kasvimateriaalit ja kasvuolosuhteet

luonnonvaraiset ja mutanttikasvit, joita käytettiin tässä tutkimuksessa, kuuluivat kaikki Col-0-ekotyyppeihin, poikkeuksena RGA-GFP–RGA-linjat10, jotka kuuluivat ler-ekotyyppiin. phyB-9-siemeniä 31 saatiin Arabidopsis Biological Resource Centrestä. PIF4 overexpresser-linjat ja pif4 knockout-mutaatiot (slr2-mutantti) olivat ref. 3. Tupla-pif4 pif5-mutantit saatiin risteyttämällä pif4-101 T-DNA-insertioalleeli ja SALK-087012-mutantti18 sekä insertio PIF5-geeniin. P. Heddenin toimittamat 20ox-linjat, joissa on tyrmäävä T-DNA-lisäys AtGA20ox1-geeniin (At4g25420). GA-epäherkät gai-linjat ilmaisivat 35S-promoottorin hallinnassa olevan vakaan GAI-proteiinin. Kaksois-ja kolmoismutantteja syntyi risteyttämällä nämä linjat ja genotyypittämällä jälkeläiset PCR-monistuksella tai northern blot-analyyseillä.

siemenet pintasteriloitiin ja kylvettiin GM-agar-levyille ilman sukroseja32. Levyt kylmäkäsiteltiin 2 tunnin ajan 4 °C: ssa ja itävyys synkronoitiin 3 tunnin säteilytyksellä valkoiseen valoon ja sen jälkeen inkuboitiin pimeässä 22 tunnin ajan ennen siirtämistä eri kasvuolosuhteisiin. Valkokasvuiset taimet kasvatettiin 20 °C: ssa fluoresenssivalkoisessa valossa (fluenssinopeus 40-60 µmol m-2 s-1) 16 h: n vaalealla/ 8 h: n tummalla valoperiodilla. Punavalohoitoja varten taimet kasvatettiin jatkuvassa punaisessa valossa (LEDien tuottama fluenssinopeus 35 µmol m-2 s-1). Tummaksi kasvaneita taimia varten levyt käärittiin useisiin kerroksiin alumiinifoliota. Levyt asetettiin pystyasentoon ja skannattiin hypokotyylipituuksiksi ImageJ-ohjelmiston avulla (http://rsb.info.nih.gov/ij). PAC-hoitoa varten siemenet siirrettiin levyille inhibiittorin kanssa itämisen induktion jälkeen. Jokaista koesarjaa kohti mitattiin vähintään 20 tainta.

kasvien transformaatio

komplementaarinen DNA-fragmentti, mukaan lukien pif4: n täyspitkä ORF, monistettiin alkulähteillä PIF4-GFPf ja PIF4-GFPr, kloonattiin pENTR/D-TOPO-vektoriksi (Invitrogen) ja lisättiin pk7fwg2-binäärivektoriin (http://www.psb.ugent.be/gateway/) Lr-klonaasilla (Invitrogen). Tämä binäärirakenteinen konstruktio lisättiin Agrobacteriumin pgv3101-kantaan ja muutettiin villeiksi Col-0-ja phyB Arabidopsis-kasveiksi käyttäen kukkadipin muunnosmenetelmää33. Transformantit valittiin kanamysiiniä sisältävälle alustalle ja analysoitiin pif4–GFP-ydinfluoresenssin varalta. Vahvoille expressereille valikoitui homotsygoottisia linjoja.

GA -, PAC-ja MG132-käsittelyt

GA3 (GA) – ja paklobutratsolivarastot (PAC) valmistettiin juuri etanolissa. Proteasomin estäjä MG132 liuotettiin DMSO: han. Mg132-hoitoa varten taimia esikypsytettiin 2 tunnin ajan 100 µM: n inhibiittoriliuoksessa. PAC-ja GA-hoitojen pitoisuudet olivat 0, 1 µM ja 50 µM, ellei ilmoitettu. Herkkyys inhibiittorille laskettiin 0, 1 µM PAC: ssa kasvatetuilla taimilla havaitun hypokotyylipituuden vähenemisen käänteisenä suhteena Col-0-kasveissa havaittuun vähenemiseen (100%). Arvot ovat kolmen itsenäisen kokeen keskiarvo. GA-herkkyys laskettiin taimien hypokotyylipituuden kasvun suhteena 5,0 µM GA3: ssa ja viitattiin villityyppisiin Col-0-taimiin, kuten aiemminkin.

Hiivakaksihybridimääritykset

della-repressorit koodataan perunaan vähintään kahdella geenillä, joista ilmentyvän sekvenssitunnisteen TC113247 edustama transkriptio on runsaimmin ilmaistu kasvullisissa kudoksissa. Tämän della-proteiinin täysimittainen avoin lukukehys vahvistettiin alukkeilla FPG1 ja FPG2 ja lisättiin kehykseen GAL4-BD: n kanssa Pbridge-vektoriin (Clontech). Tähän täyspitkään rakenteeseen liittyvän autoaktivaation välttämiseksi GAL4-BD: hen fuusioidut n-end (jäämät 1-188), F1 (jäämät 1-362), M5 (jäämät 188-588) ja Cter (jäämät 362-588)-rakenteet saatiin mädättämällä SPEI-ja EcoRI-rajoituskohdissa. Plasmidit, jotka sisältävät näitä konstruktioita, tyhjän pBridge–vektorin (PGB) tai p53-GAL4BD-fuusion pgbkt7-vektorissa (ohjaus), muunnettiin ah109-hiivasoluiksi ja pinnoitettiin SD-Trp-ja SD-Trp-Ade-His-levyille basaalisen aktivaation testaamiseksi (täydentävä Kuva). 1). Hiivakannat, jotka sisälsivät F1 -, M5-tai Cter-konstruktiot, antoivat alhaisimman taustaaktiivisuuden ja niitä käytettiin syötteinä. Näitä konstruktioita sisältävät hiivasolut muunnettiin lehtiperunan komplementaarisella DNA-kirjastolla, joka fuusioitui gal4-AD: hen pAD-GAL4-vektorissa (Stratageeni) ja 1-3 × 106 itsenäistä transformanttia, jotka valittiin SD-Leu-Trp-Ade-His: llä positiiviseen vuorovaikutukseen.

täyspitkää Arabidopsis PIF4-proteiinia vastaava DNA-fragmentti syntyi PCR-monistuksessa alukkeilla PIF4yf ja PIF4yr ja työnnettiin hiivan Pgbkt7-ja pGADT7-vektorien EcoRI-kohtaan. Konstruktiot Arabidopsis PIF3-GAL4BD – ja PIF3–GAL4AD-fuusioille toimitti P. Quail.

Deleetiorakenteet della–ja PIF4–proteiineille saatiin käänteisellä PCR-reaktiolla RGA-BD-ja PIF4-AD-konstruktioille pBridge-ja pAD-GAL4-vektoreilla. Konstruktiot del1RGA ja del2RGA on luotu käyttämällä alukkeita RGAdel1 tai RGAdel2 ja pBridBam, jotka ottavat käyttöön BamHI-rajoituspaikan kummassakin päässä. Tuottaa konstruktioita del1PIF4, del2PIF4 ja del3PIF4, ainutlaatuinen XbaI sivusto pAD-GAL4 polylinker poistettiin fill-in. Tätä plasmidia käytettiin sitten mallina käänteisille PCR-reaktioille alukkeiden PIF4del1, PIF4del2 tai PIF4del3 ja pGADXba kanssa, jolloin kummassakin päässä oli xbai-rajoituspaikka. PCR-tuotteet sulatettiin joko Bamhilla tai Xbailla, uskonnoitui ja muuntui Escherichia coli-bakteeriksi eri konstruktioiden saamiseksi. Nämä plasmidit muunnettiin ah109-hiivakannaksi ja pinnoitettiin SD-4-levyille vuorovaikutuksen määritystä varten. β-galaktosidaasin aktiivisuus määritettiin näiden transformanttien nestemäisistä viljelmistä ONPG-substraatin ja standardiprotokollaolosuhteiden avulla.

perunan RGA M5-fragmenttia vastaavat rakenteet Arabidopsis DELLA-geenien RGA1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) ja RGL3 (At5g17490) osalta ovat syntyneet PCR-monistuksessa rgl1pgb-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r kanssa, rgapgb – F/Rgapgb-R ja Rgapgb-F/Gaipgb-R (täydentävä taulukko 1). Nämä fragmentit lisättiin hiivan pgbkt7-vektoriin käyttäen restriktientsyymejä BamHI/SalI rgl1: lle, SalI/Psti Rgl3: lle ja BamHI/psti rga1: lle ja GAI: lle.

Pull-down-määritykset

Arabidopsis RGA-täyspitkää proteiinia koodaava DNA-fragmentti saatiin PCR-vahvistuksella alukkeilla RGAgst-f ja RGAgst-r ja kloonattiin pzex-vektorin bamhi-kohtaan, jotta saatiin kehykseen fuusio GST-koodausalueen kanssa. RGA-pZEX ja tyhjä pZEX vektori muuntuivat E. coli-kannaksi BL21(DE3)pLysS (Stratageeni) ja näiden solujen viljelmät kasvatettiin 37 °C: ssa arvoon D600 = 0,8. GST-proteiinien ilmentyminen indusoitiin 1 mM: n IPTG: llä 3 tunnin ajan 30 °C: ssa, ja proteiinin uuttaminen ja sitoutuminen glutationi-Sefaroosihelmiin (Kloonitech) suoritettiin valmistajan toimittaman protokollan mukaisesti.

pgbkt7-vektorin pif4 -, PIF3-ja karboksipäätteisiä phyA-konstruktioita käytettiin malleina in vitro-transkriptiossa / translaatiossa 35S-metioniinin läsnä ollessa käyttäen TNT-järjestelmää (Promega). Jokaisessa reaktiossa käytettiin plasmidin DNA: ta (1 µg). Alasvetoa varten 10 µl translaatioreaktioita inkuboitiin 30 minuutin ajan RGA-GST-ja GST-helmillä (1 µg helmiin sitoutunutta proteiinia) PBS: ssä, 0, 05% tergitolia, 10% glyserolia. Helmet pestiin perusteellisesti, suspendoitiin uudelleen 2× kuormituspuskuriin ja analysoitiin SDS–Pagen avulla proteiinien sitoutumiseksi.

Transienttiekspressiomääritykset

ARABIDOPSIKSEN täyspituisia PIF4-ja RGA-proteiineja koodaavat DNA-fragmentit sekä ΔRGA-ja del1RGA-deleetiot saatiin PCR-amplifikaatiolla primer-pareilla PIF4yf ja PIF4yr, RGAGST-f ja RGAGST-r, ΔRGA-f ja RGAgast-r ja del1RGA-f ja rgagst-r, ja ne lisättiin polilynkeriin EcoRI tai BamHI pjit60-vektorin paikat 2×35s-promoottorin valvonnassa. Gel-shift assaysin ilmoittama G-box motif-fragmentti, joka on pif4: n tunnistamisen kohdeelementti 34, fuusioitiin Gus-reporter-geeniin ja sitä käytettiin reporter-konstruktiona. Emme pystyneet havaitsemaan pif4-välitteistä stimulaatiota tässä reportterirakenteessa, mikä viittaa siihen, että cacgtg-motiivia ympäröivät nukleotidisekvenssit saattavat olla tarpeen tehokkaaseen aktivointiin. Näissä määrityksissä käytettäväksi soveltuvan promoottorielementin löytämiseksi tehtiin alustavia RNA-profilointikokeita 35S-PIF4-ja pif4-mutanteilla, jolloin LTP3 (At5g59320) tunnistettiin voimakkaaksi yläsäädellyksi transkriptioksi 35S-PIF4-taimilla. Tämän geenin promoottori-alue monistettiin käyttämällä alukkeita LT3p-f ja LTP3p-r ja lisättiin Pgus-vektorin EcoRI-ja BamHI-kohtiin LTP3-GUS-reporterikonstruktion saamiseksi. Sisäisenä kontrollina käytettiin 2×35s-luciferaasifuusiota. Arabidopsis-solut levitettiin suodatinpaperille ja inkuboitiin yön yli lt87-alustalla (4,4 g L-1 Murashige-ja Skoogisuoloja + vitamiineja, 0,5 g l-1 MES, 0,5 g l-1 NAA, 30 g l-1 sakkaroosia, 8 g l-1 agaria). Kaksi tuntia ennen pommitusta suodattimet siirrettiin LT87-alustalle, jossa oli 200 mM mannitolia vakuolin takaisinvedon aikaansaamiseksi. DNA: n saostaminen ja hiukkaspommitus tehtiin heliumvetoisella hiukkaskiihdyttimellä (PDS-1000; Bio-Rad) valmistajan ohjeiden mukaan. Solut muunnettiin 0,5 µg: lla LTP3-GUS-reporteriplasmidia + 0,5 µg 2×35s-LUC-sisäisestä standardista ja joko 2 µg: lla pjit60-tyhjää vektoria (LTP3), 1 µg: lla 2×35s-PIF4-efektorikonstruktiota + 1 µg pjit60 (PIF4) tai 1 µg jokaista 2×35s-PIF4-ja 2×35s-RGA -, 2×35S-ΔRGA-tai 2×35S-del1rga efektorirakenteet (PIF4 + RGA, pif4 + δrga, pif4 + DEL1RGA). Suodattimet siirrettiin tuoreille LT87-levyille (- GA) tai LT87-levyille + 50 µM GA3 (+GA) ja inkuboitiin 16 tunnin ajan. solut uutettiin luciferaasin Määritysjärjestelmäpakettiin (Promega) sisältyvään solulyysipuskuriin ja puhdistettiin sentrifugoimalla 12 000 grammassa 5 minuutin ajan. LUC-aktiivisuus määritettiin fluorometrisellä määrityksellä 35 määritetyn kit-ja GUS-aktiivisuuden mukaisesti. LTP3-promoottorin aktiivisuus laskettiin kunkin näytteen GUS-ja LUC-aktiivisuuden suhteena. Jokaista käsittelyä varten käytettiin neljää replica-levyä.

RNA–uutot ja käänteiskopioijaentsyymi (RT)-PCR

geeniekspressioanalyyseissä kokonais-RNA uutettiin 4 päivän ikäisistä taimista guanidiini-HCl-menetelmällä 36 ja sen jälkeen käsiteltiin dnasei-valmisteella (Roche) ennen puhdistusta Qiagen RNeasy Mini colonnes (Qiagen) – menetelmällä. RNA: ta (1 µg) käytettiin ensimmäisen juosteen cDNA-synteesissä käyttäen korkean kapasiteetin cDNA-Arkistopakettia (Applied Biosystems) ja tästä reaktiosta 1,0 µl käytettiin mallina PCR-monistuksessa. Ltp3: n (At5g59320), β-expansinin (At2g20750) ja actin-8: n (at1g49240) transkriptien vahvistamiseen käytettiin pohjustussarjoja AtLTP3-f/AtLTP3-r, Atepan-f/Atepan-r ja Atactin8-f/Atactin8-r.

Bimolekulaarisen fluoresenssin komplementaation (BiFC) määritykset

kokopitkät avoimet lukukehysjaksot Arabidopsis PIF4-ja RGA-proteiineille monistettiin alukkeilla PIF4YFP-f/ PIF4YFP-r ja rgayfp-f / RGAYFP-r. PCR-tuotteet kloonattiin pENTR / D-TOPO-vektoriksi (Invitrogen) ja lisättiin LR-reaktiolla (Invitrogen) binäärisiin pbifc-vektoreihin (F. Parcy), joka sisältää eyfp – fluoresoivan proteiinin (eYFPN ja eYFPC) amino-tai C-terminaalisia fragmentteja. Kaikki kahdeksan mahdollista näiden konstruktioiden pairwise-yhdistelmää muuntuivat Agrobacterium tumefaciens-bakteereiksi ja tunkeutuivat yhdessä 2-3 viikkoa vanhojen Nicothiana benthamiana-kasvien abaksiaalipintaan kuvatulla tavalla 37. Tomaattipensastemppuviruksen P19-proteiinia käytettiin geenien hiljentämiseen. Agrobacterium-kannat, jotka sisälsivät pbifc:n konstruktiot ja P19:n hiljentävän plasmidin, olivat infiltraation osalta D600-suhteessa 0,7: 0,7: 1. Fluoresenssi visualisoitiin lehtien epidermaalisissa solukerroksissa 2 päivän infiltraation jälkeen Leica DMR-fluoresoivalla mikroskoopilla. Lehtiä inkuboitiin 1 µg ml-1 4′,6-diamidino-2-fenyyli-indolilla (DAPI) tumavärjäystä varten.

PIF4/RGA–GFP-ko-immunopresipitaatiot

RGA-ja PIF4-proteiinien Ko-immunopresipitaatiotutkimukset tehtiin 7 päivää vanhoilla RGA–GFP-RGA-siirtogeenisillä siemenillä10 kasvatettuna valkoisessa valossa. Taimet joko inkuboitiin pimeässä tai siirrettiin PAC: tä tai GA: ta sisältävään väliaineeseen ja inkuboitiin vielä 12 tuntia ennen uuttoa. GFP–RGA-proteiinin immunoprecipitaatio tehtiin 4 °C: ssa 6 tunnin ajan käyttäen anti-GFP-vasta-ainetta (Santa Cruzin biotekniikka) puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl: ää, pH 7, 5, 150 mM NaCl: ää, 0, 5% Triton X-100: aa, PMSF: ää (1 mM) ja proteaasinestäjiä (Sigma). Proteiini g-agaroosia (Sigma) käytettiin immunoproteiinikompleksien saostamiseen. PIF4 osoitettiin anti-PIF4-vasta-aineella.

kromatiini-immunoprecipitaatiot ja PCR-vahvistukset

kromatiini-immunoprecipitaatio määritykset tehtiin edellä kuvatulla tavalla 29. PIF4-HA-siemeniä20 kasvatettiin muuntogeenisellä kasvualustalla 6 päivän ajan jatkuvassa punaisessa valossa, minkä jälkeen ne siirrettiin joko GA: ta tai PAC: tä sisältäviin levyihin ja pidettiin yön yli pimeässä. Taimia (1,5-2 g) ja 40 µl anti-HA Affiniteettimatriisia (Roche) käytettiin kromatiinin immunoprecipitaatioon. Saostunut DNA liuotettiin 50 µl: aan TE: tä, ja 0,5 µl: aa käytettiin PCR-monistukseen käyttäen lisätaulukossa 1 lueteltuja alukkeita. PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 94 °C 2 min, 35 sykliä 94 °C 15 s, 55 °C 30 s ja 72 °C 30 s, minkä jälkeen 72 °C 7 min. Kvantitatiiviseen kontrolliin käytettiin sonikoitua tulo-DNA: ta (0,3%). Western blot-analyysit tehtiin kvantifioimaan talteen otetun PIF4-proteiinin määrä kromatiini-immunopresipitaation jälkeen. Blots immunodetected anti-HA peroksidaasi High Affinity vasta (Roche).

mikroskopia

proteiinien stabiilisuus määritykset tehtiin Radiance 2100 (Bio-Rad) – Laserkeilausjärjestelmällä, joka oli kytketty Zeiss Axiovert 200-mikroskooppiin. GFP: n ja klorofyllin viritykseen käytettiin vastaavasti argonionilaseria 488 nm: n aallonpituudella ja punaista diodia 637 nm: n aallonpituudella. Käytettävien suodattimien yhdistelmä oli: 560 dclpxr-säteenjakaja ja HQ 515/30-päästösuodatin GFP: lle ja HQ 660LP klorofyllin havaitsemiseen. Kuvat otettiin peräkkäin käyttäen LaserSharp v5.0-ohjelmistoa (Bio-Rad) ja yhdistettiin LaserPix v. 4-kuvaohjelmistoa (Bio-Rad).

Gel-shift-määritys

oligonukleotideja pLTP-WTf/r ja pLTP-MUTf / r käytettiin EMSA-määrityksissä käytettyjen LTP3-koettimien ja tiettyjen kilpailijoiden tuottamiseen. Oligonukleotidit hehkutettiin 5× M: n restriktioentsyymipuskurissa ja enderoitiin täyttämällä klenow. Proteiiniuutteiden osalta N. benthamianan lehdet infiltroituivat Agrobacterium-kantoihin 35S–PIF4-HA (PIF4) ja 35S–RGA-GFP (RGA) – konstruktioissa tai näiden kantojen 1:1-seoksella (PIF4 + RGA) ja edellä kuvatulla P19-konstruktiolla. Lehtiuutteet saatiin homogenoimalla korkeassa suolapuskurissa (20 mm HEPES, pH 7,9, 0,5 M KCL, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 0,5% nonidet P-40, 1 mM DTT, + proteaasinestäjä), puhdistamalla sentrifugoimalla ja myöhemmällä dialyysillä 1× BB (20 mm HEPES, pH 7,9, 0,1 M KCl, 1 mm EDTA, 0,05% nonidet P-40, 0,5 mM DTT, 10% glyserolia vastaan). Vastaavat määrät pif4-ja RGA-proteiineja uutteissa arvioitiin toteamalla western blot anti-HA (Roche) – ja anti-GFP (Santa Cruz) – vasta-aineilla. EMSA-reaktiossa käytettiin yhä suurempia määriä näitä uutteita (5.0, 10.0, 15.0 µl). Uutteita inkuboitiin 15 minuutin ajan huoneenlämmössä merkityllä näytteenottimella ja 100 ng poly (dI-dIC) 20 µl: ssa 1× BB ja erotettiin 6%: lla sivusta 0,5× TBE: ssä. Erityisessä kilpailussa käytettiin 100-kertaisesti villityyppisiä (WT) ja mutanttisia (MUT) hehkutettuja oligonukleotideja.