában a megadott időszakokban. A sejtes lizátumokat Western blotnak vetettük alá a jelzett fehérjék számára. Minden eredmény reprezentatív legalább három független kísérletre. Lásd még kiegészítő füge. 8 és 9
a CEACAM5 túltermelése elősegíti a metasztatikus kinövést és csökkenti az EMT-t in vivo
az EMT csökkent sejtproliferációval jár.19 Így a CEACAM5 azon képessége, hogy gátolja az EMT-t, azt sugallta, hogy elősegítheti a tumor kinövését a metasztatikus helyeken. Ennek a hipotézisnek a tesztelésére a ceacam5 vagy a GFP (kontroll) túltermelésére tervezett bc3_a2 sejteket injektáltuk a recipiens egerek farokvénájába, hogy figyelemmel kísérjük a CEACAM5 túltermelésének a tumor növekedésére gyakorolt hatását a tüdőben. A CEACAM5 túlzott expressziója a tüdőben megnövekedett tumor növekedéshez vezetett (ábra. 5a és kiegészítő ábra. 10a), a vimentin expressziójának csökkenése a fehérje szintjén (kiegészítő ábra. 10B), valamint a p38 csökkent foszforilációja (ábra. 5d, e). Csökkentése ceacam5 szint BC3_A2 két különböző shRNS (ábra. 5b) ellenkező hatást fejtett ki abban, hogy a transzdukált sejtek lassabban növekedtek a tüdőben, mint a kontroll sejtek a farokvénás injekciót követően (ábra. 5c és kiegészítő ábra. 10c). Ezenkívül a CEACAM5 leütése megnövekedett léziószámot, de csökkent lézióméretet eredményezett (kiegészítő ábra. 10d, e). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CEACAM5 hangtompítás elősegíti az EMT-t és a tumorsejtek extravazációját, ugyanakkor gátolja a metasztatikus kinövést.
a CEACAM5 expressziója elősegíti a tüdőmetasztázisok növekedését. a ceacam5-et vagy GFP-t túltermelő bc3_a2 sejteket injektáltunk az egerek farokvénájába. BLI-t használtunk az egerek tüdejében a foton fluxus számszerűsítésére a megadott időpontokban. Párosított t-teszt, p = 0,03. A hibasávok a biológiai ismétlések SEM-jét jelentik (csoportonként n = 5 egér). a ceacam5-re specifikus bc3_a2 kontroll shRNS-t (shLuc) vagy két különböző shRNS-T (#3 és #5) expresszáló sejteket qRT-PCR-nek vetettünk alá a CEACAM5 expressziójának monitorozására. A hibasávok a technikai hármasok SEM-jét jelentik. Lásd még kiegészítő ábra. 10. C BC3_A2 shluc-t expresszáló sejteket vagy két különböző CEACAM5 shRNS-t injektáltunk az egerek farokvénájába. BLI-t használtunk az egerek tüdejében a foton fluxus számszerűsítésére a megadott időpontokban. Párosított t-tesztek, p = 0,01 az sh#3-ra és p < 0,001 az SH#5-re. Az adatokat a kezdeti időpontra normalizáltuk, és log skálán mutatjuk be. A hibasávok a biológiai ismétlések SEM-jét jelentik (csoportonként n = 5 egér). a ceacam5-t túltermelő d BC3_A2 sejteket egerek farokvénájába injektáltuk, majd a tüdőt izoláltuk, és a jelzett antitestekkel IHC-nek vetettük alá. A skála sávok 100 db-ot jeleznek. a D panelben ábrázolt szövetrészekben a ceacam5, vimentin vagy p-p38 szempontjából pozitívnak bizonyult e sejteket a Vectra 3.0 automatizált képalkotó rendszer segítségével számszerűsítettük. Páros t-teszt: p = 0,0008 a CEACAM5, p = 0,03 a vimentin és p = 0,03 a p-p38 esetében. A hibasávok legalább három független biológiai replikátum SEM-jét képviselik. a ceacam5-öt vagy GFP-t túltermelő bc3_a2 sejtekből izolált, in vitro tenyésztett vagy a tüdőből izolált f RNS-t farokvénás injekció után (in vivo, a, d) GSEA útvonal-elemzésnek vetettük alá (bal két oszlop). A felső 5 lefelé szabályozott (kék) és a felső 5 felfelé szabályozott (piros) folyamat látható. A dobozok az FDR <0.1 értéket jelzik a statisztikai szignifikancia szempontjából. NES (normalizált dúsítási pontszám). Ezen útvonalak jelentősége P0 és P2 MFP tumorokban vs. a megfelelő tüdőmetasztázisok összehasonlításra kerülnek (jobb két oszlop). Az adatokat biológiai triplikátumok képviselik. Lásd még kiegészítő ábra. 11
annak ellenőrzésére, hogy a ceacam5 túltermelése hogyan befolyásolja a génexpressziót, a ceacam5 vagy GFP túltermelésére tervezett BC3_A2 sejteket tenyésztették in vitro vagy izolálták a tüdőből farokvénás injekció után (in vivo). Az RNS-t izoláltuk és RNAseq-nek vetettük alá. Differenciális génexpressziós analízist végeztünk, és a GSEA az EMT-t azonosította az egyetlen rákos hallmark útvonalként, amelyet mind in vitro, mind in vivo jelentősen csökkent a CEACAM5 túltermelése (ábra. 5f, kiegészítő ábra. 11). Ez az eredmény hasonló a p0 és P2 tüdőáttétek (Fig. 1c, 5f). Ezek az adatok együttesen azt mutatták, hogy a ceacam5 expresszió felszabályozása metasztatikus léziókban indukálja a MET-et és fokozza a metasztatikus tumorsejtek kinövését a másodlagos helyeken.
A CEACAM5 expressziója az emlőrákos betegek metasztatikus lézióiban szabályozódik
ezután a ceacam5 expressziót az emlőrákos betegektől kapott metasztatikus léziókban és emlődaganatszövetekben értékelték. IHC-festés egy egyező szövetkészleten, amely egy primer tumorból és egy emlőrákos beteg tüdőmetasztázisából áll (3.Kiegészítő táblázat) magasabb ceacam5 szintet mutatott a tüdőmetasztázisban az elsődleges emlődaganathoz képest (ábra. 6a és kiegészítő ábra. 12a). Ezen elemzések kibővítéséhez egy szöveti mikroarray (TMA), amely 25 emlőrákos beteg tüdőmetasztázisaiból áll (kiegészítő füge. 12b, c és kiegészítő táblázat 3) festettük ceacam5 (kiegészítő ábra. 12B), és festési intenzitás volt rendelve egy pontszámot (ábra. 6b). Ezt a pontozási módszert alkalmazták a humán fehérje Atlasz TMA-jára is, amely emberi emlődaganatokból áll, amelyeket ceacam5-re festettek. 32 a tüdőmetasztázisok többsége magas CEACAM5-szintet fejezett ki (ábra. 6c) képest emlődaganatok (ábra. 6d), bizonyítva, hogy a ceacam5 magasabb volt a metasztatikus elváltozásokban az elsődleges emlődaganatokhoz képest.
a CEACAM5 fehérje szintje emelkedett az emlőrákos betegek metasztatikus lézióiban, és fordítottan korrelál a vimentin expressziójával. a az emlőrákos betegek elsődleges daganatát és ennek megfelelő tüdőmetasztázisát IHC-nek vetették alá a CEACAM5 szint monitorozása érdekében. A skála sávok 100 db-ot jeleznek. b a 25 emlőrákos beteg tüdőmetasztázisaiból álló tumorszövet mikroarray-t (TMA) CEACAM5-specifikus antitesttel IHC-nek vetették alá, és a festési intenzitást értékelték. Reprezentatív képek jelennek meg. A skála sávok 100 db-ot jeleznek. c A b pontozási rendszert alkalmazták a TMA-ra, amely tüdőmetasztázisokból áll 25 emlőrákos betegek a relatív CEACAM5 szintek értékelésére. d A B pontozási rendszert az emberi fehérje atlaszból származó TMA-ra alkalmaztuk, amely a következőkből áll: 25 elsődleges emlődaganatok a relatív CEACAM5 szintek értékelésére. e az emlőrákos beteg elsődleges daganatát és ennek megfelelő tüdőmetasztázisát (A-ból) ceacam5-re és vimentinre festették, és immunfluoreszcens mikroszkóppal elemezték. A skála sávok 100 db-ot jeleznek. az e-ben ábrázolt szövetszakaszokban a ceacam5, vimentin vagy mindkettő szempontjából pozitív f-sejteket a Vectra 3.0 automatizált képalkotó rendszer segítségével számszerűsítettük. g a 25 emlőrákos beteg tüdőáttétjeiből álló TMA-t ceacam5-re és vimentinre festették, és immunfluoreszcens mikroszkóppal elemezték. Reprezentatív képek jelennek meg. A skála sávok 100 db-ot jeleznek. a G-ben bemutatott szövetszakaszokban a ceacam5, vimentin vagy mindkettő szempontjából pozitív h-sejteket a Vectra 3.0 automatizált képalkotó rendszer segítségével számszerűsítettük. Lásd még kiegészítő ábra. 12
ezután megvizsgáltuk a megfelelő szövetkészletet a CEACAM5 és a vimentin együttes expressziójához. A ceacam5 és a vimentin együttes festése magasabb ceacam5 szintet mutatott a tüdő metasztázisában az egyező emlőtumorhoz képest, és a vimentin esetében fordított festési mintázatot figyeltek meg (ábra. 6e, f). Ezenkívül a tumorsejtek kisebb populációja mind a CEACAM5, mind a vimentin együttes festését mutatta (ábra. 6f). Azok a sejtek, amelyek mindkét fehérjére pozitívan festenek, hibrid EMT/MET állapotban lévő sejteket képviselhetnek.33 a 25 emlőrákos beteg tüdőmetasztázisaiból álló TMA szintén fordított korrelációt mutatott a CEACAM5 és a vimentin festés között (ábra. 6g, h; kiegészítő füge. 12a-e). Ezek az eredmények megerősítették a TNBC PDX modelljeivel végzett következtetéseket, és kimutatták, hogy a ceacam5 expresszió fordítottan korrelál a vimentin expresszióval primer emlődaganatokban és metasztatikus elváltozásokban. Ezek az eredmények együttesen azt sugallják, hogy a CEACAM5 elősegíti a MET-et, hogy megkönnyítse a tumor kinövését a metasztatikus helyeken (kiegészítő ábra 12A, b).
