Le passage en série de métastases pulmonaires in vivo enrichit le potentiel métastatique
La lignée PDX WU-BC3 a été générée en greffant des cellules tumorales mammaires d’une patiente atteinte de TNBC métastatique dans les coussinets adipeux mammaires humanisés (MFP) de NOD / Souris SCID souris.26,27 Nous avons conçu ces cellules tumorales pour exprimer de manière stable la Luciférase Rouge du coléoptère Cliquet (CBR-Luc), la mCherry et un shRNA spécifique à la p53 (shA2) afin de créer la lignée PDX BC3_A2 (anciennement connue sous le nom de BC3-p53KD28) (Fig. supplémentaire. 1 bis). Nous avons démontré que les cellules tumorales métastasées des MFP aux sites physiologiquement pertinents, y compris les poumons, le foie, les os, le cerveau et les ganglions lymphatiques.28 métastases pulmonaires (P0) ont été isolées chez des souris répliquées, regroupées et greffées dans les MFP des souris receveuses. Les métastases pulmonaires (P1) résultantes ont été isolées, regroupées et greffées dans les MFP de souris supplémentaires. Les métastases pulmonaires de ces souris (P2) ont également été collectées et regroupées (Fig. 1b). Nous avons réalisé une imagerie par bioluminescence (BLI) des poumons, des os et du foie lors de la nécropsie pour quantifier l’ampleur relative des métastases à chaque passage (Fig. 1c). Passage en série enrichi pour les cellules tumorales ayant une capacité accrue de métastase sur tous les sites (Fig. 1d-f, h) et exige que les souris soient euthanasiées plus tôt (fig. 1i). En revanche, les tumeurs de passage en série entre les MFP n’ont pas entraîné d’augmentation des métastases pulmonaires (Fig. 1g), indiquant que l’acquisition d’une capacité métastatique accrue n’était pas simplement une conséquence du passage en série de tumeurs in vivo. De plus, les cellules tumorales à capacité métastatique accrue ne présentaient pas d’augmentation significative des propriétés de croissance lorsqu’elles étaient isolées des MFP et replacées dans les MFP des souris receveuses (Fig. supplémentaire. 1j). Pris ensemble, ces résultats démontrent que le passage en série de cellules tumorales des poumons aux MFP dans ce modèle enrichit le potentiel métastatique, mais pas le homing spécifique à l’organe.
L’expression des gènes mésenchymateux est réduite dans les métastases pulmonaires par rapport aux tumeurs MFP
Pour identifier les changements dans les modèles d’expression des gènes qui accompagnent les métastases, nous avons effectué un séquençage de l’ARN (RNAseq) sur les métastases pulmonaires (P0 et P2) et les tumeurs MFP (P0 et P2) (Fig. 1a et Tableau supplémentaire 1). Après avoir soustrait le mappage des lectures RNAseq au transcriptome de la souris, seules les lectures de transcriptions humaines ont été utilisées pour les analyses en aval. L’analyse en composantes principales (ACP) a révélé une diminution de la discordance entre les répliques biologiques avec des passages répétés in vivo, car les répliques biologiques d’échantillons de tumeurs P2 se regroupent plus étroitement les unes avec les autres qu’avec d’autres sous-populations analysées (Fig. 1b). L’analyse d’enrichissement des ensembles de gènes (GSEA) a révélé que l’EMT était la voie la plus significativement régulée dans les métastases pulmonaires P0 et P2 par rapport aux tumeurs MFP (Fig. 1c). La signalisation TGF-β, qui régule l’EMT, a également été significativement régulée dans les métastases pulmonaires P0 et P2 (Fig. 1c).
Les signatures de métastases pulmonaires PDX identifient les gènes déréglés dans les métastases. une représentation schématique des tumeurs MPF et des métastases pulmonaires isolées pour RNAseq. b Analyses en composantes principales (PCAs) à partir des données RNAseq générées à partir de tumeurs MFP et de métastases pulmonaires utilisées dans cette étude. Chaque point de données représente un échantillon d’une souris individuelle. analyse de la voie c GSEA sur la signature de métastase pulmonaire enrichie (P2); les 5 premiers processus régulés vers le bas (bleu) et vers le haut (rouge) sont affichés. NES, score d’enrichissement normalisé. Les cases indiquent FDR < 0.1 pour la signification statistique. Les diagrammes d’enrichissement pour la transition mésenchymateuse épithéliale (EMT) et la signalisation TGF-β pour P0 et P2 sont indiqués dans le panneau de droite. p< 0,001 pour la signalisation EMT et TGF-β à P0 et P2. d Analyse qRT-PCR de l’expression de la vimentine dans les tumeurs MFP BC3_A2 et les sous-populations métastatiques isolées du poumon. Tests t appariés, p = 0,02 pour le poumon P0, p < 0,001 pour le poumon P2. Chaque point de données représente une souris. Les barres d’erreur représentent la MEB des répliques biologiques. Voir également la Fig. 2. une coloration à l’IHC a été réalisée sur les coupes de tissus indiquées à l’aide d’un anticorps reconnaissant la forme spécifique de la vimentine chez l’homme. Les barres d’échelle indiquent 100 µm. f Graphique en cascade montrant l’expression des gènes EMT dans les métastases pulmonaires P0 et P2 par rapport aux tumeurs MFP correspondantes. les valeurs p sont fournies dans le tableau supplémentaire 1. Des échantillons d’au moins trois souris indépendantes ont été inclus pour des analyses RNAseq
Un temps réel quantitatif (qRT-PCR) a été effectué pour surveiller l’expression de la vimentine, un marqueur mésenchymateux, dans les tumeurs MFP et les métastases pulmonaires tout au long du passage en série. L’expression de la vimentine présentait un schéma dynamique avec une expression plus élevée dans les tumeurs MFP par rapport aux métastases pulmonaires correspondantes à chaque passage (Fig. 1d) et aux métastases hépatiques à P0 (Fig. 2 bis). Les niveaux de protéines de vimentine ont récapitulé ce schéma dynamique (Fig. 1e). Des gènes EMT supplémentaires ont également été régulés à la baisse dans les métastases pulmonaires par rapport aux tumeurs MFP correspondantes (Fig. 1f). L’expression du marqueur mésenchymateux CDH2 (le gène codant pour la N-cadhérine) a suivi le même schéma que la vimentine (Fig. 2b), alors que l’expression du marqueur épithélial CDH1 (le gène codant pour l’E-cadhérine) présentait une tendance inverse (Fig. 2c). Les fibroblastes stromaux humains co-greffés ont été éliminés au moment de la récolte tumorale (Fig. 3a-f), excluant la possibilité qu’ils aient contribué à l’expression de marqueurs mésenchymateux dans les tumeurs MFP. Pris ensemble, ces résultats démontrent que les tumeurs régulent à la baisse l’expression des gènes mésenchymateux une fois établis dans les sites métastatiques.
Détermination de la complexité de la bibliothèque pour un gain de débit élevé d’un écran de fonction
Un écran de gain de fonction à haut débit (GOF) a été conçu pour identifier les facteurs fonctionnels de métastases à partir de notre signature de métastases pulmonaires P2. HOXA1, un facteur connu de métastase, 29 a servi de contrôle positif pour l’optimisation de l’écran, et GFP a été utilisé comme contrôle négatif. Les cellules BC3_A2 ont été transduites avec un lentivirus codant soit HOXA1, soit GFP, et les cellules tumorales infectées ont été mélangées dans différents rapports (Fig. supplémentaire. 4 bis). Des populations mixtes de cellules tumorales ont ensuite été greffées dans les MFP des souris receveuses, et BLI a été utilisé pour marquer les métastases pulmonaires au moment de la nécropsie (fig. 4b). Dans une deuxième série d’expériences, le pilote métastatique ID19 a été utilisé en combinaison avec la GFP, mais dans ce cas, des populations mixtes de cellules tumorales ont été injectées dans la veine de la queue de souris receveuses pour modéliser les stades finaux de la métastase (Fig. supplémentaire. 4c). Une augmentation significative du flux de photons a été observée à partir de tumeurs avec un rapport HOXA1: GFP ou ID1: GFP de 1: 10. Ces tests de complexité ont démontré qu’un pilote de métastase de bonne foi pouvait être détecté sur notre écran s’il était regroupé avec 9 trames de lecture ouvertes non-conducteur (ORF), mais un pool d’un pilote avec 19 non-conducteurs masquait notre capacité à détecter le pilote. Sur la base de ces résultats, nous avons limité la taille de notre pool à 12 ORF.
Le dépistage in vivo du gain de fonction à haut débit identifie des moteurs fonctionnels candidats de métastases TNBC
Pour déterminer lequel des gènes régulés à la hausse de la signature des métastases pulmonaires P2 était capable de conduire les métastases pulmonaires, nous avons conçu des bibliothèques lentivirales codées à barres personnalisées codant les ORF des 230 gènes les plus fortement régulés dans les métastases pulmonaires. Les ORF ont été exprimés individuellement en cellules BC3_A2 de sorte que chaque lignée cellulaire a exprimé un seul ORF, les cellules ont ensuite été regroupées en groupes de 12 et des pools ont été implantés dans les MFP des souris receveuses (n = 10 souris par pool, Fig. 2 bis). Un plasmide témoin exprimant la GFP a été inclus dans chaque pool pour évaluer les métastases intrinsèques dans ce modèle de TNBC. Chaque ORF était associé à un code-barres ADN unique. Une pastille de référence de cellules regroupées a été congelée pour confirmer une représentation égale de chaque ORF au moment de l’implantation de la tumeur. Treize semaines ont été choisies comme critère d’évaluation de l’étude car HOXA1, mais pas les tumeurs exprimant la GFP, ont métastasé au poumon à ce moment-là (fig. 5 bis). Treize semaines après la prise de greffe, les poumons ont été soumis à BLI ex vivo (Fig. 5a), des lésions métastatiques ont été isolées et de l’ADN génomique (ADNGD) a été extrait et utilisé comme modèle pour qPCR afin d’amplifier des régions de codes-barres uniques associées à chaque ORF (Fig. supplémentaire. 5b). Des tumeurs MFP ont également été isolées et soumises à ces analyses (Fig. 2 bis). La représentation de chaque ORF à code-barres dans le MFP par rapport à l’échantillon de référence a été déterminée pour chaque pool (Fig. 2b; Fig. supplémentaires. 5c, d). La représentation dans le poumon a ensuite été normalisée à l’enrichissement en MFP par rapport à la référence (Fig. 2b, c). Les conducteurs de métastases se sont séparés en trois groupes, y compris ceux enrichis dans les poumons et les MFP (Fig. 2b, quadrant supérieur droit et Fig. 5c), celles enrichies exclusivement en MFP (Fig. 2b, quadrant inférieur droit) et ceux enrichis exclusivement en poumons (Fig. 2b, quadrant supérieur gauche et Fig. 2c). Les cellules exprimant la GFP ont été enrichies en métastases pulmonaires dans certains pools et le score d’enrichissement moyen de la GFP dans le poumon était d’environ 5 (fig. 5e). Par conséquent, nous l’avons utilisé comme seuil de score d’enrichissement pour définir un véritable coup dans notre écran et avons identifié 44 gènes qui ont été enrichis sélectivement dans les métastases pulmonaires par rapport aux tumeurs primaires. Ces résultats ont été classés par score d’enrichissement (Fig. 2c et Tableau supplémentaire 2). Parmi les cinq premiers succès, CEACAM5 était le seul dont l’expression dans les tumeurs primitives prédisait une faible survie chez les patientes atteintes d’un cancer du sein (Fig. 6 bis). Par conséquent, nous avons étudié plus avant le rôle fonctionnel de CEACAM5 dans les métastases du cancer du sein.
Le criblage de gain de fonction à haut débit in vivo identifie les facteurs fonctionnels des métastases. un schéma représentant le format utilisé pour l’écran de gain de fonction (GOF). Voir également la Fig. 5. ORF, cadre de lecture ouvert. Dix souris ont été implantées dans chaque cohorte. diagramme de dispersion b montrant la représentation relative de chaque ORF dans les tumeurs MFP après normalisation par rapport à la référence (axe des abscisses) et dans les poumons par rapport aux tumeurs MFP (axe des ordonnées). La méthode ΔΔCT a été utilisée pour la quantification des données qPCR. CEACAM5 est indiqué en rouge. les gènes c enrichis dans les métastases pulmonaires mais pas dans les tumeurs MFP ont été classés par ordre décroissant d’enrichissement dans les poumons. La ligne pointillée indique la coupure du score d’enrichissement. Voir également la Fig. 5 et Tableau supplémentaire 2
Confirmation de l’expression améliorée de CEACAM5 dans des modèles PDX métastatiques supplémentaires
Nous avons constaté que l’expression de CEACAM5 était régulée dynamiquement lorsque des sous-populations métastatiques étaient passées en série entre les poumons et les MFP in vivo (Fig. 3a), confirmant les résultats de l’ARNASEQ (Tableau supplémentaire 1 et Fig. 6b). De même, l’expression de CEACAM5 était plus élevée dans le foie (Fig. 7a) et le cerveau (Fig. 7b) métastases par rapport aux tumeurs MFP correspondantes. Les taux de protéines CEACAM5 étaient également plus élevés dans les métastases pulmonaires par rapport aux tumeurs MFP (Fig. 3b). L’augmentation de l’expression de CEACAM5 dans les lésions métastatiques n’était pas dépendante du silençage de p53 dans cette lignée PDX, car les métastases pulmonaires de la lignée PDX isogène exprimant le type sauvage p5326,30 affichaient également des niveaux d’expression plus élevés de CEACAM5 (Fig. 7c).
CEACAM5 est régulé à la hausse dans les métastases, et son expression est inversement corrélée à celle de la vimentine dans les modèles PDX de TNBC. une expression de CEACAM5 dans les tumeurs MFP et les lésions métastatiques de souris greffées avec des tumeurs BC3_A2 a été déterminée par qRT-PCR. Tests t appariés, p < 0,001 pour le poumon P0, la tumeur MFP P2 et le poumon P2. Chaque point représente une souris individuelle. Les barres d’erreur représentent la MEB des répliques biologiques. Voir également la Fig. 7. les tumeurs MFP b et les métastases correspondantes de souris greffées avec des tumeurs BC3_A2 ont été analysées par IHC à l’aide d’un anticorps CEACAM5. Les barres d’échelle indiquent 100 µm. l’expression c de CEACAM5 dans les tumeurs MFP et les lésions métastatiques de souris greffées avec des tumeurs PIM001-P a été déterminée par qRT-PCR. Les données sont présentées sur une échelle de journal. Test t apparié, p < 0,001. Chaque point représente une souris individuelle. Les barres d’erreur représentent la MEB des répliques biologiques. les tumeurs d MFP et les métastases pulmonaires correspondantes de souris greffées avec des tumeurs PIM001-P ont été analysées par IHC à l’aide d’un anticorps CEACAM5. Les barres d’échelle indiquent 100 µm. e, f IHC de coupes de tissus tumoraux en série de souris greffées avec BC3_A2(e) ou PIM001-P(f) colorées avec des anticorps spécifiques pour CEACAM5 (panneau supérieur) ou vimentine. Les barres d’échelle indiquent 100 µm. l’expression g de CEACAM5 (panneau supérieur) ou de vimentine (panneau inférieur) a été déterminée dans un panel de lignées cellulaires de cancer du sein. Les barres d’erreur représentent des MEB de triplets techniques. h IHC a été réalisée pour surveiller la p38 phosphorylée dans les tumeurs MFP et les métastases pulmonaires de souris BC3_A2. Les barres d’échelle indiquent 100 µm
Une deuxième série de modèles PDX de TNBC (PIM001) ont été évalués pour déterminer si l’augmentation de CEACAM5 dans les lésions métastatiques était une propriété générale de la métastase. PIM001-P a été établi à partir de la tumeur primaire naïve de traitement d’un patient atteint de TNBC métastatique, tandis que PIM001-M a été établi à partir de la métastase cutanée du même patient. Les cellules tumorales PIM001-P ont été conçues pour exprimer à la fois CBR-Luc et mCherry, puis greffées dans les MFP des souris receveuses. Au moment de la nécropsie, des tumeurs MFP et des métastases pulmonaires ont été isolées. L’expression de CEACAM5 a été augmentée aux deux niveaux d’ARNm (Fig. 3c) et les niveaux de protéines (Fig. 3d) dans les métastases pulmonaires PIM001-P par rapport aux tumeurs MFP correspondantes. Fait intéressant, les taux de protéines CEACAM5 étaient plus élevés dans les tumeurs PDX MFP établies à partir de la métastase cutanée de la patiente (PIM001-M) par rapport aux tumeurs PDX MFP établies à partir de sa tumeur mammaire primaire (PIM001-P) (Fig. supplémentaire. 7d). Collectivement, ces résultats démontrent que l’élévation de CEACAM5 est une propriété commune des métastases dans les modèles PDX de TNBC.
L’expression de CEACAM5 est inversement corrélée à l’expression de la vimentine et à la phosphorylation de p38
Car l’expression de CEACAM5 dans les modèles PDX était inversement corrélée à l’expression de la vimentine (Fig. 1d, 3a; Figs supplémentaires. 2a et 7a, b), l’immunohistochimie (IHC) a été utilisée pour surveiller les métastases pulmonaires et les tumeurs MFP pour les niveaux relatifs de vimentine et de CEACAM5. Les niveaux de protéines sont corrélés aux niveaux d’ARNm dans les deux modèles PDX (Fig. 3e, f). L’expression de la vimentine était également inversement corrélée à l’expression de CEACAM5 dans un panel de lignées cellulaires de cancer du sein (Fig. 3g). La protéine kinase spécifique de la sérine/thréonine p38alpha (également connue sous le nom de MAPK14, ci-après appelée p38) est phosphorylée pendant l’EMT.31 Fait intéressant, la p38 phosphorylée (active) est en corrélation avec des niveaux élevés d’expression de la vimentine dans les tumeurs MFP, et la phosphorylation de la p38 diminue dans les métastases pulmonaires où les niveaux de vimentine sont faibles (Fig. 3h). Collectivement, ces données démontrent que l’expression de CEACAM5 est inversement corrélée à l’expression des marqueurs EMT dans les métastases pulmonaires.
La surproduction ectopique de CEACAM5 inhibe la signalisation TGF-β et l’expression des marqueurs EMT
Étant donné que l’expression de CEACAM5 est inversement corrélée au statut mésenchymateux, nous avons évalué si CEACAM5 avait un rôle direct dans la régulation de l’expression des marqueurs mésenchymateux. Cellules BC3_A2 conçues pour surproduire du CEACAM5 humain ou du GFP comme témoin négatif (Fig. 8a, b) ont été examinés pour l’expression de la vimentine et de la CDH2/N-cadhérine (marqueurs mésenchymateux) et de la CDH1/E-cadhérine (marqueur épithélial). La surexpression de CEACAM5 a entraîné une augmentation de l’expression de CDH1 (Fig. 8c) et diminution de l’expression de CDH2 (Fig. 8d) et la vimentine (Fig. 8e). De plus, la surproduction de CEACAM5 a réduit et retardé la phosphorylation médiée par le TGF-β des SMAD dans les cellules BC3_A2 (Fig. 4a, c, Fig. supplémentaire. 9a) et la phosphorylation de p38 dans les deux cellules BC3_A2 (Fig. 4a, b, Fig. supplémentaire. 9a) et les cellules MDA-MB-231 (Fig. 8f, Fig. supplémentaire. 9b). Enfin, la surproduction de CEACAM5 a retardé l’EMT induite par le TGF-β telle qu’évaluée par l’expression de l’E-cadhérine et de la vimentine (Fig. 4d, Fig. supplémentaire. 9c). Ces résultats suggèrent que CEACAM5 régule négativement l’EMT et identifie une fonction pour CEACAM5 dans les métastases du cancer du sein.
La surproduction CEACAM5 régule à la baisse l’expression des marqueurs mésenchymateux et altère la signalisation TGF-β et altère la signalisation TGF-β. des cellules BC3_A2 conçues pour surproduire du CEACAM5 ou du GFP ont été cultivées en présence ou en absence de 1 ng/ml de TGF-β pendant les périodes indiquées. Les lysats cellulaires ont été soumis à un Western blot pour les protéines indiquées. l’histogramme b, c montre le changement de pli (échelle logarithmique) de l’état de phosphorylation de p38(b) ou Smad2/3 (c) par rapport à celui au point temporel 0 pour les cellules exprimant la GFP. Les barres d’erreur représentent la MEB d’au moins trois expériences indépendantes. des cellules d BC3_A2 exprimant GFP ou CEACAM5 ont été cultivées en présence ou en absence de 1 ng/ml de TGF-β pendant les périodes indiquées. Les lysats cellulaires ont été soumis à un Western blot pour les protéines indiquées. Tous les résultats sont représentatifs d’au moins trois expériences indépendantes. Voir également les Fig. 8 et 9
La surproduction de CEACAM5 favorise l’excroissance métastatique et réduit la TEM in vivo
La TEM est associée à une prolifération cellulaire réduite.19 Ainsi, la capacité du CEACAM5 à inhiber l’EMT suggère qu’il peut fonctionner pour favoriser l’excroissance tumorale au niveau des sites métastatiques. Pour tester cette hypothèse, des cellules BC3_A2 conçues pour surproduire du CEACAM5 ou du GFP (témoin) ont été injectées dans les veines de la queue des souris receveuses pour surveiller les effets de la surproduction de CEACAM5 sur la croissance tumorale dans le poumon. La surexpression de CEACAM5 a entraîné une augmentation de la croissance tumorale dans les poumons (Fig. 5a et Fig. supplémentaires. 10a), diminution de l’expression de la vimentine au niveau des protéines (Fig. 10b), et diminution de la phosphorylation de p38 (Fig. 5d, e). Réduire les niveaux de CEACAM5 dans BC3_A2 avec deux shRNA différents (Fig. 5b) a eu l’effet inverse en ce sens que les cellules transduites ont augmenté plus lentement dans les poumons que les cellules témoins après l’injection de la veine de queue (Fig. 5c et Fig. supplémentaires. 10c). De plus, le knockdown CEACAM5 a entraîné une augmentation du nombre de lésions mais une diminution de la taille des lésions (Fig. 10d, e). Ces résultats suggèrent que le silençage CEACAM5 favorise l’extravasation des cellules tumorales et de l’EMT tout en inhibant l’excroissance métastatique.
L’expression de CEACAM5 favorise la croissance des métastases pulmonaires. des cellules BC3_A2 en surproduction de CEACAM5 ou de GFP ont été injectées dans les veines de la queue de souris. BLI a été utilisé pour quantifier le flux de photons dans les poumons de souris aux moments indiqués. Test t apparié, p = 0,03. Les barres d’erreur représentent la MEB des répliques biologiques (n = 5 souris par groupe). les cellules b BC3_A2 exprimant le shRNA témoin (shLuc) ou deux shRNA différents (#3 et #5) spécifiques du CEACAM5 ont été soumises à une qRT-PCR pour surveiller l’expression du CEACAM5. Les barres d’erreur représentent des MEB de triplets techniques. Voir également la Fig. 10. des cellules c BC3_A2 exprimant le shLuc ou deux shRNA CEACAM5 différents ont été injectées dans les veines de la queue de souris. BLI a été utilisé pour quantifier le flux de photons dans les poumons de souris aux moments indiqués. Tests t appariés, p = 0,01 pour sh #3 et p < 0,001 pour sh#5. Les données ont été normalisées au point temporel initial et sont présentées sur une échelle log. Les barres d’erreur représentent la MEB des répliques biologiques (n = 5 souris par groupe). des cellules d BC3_A2 en surproduction de CEACAM5 ont été injectées dans les veines de la queue de souris, et les poumons ont été isolés et soumis à une IHC avec les anticorps indiqués. Les barres d’échelle indiquent 100 µm. les cellules e ayant une coloration positive pour le CEACAM5, la vimentine ou la p-p38 dans les coupes de tissus représentées dans le panneau d ont été quantifiées à l’aide du système d’imagerie automatisé Vectra 3.0. Tests t appariés, p = 0,0008 pour CEACAM5, p = 0,03 pour la vimentine et p = 0,03 pour p-p38. Les barres d’erreur représentent la MEB d’au moins trois répliques biologiques indépendantes. l’ARN f isolé de cellules BC3_A2 en surproduction de CEACAM5 ou de GFP et cultivé in vitro ou isolé du poumon après injection de veine de queue (in vivo, a, d) a été soumis à une analyse de la voie GSEA (deux colonnes à gauche). Les processus top 5 à régulation descendante (bleu) et top 5 à régulation ascendante (rouge) sont affichés. Les cases indiquent FDR < 0.1 pour la signification statistique. NES (score d’enrichissement normalisé). Signification de ces voies dans les tumeurs MFP P0 et P2 vs. les métastases pulmonaires correspondantes sont présentées à titre de comparaison (deux colonnes à droite). Les données sont représentées par des triplés biologiques. Voir également la Fig. 11
Pour surveiller l’impact de la surproduction de CEACAM5 sur l’expression des gènes, des cellules BC3_A2 conçues pour surproduire CEACAM5 ou GFP ont été cultivées in vitro ou isolées du poumon après injection de veine de queue (in vivo). L’ARN a été isolé et soumis à RNAseq. Une analyse différentielle de l’expression génique a été réalisée, et GSEA a identifié l’EMT comme la seule voie caractéristique du cancer qui a été significativement régulée à la fois in vitro et in vivo par la surproduction de CEACAM5 (Fig. 5f, Fig. supplémentaire. 11). Ce résultat est similaire à celui observé dans les métastases pulmonaires P0 et P2 (Fig. 1c, 5f). Collectivement, ces données ont indiqué que la régulation à la hausse de l’expression de CEACAM5 dans les lésions métastatiques induit le MET et améliore l’excroissance des cellules tumorales métastatiques dans les sites secondaires.
L’expression de CEACAM5 est régulée à la hausse dans les lésions métastatiques de patientes atteintes d’un cancer du sein
Ensuite, l’expression de CEACAM5 a été évaluée dans les lésions métastatiques et le tissu tumoral du sein obtenu chez des patientes atteintes d’un cancer du sein. La coloration IHC sur un ensemble de tissus appariés constitué d’une tumeur primaire et d’une métastase pulmonaire d’une patiente atteinte d’un cancer du sein (Tableau supplémentaire 3) a révélé des taux de CEACAM5 plus élevés dans la métastase pulmonaire par rapport à la tumeur mammaire primaire (Fig. 6a et Fig. supplémentaires. 12 bis). Pour élargir ces analyses, une puce tissulaire (TMA) constituée de métastases pulmonaires de 25 patientes atteintes d’un cancer du sein (Figs supplémentaires. 12b, c et Tableau supplémentaire 3) a été coloré pour CEACAM5 (Fig. supplémentaire. 12b), et une note a été attribuée à l’intensité de la coloration (fig. 6b). Cette méthode de notation a également été appliquée à un TMA de l’Atlas des protéines humaines constitué de tumeurs mammaires humaines colorées pour CEACAM5.32 La majorité des métastases pulmonaires exprimaient des niveaux élevés de CEACAM5 (Fig. 6c) par rapport aux tumeurs du sein (Fig. 6d), démontrant que le CEACAM5 était plus élevé dans les lésions métastatiques que dans les tumeurs mammaires primaires.
Les taux de protéines CEACAM5 sont élevés dans les lésions métastatiques des patientes atteintes d’un cancer du sein et sont inversement corrélés à l’expression de la vimentine. a La tumeur primaire et les métastases pulmonaires correspondantes d’une patiente atteinte d’un cancer du sein ont été soumises à une IHC pour surveiller les taux de CEACAM5. Les barres d’échelle indiquent 100 µm. b Un microarray de tissu tumoral (TMA) constitué de métastases pulmonaires de 25 patientes atteintes d’un cancer du sein a été soumis à une IHC avec un anticorps spécifique à CEACAM5 et l’intensité de la coloration a été notée. Des images représentatives sont affichées. Les barres d’échelle indiquent 100 µm. c Le système de notation en b a été appliqué à l’AMT constituée de métastases pulmonaires de 25 patientes atteintes d’un cancer du sein pour évaluer les taux relatifs de CEACAM5. d Le système de notation en b a été appliqué à un TMA de l’Atlas des protéines humaines composé de 25 tumeurs mammaires primaires pour évaluer les niveaux relatifs de CEACAM5. e La tumeur primaire et les métastases pulmonaires correspondantes d’une patiente atteinte d’un cancer du sein (de a) ont été co-colorées pour le CEACAM5 et la vimentine et analysées par microscopie à immunofluorescence. Les barres d’échelle indiquent 100 µm. les cellules f colorées positives pour le CEACAM5, la vimentine ou les deux dans les coupes de tissus représentées en e ont été quantifiées à l’aide du système d’imagerie automatisé Vectra 3.0. g La TMA constituée de métastases pulmonaires de 25 patientes atteintes d’un cancer du sein a été co-colorée pour le CEACAM5 et la vimentine et analysée par microscopie par immunofluorescence. Des images représentatives sont affichées. Les barres d’échelle indiquent 100 µm. les cellules h ayant une coloration positive pour le CEACAM5, la vimentine ou les deux dans les coupes de tissus indiquées en g ont été quantifiées à l’aide du système d’imagerie automatisé Vectra 3.0. Voir également la Fig. 12
Nous avons ensuite évalué l’ensemble de tissus appariés pour la co-expression du CEACAM5 et de la vimentine. La co-coloration du CEACAM5 et de la vimentine a révélé des taux plus élevés de CEACAM5 dans la métastase pulmonaire par rapport à la tumeur mammaire correspondante, et le schéma de coloration inverse a été observé pour la vimentine (Fig. 6e, f). De plus, une population mineure de cellules tumorales présentait une co-coloration pour le CEACAM5 et la vimentine (Fig. 6f). Ces cellules colorées positivement pour les deux protéines peuvent représenter des cellules dans un état hybride EMT/ MET.33 L’AMT constituée de métastases pulmonaires de 25 patientes atteintes d’un cancer du sein a également démontré une corrélation inverse entre la CEACAM5 et la coloration à la vimentine (Fig. 6g, h; Figs supplémentaires. 12 bis-e). Ces résultats ont confirmé les conclusions de nos modèles PDX de TNBC et ont démontré que l’expression de CEACAM5 est inversement corrélée à l’expression de la vimentine dans les tumeurs mammaires primaires et les lésions métastatiques. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que CEACAM5 favorise le MET pour faciliter l’excroissance tumorale au niveau des sites métastatiques (Figure supplémentaire 12a, b).
