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고립과 문화의 플라스틱 부착 MSCs 및 CD271immunopositive MSCs 에서 지방 조직

다음과 같은 윤리적 승인을에서 국민건강 서비스(NHS)건강 연구 기관(LREC 번호 12/EE/0136)및 동의에서는 모든 기부자,PA MSCs 및 CD271+MSCs 연에서는 수확했으로 수술을 낭비 제품입니다. 에서 다진 및 처리 하였다 0.20%(브이/브이)태아 종아리 혈청 및 1%(브이/브이)페니실린 및 스트렙토마이신을 보충한 둘베코의 변형된 독수리 배지를 첨가한 후,소화된 제제를 600 그램에서 10 분 동안 원심분리하였다. 본 발명에 따른 펠렛은 페니실린과 스트렙토마이신,즉 표준 배양 배지를 10%보충하고,100 개의 세포 스트레이너를 통과시켰다. 상기 여과액을 600 그램에서 10 분간 재원심분리하고,5 밀리리터의 표준 배양 배지에서 펠렛화된 세포를 재-현탁시키고,40 밀리리터의 세포 여과기를 통과시켰다. 생성 된 세포 현탁액을 실온에서 10 분 동안 적혈구 용해 완충액(밀 테니 생명 공학,써리,영국)으로 처리 하였다. 준비시 각각에 대해,적혈구 용해 후 존재하는 단핵 세포로부터 조직 배양 플라스틱에 대한 증가 된 접착력을 통해 또는 자기 관련 세포 분류에 의해 분리되었다. 이러한 세포 문화 80%합류에 트립 시니 화에 의해 일상적인 계기와 37 에서 가습 된 분위기에서 표준 배양 배지에서 확장 했다. 모든 후속 실험에 사용되었다. 유동 세포 계측법은 신선하게 분리 된 세포가 분리 후 밤새 -80 에서 저장되고,해동되고 즉시 면역 보유되었다;모든 샘플에 대해,이 시점에서 세포의 90%가 면역 양성이었다(데이터는 도시되지 않음).271+엽 줄기 세포가 골 세포,연골 세포 및 지방 세포를 형성하기위한 분화 능력은 이전에 설명 된 바와 같이 평가되었다 8,45. 간단한 골,단층 문화의 MSCs 으로 처리하 10nM dexamethasone,50ng/ml 아스코르브산과 1mM 베타 글리세(대 캐리어트)모든 2~3 일 동안의 기간 동안 4 주 후에는 문화를 수확 했에 의해 고정 및 얼룩진 알칼리인산화효소 활동은 다음과 같이 세포로 수정되었 10%중립 버퍼 포르말린 대해 10 분. 한편,염색 용액은 25 밀리그램의 나프톨-인산염(나프톨-인산염:시그마)을 0.5 밀리리터의 디메틸 포름 아미드에 넣음으로써 제조되었다. 이 용액은 50 밀리리터의 0.2 밀리리터의 트리스-히치클록 완충액 함유 50 밀리리터의 빠른 레드 트로(시그마)과 혼합되었다. 잘 혼합 한 후,최종 용액을 와트 만 1 호 여과지(와트 만)를 사용하여 여과 하였다. 마지막으로 얼룩을 제거하고 디지털화 된 이미지를 역 현미경으로 캡처했습니다. 시판 키트(바이오 비전,미국)를 사용 하 여 미분화 된 세포에 비해 차별화 된 셀에서 알카라인 포스파타제 활동의 증가 금액 및 제조 업체의 프로토콜;에 따라 추가 평가 되었다 골 형성 계보를 따라 차별화 간단 하 게,셀 분석 결과 버퍼에 균질화 했다. 이어서,균질화된 세포를 원심분리하여 3 분 동안 13,000 그램에서 불용성 물질을 제거하였다. 그런 다음 각 샘플 중 80 개를 96 웰 플레이트의 개별 웰에 적재했습니다. 50µl of5mM 의 pNPP 솔루션 각 샘플에 추가 되었습니다. 위 아래로 피펫팅하여 혼합 단계에 이어,우물을 60 분 동안 25 제곱미터에서 배양하였다. 160 개의 분석 완충액으로 40 개의 분석 완충액을 희석하여 1 밀리미터의 분석 완충액을 생성함으로써 표준 곡선이 생성되었다. 그 후,이 표준 용액의 0,4,6,12,16 및 20 을 96 웰 플레이트에 적재하여 분광 광도계로 측정 할 수있는 0-20 개의 표준을 생성 하였다. 연골 생성을 위해,세포 펠릿을 100 나노 덱사메타손(덱스)으로 보충 된 디멤/고 포도당(시그마)에서 제조 하였다,37.2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 대조 배양 물은 담체 단독,즉 메탄올,멸균 수 및 적절한 희석에서 고 포도당 배지로 처리 하였다.물,메탄올,메탄올,메탄올,메탄올,메탄올,메탄올,메탄올,메탄올,메탄올. 28 일째에,펠렛을 10%중성 완충 포르말린에 고정시킨 다음 파라핀에 임베딩하고 프로테오글리칸 합성 8 의 마커로서 톨루이딘 블루(시그마)로 염색 된 조직 섹션을 절단함으로써 연골 분화를 조직 학적으로 조사 하였다. 또한,28 일에 수확 하기 전에 문화의 마지막 24 시간에 차별화 매체로 분 비 하는 글리코사미노글리칸의 수준을 사용 하 여 측정 했다. 이 분석 프로토콜은 판데일 등의 방법으로부터 적응되었다. 1986 년,다음과 같이 46:(1)디엠엠비 염료 용액 3 을 첨가하여 제조하였다.(2)28 일째에 세포 시드 스캐 폴드에서 채취 한 배양 배지를 96 웰 플레이트에 3 중으로 첨가 한 후,(2)200 염료액을 배지에 첨가하고 흡수도를 1.0 으로 조절하여 물 1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,1.5 리터,즉시 540 나노에서 평가. 상어 연골(시그마)에서 콘드로이틴 황산염(시그마)을 사용하여 배양기의 샘플에서 개그 함량을 계산 한 표준 흡광도 곡선(0-40 그램/밀리리터,연사)을 제공했습니다. 배양기의 샘플에서 개 그 내용에 대 한 흡광도 수준 배양기에서 표준 용 해 하 여 매체 내에서 페 놀 레드의 존재에서 결과 배경 흡광도에 대 한 계정을 정규화 했다. 지방 생성을 위해,석사 배양은 1,000,000 덱스,0 을 포함하는 배양 배지에서 유지되었다.2015 년 12 월 15 일-2015 년 12 월 15 일-2015 년 12 월 15 일-2015 년 12 월 15 일-2015 년 12 월 15 일-2015 년 12 월 15 일-2015 년 12 월 15 일-2015 년 12 월 15 일-2015 년 12 월 15 일-2015 년 12 월 15 일-2015 년 12 월 15 일-2015 년 12 월 15 일-2015 년 제어 셀 캐리어와 완전 한 미디어에서 유지 했다. 분화 오일 레드 오 지질 방울의 염색을 사용 하 여 조사 했다. 세포를 10%중성 완충 포르말린에 고정시킨 후 1 시간 동안 염색 용액을 첨가 하였다. 상대 오일 적색 축적을 100%이소프로판올로 15 분간 처리한 후 분광광도계를 사용하여 540 나노미터에서 상청액의 흡광도를 판독한 후 측정하였다.대퇴골 골연골 결손 모델 이식(후쿠이대학 정형외과 재활의학과 기관동물보호 및 이용위원회 승인번호 25-053),대퇴골 골연골 결손 모델 이식(대퇴골 골연골 결손 모델 이식),대퇴골 골연골 결손 모델 이식(대퇴골 골연골 결손 모델 이식),대퇴골 골연골 결손 모델 이식(대퇴골 골연골 결손 모델 이식),대퇴골 골연골 결손 모델 이식(대퇴골 골연골 결손 모델 이식),대퇴골 골연골 결손 모델 이식(대퇴골 골연골 결손 모델 이식),대퇴골 골연골 결손 모델 이식(대퇴골 골연골 결손 모델 이식),대퇴골 골연골 결손 모델 이식 6-10 주 및 150-170 그램의 무게를 가진 일본 도쿄)는 다음 그룹으로 무작위로 할당되었습니다:(1)펜실바니아 중간체(엔=6 동물);(2)시디 271+중간체(엔=6 동물);(3)알파 콘드로 실드 스캐 폴드 단독의 대조군(세포 없음,엔=3 동물). 그룹 당 동물의 이 수는 동일한 연구소에 5%수준에 처리 그룹 사이 뜻깊은 다름을 설명하기 위하여 이전에 사용되었습니다 48. 쥐는 산소 가스에 있는 3%이소플루란에 노출에 의해 마취되고 수술 도중 산소 가스에 있는 1.5%이소플루란에 유지되었습니다. 70%에탄올을 사용하여 무릎을 멸균 한 후,내측 부분 피부 절개를 한 다음 근육을 통해 해부 한 다음 슬개골의 측면 탈구에 의해 무릎 관절을 노출 시켰습니다. 2 밀리미터 직경의 수술 드릴을 사용하여 각 동물의 대퇴골의 슬개골 홈에 2 밀리미터 직경 및 1 밀리미터 깊이의 양측 골 연골 결손이 생성되었다. Alpha Chondro 막으로 사용되었 셀 carrier/비계 제 5×104PA MSCs 또는 CD271+MSCs 대지 않는 세포는(컨트롤). 이식 전에,세포를 트립신화에 의해 수확하고,알파 콘드로 방패의 2 밀리미터 직경 디스크에 표준 배양 배지의 10 의 부피에서 시드 한 후,37 에서 가습 된 대기에서 배양 30 분 동안 5%의 이산화탄소는 세포 부착 및 스캐 폴드에 혼합을 촉진한다. 세포 시드 및 제어 스캐 폴드를 결함에 이식하고 피브린 접착제로 제자리에 고정 시켰으며,이는 약 10-20 초 동안 설정할 수있었습니다(그림 2). 6). 슬개골을 재배치하고 결합 조직과 피부를 나일론 봉합사로 봉합했습니다. 동물은 회복 후 자유롭게 움직일 수 있었고 표준 유지 관리 식단과 물 아드 리비눔을 먹였습니다. 이식 후 3 주에,거시적 및 조직 학적으로 상처 복구의 정도를 검사하기 위해 3%이소 플루 란의 과다 복용으로 동물을 희생시켰다.골연골 결손에 대한 이식 시술.이 시술은 골연골 결손에 대한 이식 시술입니다.골연골 결손에 대한 이식 시술.골연골 결손에 대한 이식 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술.골연골 결손 시술. 비계 2 밀리미터 직경 크기의 디스크로 절단 하 고 셀 시드 전에 자외선을 사용 하 여 살 균 했다. 알파 콘드로 실드 스캐 폴드에 트립시니즘을 하여 10 부피의 간단한 피펫팅 기술을 사용하여 시드하였다. 그 후,세포 시드 발판 결함에 이식 하 고 섬유 소 접착제를 사용 하 여 장소에 고정 했다.희생 동물에 무릎 관절을 노출 한 후,결함은 작은 동물 모델에서 연골 상처 치유의 평가를위한 확립 된 시스템을 사용하여 치료 팔에 눈을 멀게 한 두 명의 외과 의사에 의해 거시적으로 득점되었습니다 49. 조직 수선의 정도는 0 점(제일 결과)에서 4 점(가장 나쁜 결과)에 각각을 위해 득점되었습니다:(1)수선 조직의 색깔;(2)수선 조직 안에 보이는 혈관의 넓이; (3)수리 조직의 표면의 평활성;(4)상처 결함이 수리 조직으로 채워지는 정도;(5)인접한 관절 연골의 퇴행 정도. 각 기준에 대한 점수 점수가 추가되었고 최상의 수리 정도는 총 점수 20 에서 가장 낮은 점수로 표시되었습니다.수술 적 절제 후,동물 무릎을 10%중성 완충 포르말린(시그마)에서 48 시간 동안 고정시키고,24-48 시간 동안 24-48 시간 동안 탈 석회화 용액(팔마,도쿄,일본)에 배치 하였다. 이 후,쥐 무릎 물 실행에서 하룻밤 세척 했다,처리 및 절편 준비가 파라핀 왁 스 블록에 포함. 조직 섹션을 표준 회전 마이크로톰에서 5 미크론 두께로 절단하고,이들은 헤마 톡실린 및 에오신으로 염색 하였다. 연골 복구의 정도와 품질은 와키 타니 채점 시스템 36 을 사용하여 두 명의 심사관이 조직 학적으로 독립적으로 평가했으며 두 개의 추가 매개 변수를 포함하도록 수정했습니다. 혈관 및 이물질 거대 세포의 존재를 검사합니다. 따라서,7 개의 다른 매개 변수로 구성 된 채 점 시스템:(1)세포 형태학;(2)매트릭스 염색;(3)표면 규칙;(4)연골;의 두께(5)호스트 연골;와 복구 조직의 통합(6)결함;내 혈관 화의 정도(7)혈관 반응의 정도. 이러한 각 매개 변수에 대해 가장 낮은 점수(0)는’최상의’수리를 나타내고 가장 높은 점수(4)는’최악의’수리를 나타냅니다. 전체 점수를 추가 한 다음 총 점수 21 에서 그룹간에 비교했습니다.인간 미토콘드리아 항원에 대한 면역조직화학은 항인간 미토콘드리아 항원 항체로 염색되었다. 항 원 검색 다음 섹션 3 개의 변화에 침지 했다 고 20 분 동안 차단 2.5%말 혈 청(벡터 연구소 회사)실 온에서 비특이적 바인딩을 방지 하기 위해. 그런 다음 마우스 항 바이러스 항체(1)와 함께 섹션을 배양 하였다:가습 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 희석 하였다. 이 후,결합되지 않은 항체를 3 번의 변경으로 부드럽게 세척하고,섹션들을 실온에서 30 분 동안 바이오티닐화 안티마우스 이그그와 함께 배양하였다. 섹션 3 회 세척 하 고 내인성 과산화 활성 실 온에서 30 분 동안 메탄올에서 0.3%과산화 수소를 사용 하 여 차단 했다. 이 인큐베이션 단계 동안 벡터 알파벳 리젠트(벡터 연구소(주),피터 버러,영국)는 제조 업체의 지침에 따라 사용하기 전에 30 분 동안 방치 할 수있었습니다. 내인성 과산화 활성을 차단 한 후,섹션을 세 번 씻어 내고 상온에서 30 분 동안 알파벳 시약으로 배양 하였다. 이 후 원하는 색상의 강도에 따라 6-8 분 동안 소량의 색소체(벡터 실험실)를 추가했습니다. 그런 다음 일련의 에탄올(70-100%)을 통해 섹션을 세척 및 탈수하고 크실렌으로 제거하고 페르 텍스에 장착했습니다. 인간 중간 엽 줄기 세포의 연골 펠 릿 긍정적인 컨트롤로 사용 되었다. 음성 대조군에는 1 차 항체가 생략 된 연골 펠렛이 포함되었습니다.세포 시드 스캐 폴드가 가습 된 분위기에서 배양 된 후 30 분 동안 5%의 이산화탄소를 37 분 동안 배양 한 후 2 시간 동안 2%의 글루 타르 알데히드로 고정시킨 다음 0 에서 세척 하였다.1 시간 동안 1%사산화 오스뮴으로 처리하기 전에 1 미터 인산염 완충액. 그런 다음 샘플을 등급이 매겨진 일련의 에탄올 용액을 통해 탈수시키고,전이 용매,티-부틸 알콜로 30 분 동안 처리하고,동결 건조시키고,금 팔라듐으로 코팅하고,최종적으로 주사 전자 현미경(칼 자이스,캠브리지,영국)을 사용하여 이미지화 하였다.세포 시드 스캐 폴드에서 세포 생존 능력을 분석하기 위해 라이브/데드 염색 이전에 설명 된 바와 같이 석사 시드 스캐 폴드는 제조업체의 프로토콜에 따라 라이브/데드 염색 용액으로 염색되었습니다. 간략 하 게,세포 시드 스캐 폴드를 라이브/죽은 염색 용액에 30 분 동안 어둠 속에서 37 에서 침지 했다.체외 혈관 신생 분석실험배양된 배지의 혈관 신생 활성을 검사 하는 모델로 사용 되었다. 에아내피 세포 증식/이동 및 내피 세뇨관 형성을 다음과 같이 조사 하였다.100%합류성 단층이 형성될 때까지 2 일 동안 24 개의 웰 플레이트에서 표준 배양 배지에서 배양하였다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 단층에 스크래치를 만들었습니다. 그 후,우물을 멸균 피보나스로 세척한 후,1 밀리리터의 조건 배지로부터 조절된 배지를 시험된 조건당 각각의 삼중 웰에 첨가하였다. 무청 드미엠 배양 배지를 대조군으로 사용하였다. 플레이트 스크래치 상처 폐쇄,실행 가능한 셀 번호 및 개별 셀의 마이그레이션의 정도 셀 지능 지수 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 정량화 했다 후 2 일 동안 라이브 셀 디지털화 이미징에 대 한 셀 지능 지수 플랫폼에서 배양 했다. 의 증식 반응.또한,내피세포는 무혈청 대조배지(무혈청 대조배지)를 사용하여 검사하였다.hy926 내피 관성 테스트를 사용하여 성장인자-감 마트리겔(BD Bioscience),는 aliquoted 로 96-well 플레이트(50µl 마트리겔/라)및 다음을 배양에 대한 30 분 37°C.EA.hy926 내피세포를 씨를 뿌리에 마트리겔에서 2×104 세포/에서 잘 200µl PA MSC 및 CD271+MSC 컨 미디어이나 혈청 제어 문화의 매체입니다. 1 일 동안 37 개의 판에서 배양 한 후 세포 지능 지수 이미징 플랫폼(웰 당 3 개의 이미지)을 사용하여 이미지화 하였다. 총 내피 세뇨관 길이/이미지 및 총 내피 세뇨관 분기점/이미지 수는 세포 지능 지수 이미지 분석기 소프트웨어를 사용하여 측정되었습니다.통계적 분석은 그래프 패드 프리즘 6 소프트웨어(그래프 패드 소프트웨어)를 사용하여 수행되었다. 캘리포니아,미국). 생체 내 실험을 위해 최소 엔=조건 당 3 마리의 동물을 테스트했습니다. 시험 관내 실험에 대 한 엔=3-4 독립적인 실험을 수행 했다 모든 분석에 대 한 데이터 분석 했다 단방향 분산 분석 때 하나의 변수 요인,그리고 두 가지 변수 요인이 있을 때 양방향 분산 분석. 연골 복구의 거시적 및 조직 학적 점수에 대 한 그룹 간의 차이 던 여러 비교 테스트를 사용 하 여 조사 했다. 0.05 보다 작은 피 값이 중요한 것으로 간주되었습니다. 모든 데이터는 다음과 같이 표시되었습니다.