Toutes les méthodes utilisées dans les études humaines et animales ont été effectuées conformément aux directives et réglementations institutionnelles pertinentes.

Isolement et culture des CSM adhérents plastiques et des CSM immunopositifs CD271 à partir de tissus adipeux

Après l’approbation éthique de l’Autorité de recherche en santé du National Health Service (NHS) (numéro LREC 12/EE/ 0136) et le consentement éclairé de tous les donneurs, les CSM PA et les CSM CD271+ ont été isolés de ceux qui avaient été récoltés en tant que déchets chirurgicaux. L’AT a été haché et traité avec 0.3 U / ml de collagénase (Sigma, Dorset UK) pendant deux heures à 37 ° C, après quoi le Milieu Eagle Modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de sérum de veau foetal (FCS) à 20% (v / v) et de pénicilline et de streptomycine à 1% (v / v) (tous de PAA, Yeovil, Somerset, UK) a été ajouté et la préparation digérée centrifugée à 600 g pendant 10 minutes. Le culot résultant a été remis en suspension dans du DMEM additionné de 10% (v / v) de FCS et de 1% (v / v) de pénicilline et de streptomycine, c’est-à-dire un milieu de culture standard et passé à travers une passoire cellulaire de 100 µm (BD Biosciences, Berkshire, Royaume-Uni). Le filtrat a été re-centrifugé à 600 g pendant 10 minutes et les cellules granulées remises en suspension dans un milieu de culture standard de 5 ml et passées dans une passoire à cellules de 40 µm. La suspension cellulaire résultante a ensuite été traitée avec du Tampon de Lyse érythrocytaire (Miltenyi Biotech, Surrey, UK) pendant 10 minutes à température ambiante. Pour chaque préparation AT, des CSM ont été isolées à partir des cellules mononucléées présentes après lyse des érythrocytes par leur adhésion accrue au plastique de culture tissulaire8 ou par tri magnétique des cellules associées (CMA) pour l’immunopositivité CD27114. Ces cellules ont été cultivées en milieu de culture standard dans une atmosphère humidifiée à 37 °C avec passage de routine par trypsinisation à 80% de confluence. Les CSM PA et les CSM CD271+ aux passages II à III ont été utilisés pour toutes les expériences ultérieures. La cytométrie en flux a été utilisée pour évaluer l’enrichissement des cellules CD271+ (à l’aide de la technologie MACS), où les cellules fraîchement isolées ont été stockées à -80 °C pendant la nuit après l’isolement, puis décongelées et immunostées immédiatement pour le CD271; pour tous les échantillons, > 90% des cellules étaient immunopositives au CD271 à ce moment (données non présentées).

Protocoles de différenciation in vitro

La capacité de différenciation des CSM PA et CD271+ à former des ostéocytes, des chondrocytes et des adipocytes a été évaluée comme décrit précédemment 8,45. Brièvement, pour l’ostéogenèse, des cultures monocouches de CSM ont été traitées avec de la dexaméthasone à 10 nM, de l’acide ascorbique à 50 ng / ml et du bêta-glycérophosphate à 1 mM (par rapport aux témoins porteurs) tous les 2-3 jours pendant une période de 4 semaines, après quoi les cultures ont été récoltées par fixation et colorées pour l’activité de la phosphatase alcaline comme suit: les cellules ont été fixées avec du formol tampon neutre à 10% pendant 10 minutes. Pendant ce temps, une solution de coloration a été préparée en plaçant 25 mg de naphtol-phosphate (Naphtol AS-MX phosphate: Sigma) dans 0,5 ml de diméthyl formamide. Cette solution a été mélangée avec 50 ml de tampon Tris-HCl 0,2 M contenant 50 mg de TR rouge rapide (Sigma). Après un bon mélange, la solution finale a été filtrée à l’aide de papier filtre Whatman No. 1 (Whatman). La solution fixatrice a ensuite été retirée et les cellules ont été lavées avec du PBS, puis 1 ml de la solution de coloration a été ajouté à chaque puits pendant 1 heure. Enfin, la tache a été enlevée et des images numérisées ont été capturées au microscope inversé. La différenciation le long de la lignée ostéogénique a ensuite été évaluée par une augmentation de l’activité de la phosphatase alcaline dans les cellules différenciées par rapport aux cellules indifférenciées à l’aide d’un kit disponible dans le commerce (Biovision, USA) et en suivant le protocole du fabricant; en bref, les cellules ont été homogénéisées dans le tampon de dosage. Les cellules homogénéisées ont ensuite été centrifugées pour éliminer la matière insoluble à 13 000 g pendant 3 minutes. Ensuite, 80 µl de chacun des échantillons ont été chargés dans des puits séparés d’une plaque à 96 puits. Ensuite, 50 µl de 5 mm de solution de pNPP ont été ajoutés à chaque puits d’échantillon. Après une étape de mélange par pipetage de haut en bas, les puits ont été incubés à 25 °C pendant 60 minutes. Une courbe étalon a été générée en diluant 40 µl de 5 mM de pNPP dans 160 µl de tampon de dosage pour générer un étalon pNPP de 1 mM. Ensuite, 0, 4, 6, 12, 16 et 20 µl de cette solution étalon ont été chargés dans une plaque à 96 puits pour générer des étalons pNPP de 0 à 20 nmol/ml pouvant être mesurés par spectrophotométrie. Pour la chondrogenèse, des pastilles cellulaires ont été préparées dans du DMEM / glucose élevé (Sigma) additionné de dexaméthasone 100 nM (DEX),37.5 µg / ml d’ascorbate-2-phosphate, 1% (vol / vol) d’insuline, de transferrine et de sélénium (ITS-X100; Sigma) et 10 ng / ml de facteur de croissance transformant -β1 (TGF-β1) (PeproTech, Londres, Royaume-Uni), et pénicilline et streptomycine. Les cultures témoins ont été traitées avec du DMEM / milieu à haute teneur en glucose avec des supports seuls, c’est-à-dire du méthanol, de l’eau stérile et du BSA à des dilutions appropriées. Au jour 28, la différenciation chondrogénique a été examinée histologiquement en fixant les pastilles dans du formol tamponné neutre à 10%, puis en les incorporant dans de la paraffine et en coupant des coupes de tissu, qui ont été colorées au bleu de toluidine (Sigma) comme marqueur de la synthèse des protéoglycans8. De plus, le taux de glycosaminoglycane sécrété dans le milieu de différenciation au cours des dernières 24 heures de culture avant la récolte au jour 28 a été mesuré à l’aide du dosage DMMB. Le protocole de dosage DMMB a été adapté de la méthode de Farndale et al., 1986 comme suit46 : (i) la solution de colorant DMMB a été préparée en ajoutant 3.04 g de glycine, 2,37 g de NaCl et 16 mg de 1,9 DMMB à 1 litre d’eau désionisée; (ii) le pH a été ajusté à 3,0 avec de l’acide chlorhydrique et la solution de colorant a été stockée dans une bouteille brune; (iii) 50 µl d’aliquotes de milieu de culture récoltées dans les échafaudages ensemencés au jour 28 ont été ajoutés en triplicate dans une plaque à 96 puits; (iv) 200 µl de solution de colorant DMMB ont été ajoutés au milieu de culture et l’absorbance a été évaluée à 540 nm immédiatement. Le sulfate de chondroïtine (CS) du cartilage de requin (Sigma) a été utilisé pour fournir une courbe standard d’absorbance (0-40 µg/ml, CS) à partir de laquelle la teneur en GAG dans les échantillons de milieu de culture a été calculée. Les niveaux d’absorbance de la teneur en GAG dans les échantillons de milieu de culture ont été normalisés pour tenir compte de l’absorbance de fond résultant de la présence de rouge de phénol dans le milieu en dissolvant les étalons dans le milieu DMEM. Pour l’adipogenèse, les cultures MSC ont été maintenues dans des milieux de culture contenant 1 µM DEX,0.5 mm de 3-isobutyl-méthylxanthine (Sigma), 1% d’insuline, de transferrine et de sélénium (pré-mélange ITS-X 100; PAA) et 100 µM d’indométacine (Sigma), pendant 28 jours à 37 °C et 5% de CO2, comme précédemment décrit47. Les cellules témoins ont été maintenues dans un milieu complet avec des supports. La différenciation a été examinée à l’aide d’une coloration Rouge à l’huile des gouttelettes lipidiques. Les cellules ont été fixées dans du formol tampon neutre à 10% pendant 1 heure après quoi la solution de coloration a été ajoutée. L’accumulation relative de Rouge O d’huile a été mesurée après traitement à 100% d’isopropanol pendant 15 minutes et lecture de l’absorbance du surnageant à 540 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.

MSC transplantation dans un modèle de défaut ostéochondral fémoral

Après un examen éthique et une approbation institutionnels (Les Comités Institutionnels de Soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Fukui, Département d’Orthopédie et de Médecine de réadaptation: Numéro d’approbation 25-053), rats nus athymiques femelles (F344 / N Jcl rnu / rnu, CLEA Japan, Inc. Tokyo, Japon) âgés de 6 à 10 semaines et pesant 150 à 170 grammes ont été répartis au hasard dans les groupes suivants: (i) MSCs PA (n = 6 animaux); (ii) MSCs CD271 + (n = 6 animaux); (iii) un groupe témoin d’échafaudage de bouclier Alpha Chondro seul (pas de cellules, n = 3 animaux). Ces nombres d’animaux par groupe ont déjà été utilisés au même institut pour démontrer des différences significatives entre les groupes de traitement au niveau de 5 %48. Les rats ont été anesthésiés par exposition à 3% d’isoflurane dans le gaz O2 et maintenus à 1,5% d’isoflurane dans le gaz O2 pendant la chirurgie. Après stérilisation des genoux à l’éthanol à 70%, une incision cutanée parapatellaire médiale a été pratiquée, suivie d’une dissection à travers le muscle, puis d’une exposition de l’articulation du genou par luxation latérale de la rotule. Des défauts ostéochondraux bilatéraux de 2 mm de diamètre et 1 mm de profondeur ont été créés dans la rainure rotulienne du fémur de chaque animal à l’aide d’une perceuse chirurgicale de 2 mm de diamètre. Le bouclier Alpha Chondro a été utilisé comme support / échafaudage de cellules pour délivrer des MSCs 5 × 104 PA ou des MSCs CD271 + contre aucune cellule (en tant que témoins). Avant la transplantation, les cellules ont été récoltées par trypsinisation et ensemencées dans un volume de 10 µl de milieu de culture standard sur des disques de 2 mm de diamètre de bouclier Alpha Chondro, puis incubées dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 30 minutes pour favoriser l’adhésion cellulaire et l’incorporation dans l’échafaudage. Les échafaudages ensemencés et de contrôle ont été transplantés dans les défauts et fixés en place avec de la colle de fibrine, qui a été laissée en place pendant environ 10 à 20 secondes (Fig. 6). La rotule a été déplacée et le tissu conjonctif et la peau ont été suturés avec des sutures en nylon. Les animaux ont été autorisés à se déplacer librement après la récupération et nourris avec un régime d’entretien standard et de l’eau ad libinum. 3 semaines après la transplantation, les animaux ont été sacrifiés par surdosage d’isoflurane à 3% pour examiner l’étendue de la réparation de la plaie macroscopiquement et histologiquement.

Notation macroscopique de la cicatrisation des plaies cartilagineuses

Après avoir exposé l’articulation du genou chez des animaux sacrifiés, le défaut a été noté macroscopiquement par deux chirurgiens qui ont été aveuglés au bras de traitement en utilisant un système établi pour évaluer la cicatrisation des plaies cartilagineuses dans des modèles animaux plus petits49. Le degré de réparation des tissus a été noté de 0 point (meilleur résultat) à 4 points (pire résultat) chacun pour: (1) la couleur du tissu réparateur; (2) l’étendue des vaisseaux sanguins observés dans le tissu réparateur; (3) la douceur de la surface du tissu réparateur; (4) la mesure dans laquelle le défaut de la plaie a été rempli de tissu réparateur; (5) l’étendue de la dégénérescence du cartilage articulaire adjacent. Les points marqués pour chaque critère ont été ajoutés et le degré de meilleure réparation a été représenté avec le score le plus bas sur un score total de 20.

Score histologique de la cicatrisation des plaies cartilagineuses

Après une excision chirurgicale, les genoux des animaux ont été fixés dans du formol tamponné neutre à 10% (Sigma) pendant 48 heures et placés dans une solution décalcifiante K-CX (FALMA, Tokyo, Japon) pendant 24 à 48 heures à 4 °C. Après cela, les genoux de rat ont été lavés pendant la nuit dans l’eau courante du robinet, traités et incorporés dans des blocs de cire de paraffine prêts à être sectionnés. Des coupes de tissus ont été découpées à 5 microns d’épaisseur dans un microtome rotatif standard et celles-ci ont été colorées avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) et du bleu de toluidine avant montage en DPX et examen histologique. L’étendue et la qualité de la réparation du cartilage ont été évaluées histologiquement et indépendamment par deux examinateurs à l’aide du système de notation Wakitani36, modifié pour inclure deux paramètres supplémentaires, à savoir: examiner la présence de vaisseaux sanguins et de cellules géantes de corps étrangers (FBGCs). Par conséquent, le système de notation comprend sept paramètres différents: (1) la morphologie cellulaire; (2) la coloration de la matrice; (3) la régularité de la surface; (4) l’épaisseur du cartilage; (5) l’intégration du tissu réparateur avec le cartilage de l’hôte; (6) l’étendue de la vascularisation dans le défaut; (7) l’étendue de la réaction FBGC. Pour chacun de ces paramètres, le score le plus bas (0) représentait la  » meilleure  » réparation et un score le plus élevé (4) représentait la « pire  » réparation. Les scores globaux ont été ajoutés puis comparés entre les groupes sur un score total de 21.

Immunohistochimie de l’antigène mitochondrial humain

Des coupes de tissus ont été colorées avec un anticorps anti-antigène mitochondrial humain (HMA) (Clone 113-1: Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) pour évaluer la présence de CSM humaines. Après la récupération de l’antigène, les sections ont été immergées dans trois changements de PBS et bloquées pendant 20 minutes avec du sérum de cheval à 2,5% (Vector Labs Ltd) à température ambiante pour empêcher une liaison non spécifique. Les coupes ont ensuite été incubées avec l’anticorps anti-HMA de souris (1:400 dilution dans du PBS) pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humidifiée. Après cela, tout anticorps non lié a été lavé doucement dans trois changements de PBS et les coupes ont été incubées avec des IgG anti-souris biotinylées pendant 30 minutes à température ambiante. Les coupes ont été lavées trois fois dans du PBS et l’activité peroxydée endogène a été bloquée à l’aide de peroxyde d’hydrogène à 0,3% dans du méthanol pendant 30 minutes à température ambiante. Au cours de cette étape d’incubation, le Vecta ABC regent (Vector Labs Ltd, Peterborough, Royaume-Uni) a été préparé et a été laissé au repos pendant 30 minutes avant utilisation conformément aux instructions du fabricant. Après blocage de l’activité peroxydée endogène, les coupes ont été lavées dans trois fois du PBS et incubées avec le réactif ABC pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, un chromogène DAB (Vector labs) a été ajouté pendant 6 à 8 minutes en fonction de l’intensité de la couleur souhaitée. Les sections ont ensuite été lavées et déshydratées par série d’éthanol (70-100%), nettoyées avec du xylène et montées dans du Pertex. Des granulés chondrogéniques de CSM humains ont été utilisés comme témoin positif. Le contrôle négatif comprenait des pastilles chondrogéniques où l’anticorps primaire était omis.

Microscopie électronique à balayage

L’adhérence des CSM ensemencés dans l’échafaudage du bouclier Alpha-Chondro avant l’implantation a été examinée par microscopie électronique à balayage (MEB) comme suit: après incubation des échafaudages ensemencés dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 30 minutes, ils ont été lavés dans du PBS puis fixés dans du glutaraldéhyde à 2% dans du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) pendant 2 heures, puis lavés en 0.Tampon phosphate de 1 M avant traitement avec du tétraoxyde d’osmium à 1% pendant 1 heure. Les échantillons ont ensuite été déshydratés à travers une série graduée de solution d’éthanol, traités avec un solvant de transition, de l’alcool t-butylique pendant 30 minutes, lyophilisés, enrobés de palladium d’or et finalement imagés à l’aide d’un microscope électronique à balayage JSM-6390 (JEOL, Tokyo, Japon) ou Zeiss EVO10 (Carl Zeiss, Cambridge, Royaume-Uni).

Coloration VIVANTE/MORTE pour mesurer la viabilité des cellules dans des échafaudages ensemencés dans des cellules

Les échafaudages ensemencés MSC ont été colorés avec une solution de coloration VIVANTE/MORTE suivant le protocole du fabricant, tel que décrit précédemment 8. Brièvement, les échafaudages ensemencés en cellules ont été immergés dans la solution de coloration VIVANTE/MORTE pendant 30 minutes dans l’obscurité à 37 °C. Les échafaudages ont ensuite été retirés de la solution de coloration, lavés au PBS et immédiatement imagés à l’aide d’un microscope confocal (Leica Microsystems DM6000B–SP57CS).

Essais d’angiogenèse in vitro

L’EA humaine.la lignée cellulaire endothéliale hy926 a été utilisée comme modèle pour examiner toute activité angiogénique du milieu conditionné par culture à partir de PA MSC et CD271 + MSC CM. EA.la prolifération/migration des cellules endothéliales hy926 et la formation des tubules endothéliaux ont été examinées comme suit: (i) EA.les cellules hy926 ont été cultivées dans un milieu de culture standard (DMEM/F-12 additionné de 10% de FBS, de 1% de pénicilline et de streptomycine) dans 24 plaques de puits pendant 2 jours jusqu’à formation de monocouches confluentes à 100%. Une pointe de pipette stérile a été utilisée pour faire une égratignure dans la monocouche. Par la suite, les puits ont été lavés avec du PBS stérile, puis 1 ml de milieu conditionné provenant de cultures MSC PA ou de cultures MSC CD271 + a été ajouté dans chacun des puits triplicatés par condition testée. Le milieu de culture DMEM sans sérum a été utilisé comme témoin. La plaque a été incubée dans la plate-forme Cell IQ pour l’imagerie numérisée de cellules vivantes sur une période de 2 jours, après quoi la fermeture de la plaie à gratter, le nombre de cellules viables et l’étendue de la migration des cellules individuelles ont été quantifiés à l’aide du logiciel d’analyse d’images Cell IQ. La réponse proliférative de l’EA.les cellules endothéliales hy926 en milieu conditionné PA MSC et CD271 + MSC (par rapport au milieu témoin sans sérum) ont également été examinées à l’aide du test MTT; (ii) EA.la formation de tubules endothéliaux hy926 a été testée à l’aide de Matrigel à facteur de croissance réduit (BD Bioscience), qui a été aliquoté en plaques à 96 puits (50 µl de Matrigel/puits) puis incubé pendant 30 min à 37 °C EA.des cellules endothéliales hy926 ont été ensemencées sur le Matrigel à 2 × 104 cellules/puits dans 200 µl de milieu conditionné PA MSC et CD271+ MSC ou de milieu de culture témoin sans sérum. Les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 1 jour, après quoi elles ont été imagées à l’aide de la plateforme d’imagerie Cell IQ (3 images par puits). La longueur totale/ image du tubule endothélial et le nombre total de points de ramification / image du tubule endothélial ont été mesurés à l’aide du logiciel d’analyse d’images Cell IQ.

Analyse statistique

L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du logiciel GraphPad Prism6 (GraphPad Software, Inc. CA, États-Unis). Pour les expériences in vivo, un minimum de n = 3 animaux par condition ont été testés. Pour les expériences in vitro, n = 3-4 expériences indépendantes ont été réalisées pour toutes les analyses, où les données ont été analysées avec une ANOVA unidirectionnelle lorsqu’il y avait un facteur variable, et une ANOVA bidirectionnelle lorsqu’il y avait deux facteurs variables. Pour les scores macroscopiques et histologiques de réparation du cartilage, les différences entre les groupes ont été examinées à l’aide des tests de comparaison multiples de Dunn. Une valeur de p inférieure à 0,05 a été considérée comme significative. Toutes les données ont été présentées sous forme de moyennes ± SEMs ou de moyennes ± SDs (comme indiqué dans les légendes de la figure).