Los materiales vegetales y las condiciones de crecimiento

Las plantas de tipo silvestre y mutantes utilizadas en este estudio estaban todas en los ecotipos Col-0, con la excepción de las líneas RGA-GFP-RGA10, que estaban en el ecotipo Ler. Las semillas phyB-931 se obtuvieron del Centro de Recursos Biológicos Arabidopsis. Las líneas de sobreexpresor de PIF4 y las mutaciones knockout de pif4 (mutante slr2) fueron las descritas en la ref. 3. Los mutantes dobles pif4 pif5 se obtuvieron cruzando el alelo de inserción de ADN-T pif4-101 y el mutante SALK-08701218 con una inserción en el gen PIF5. P. Hedden proporcionó 20 líneas de adn T knockout en el gen AtGA20ox1 (At4g25420). Las líneas gai insensibles a GA expresaban la proteína GAI estable bajo control del promotor 35S. Se generaron mutantes dobles y triples cruzando estas líneas y genotipando a la descendencia por amplificación de PCR o análisis de blot norte.

Las semillas fueron esterilizadas en superficie y sembradas en placas de agar GM sin sucrosa32. Las placas se trataron en frío durante 2 d a 4 ° C y la germinación se sincronizó por 3 h de irradiación con luz blanca y posterior incubación en la oscuridad durante 22 h, antes de transferirse a las diferentes condiciones de crecimiento. Las plántulas cultivadas con luz blanca se cultivaron a 20 °C bajo luz blanca de fluorescencia (tasa de fluidez de 40-60 µmol m-2 s-1) con un fotoperiodo de 16 h claro/ 8 h oscuro. Para los tratamientos con luz roja, las plántulas se cultivaron bajo luz roja continua (tasa de fluencia de 35 µmol m-2 s-1 proporcionada por LED). Para las plántulas de crecimiento oscuro, los platos se envolvieron en varias capas de papel de aluminio. Las placas se colocaron en una orientación vertical y se escanearon para determinar la longitud del hipocótilo utilizando el software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). Para el tratamiento PAC, las semillas se transfirieron a placas con el inhibidor, después de la inducción de la germinación. Se midieron al menos 20 plántulas para cada conjunto de experimentos.

Transformación vegetal

Un fragmento de ADN complementario que incluía el ORF de longitud completa de PIF4 se amplificó con cebadores PIF4-GFPf y PIF4-GFPr, se clonó en el vector pENTR/D-TOPO (Invitrogen) y se insertó en el vector binario pK7FWG2 (http://www.psb.ugent.be/gateway/) con la clonasa LR (Invitrogen). Esta construcción binaria se introdujo en la cepa pGV3101 de Agrobacterium y se transformó en plantas silvestres Col-0 y Phyb Arabidopsis, utilizando el método de transformación por inmersión floral 33. Los transformantes se seleccionaron en un medio que contenía kanamicina y se analizaron para detectar fluorescencia nuclear PIF4-GFP. Se seleccionaron líneas homocigotas para expresadores fuertes.Los tratamientos

GA, PAC y MG132

Las reservas de GA3 (GA) y paclobutrazol (PAC) se prepararon recientemente en etanol. El inhibidor del proteasoma MG132 se disolvió en DMSO. Para el tratamiento con MG132, las plántulas se incubaron previamente durante 2 h en una solución de 100 µM del inhibidor. Los tratamientos PAC y GA se realizaron a 0,1 µM y 50 µM, respectivamente, a menos que estuviera indicado. La sensibilidad al inhibidor se calculó como la relación invertida de la reducción de la longitud del hipocótilo observada para plántulas cultivadas en PAC de 0,1 µM en relación con la reducción observada en plantas Col-0 (100%). Los valores son la media de tres experimentos independientes. La sensibilidad GA se calculó como la relación del aumento de la longitud de hipocótilo de las plántulas en 5,0 µM GA3 y se hizo referencia a plántulas Col-0 de tipo silvestre, como antes.

Los ensayos de dos híbridos de levadura

Los represores DELLA están codificados en la patata por al menos dos genes, siendo la transcripción representada por la etiqueta de secuencia expresada TC113247 la más abundantemente expresada en los tejidos vegetativos. El marco de lectura abierto de longitud completa para esta proteína DELLA se amplificó utilizando cebadores FPG1 y FPG2 y se insertó en el marco con el GAL4-BD en el vector de pBridge (Clontech). Para evitar la actividad de autoactivación asociada con esta construcción de longitud completa, se obtuvieron construcciones de extremo N (residuos 1 a 188), F1 (residuos 1 a 362), M5 (residuos 188 a 588) y Cter (residuos 362 a 588) fusionadas con el GAL4-BD mediante digestión en los sitios únicos de restricción de SpeI y EcoRI. Los plásmidos que contenían estas construcciones, el vector pBridge vacío (pGB) o una fusión p53–GAL4BD en el vector pGBKT7 (control) se transformaron en células de levadura AH109 y se platearon en placas SD-Trp y SD-Trp-Ade-His, para probar la activación basal (Suplemento Fig. 1). Las cepas de levadura que contenían las construcciones F1, M5 o Cter dieron la actividad de fondo más baja y se utilizaron como cebo. Las células de levadura que contenían estas construcciones se transformaron con una biblioteca de ADN complementario de patata de hoja fusionada con el GAL4-AD en el vector pAD-GAL4 (Estratageno) y transformantes independientes de 1-3 × 106 seleccionados en SD-Leu-Trp-Ade-His para una interacción positiva.

Se generó un fragmento de ADN correspondiente a la proteína de longitud completa Arabidopsis PIF4 mediante amplificación por PCR con cebadores PIF4yf y PIF4yr y se insertó en el sitio EcoRI de los vectores de levadura pGBKT7 y pGADT7. Las construcciones para las fusiones de Arabidopsis PIF3–GAL4BD y PIF3-GAL4AD fueron proporcionadas por P. Quail.

Los constructos de deleción para las proteínas DELLA y PIF4 se obtuvieron por reacción de PCR inversa en los constructos RGA-BD y PIF4-AD en los vectores pBridge y Pad-GAL4. Los constructos del1RGA y del2RGA se generaron utilizando cebadores RGAdel1 o RGAdel2 y pBridBam, que introducen un sitio de restricción BamHI en cada extremo. Para generar construcciones del1PIF4, del2PIF4 y del3PIF4, el sitio XbaI único en el polilinker pAD-GAL4 se eliminó por relleno. Este plásmido se utilizó como plantilla para reacciones de PCR inversa con cebadores PIF4del1, PIF4del2 o PIF4del3 y pGADXba, introduciendo un sitio de restricción XbaI en cada extremo. Los productos de PCR se digirieron con BamHI o XbaI, se religaron y se transformaron en Escherichia coli para obtener los diferentes constructos. Estos plásmidos se transformaron en la cepa de levadura AH109 y se platearon en placas SD-4 para evaluar la interacción. la actividad de la β-galactosidasa se determinó en cultivos líquidos de estos transformantes utilizando el sustrato ONPG y las condiciones del protocolo estándar.

Se generaron construcciones equivalentes al fragmento de patata RGA M5 para los genes Arabidopsis DELLA RGA1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) y RGL3 (At5g17490) mediante amplificación por PCR con los conjuntos de imprimación RGL1pGB-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r, RGApGB-f/RGApGB-r y RGApGB-f/GAIpGB – r (Cuadro complementario 1). Estos fragmentos se insertaron en el vector de levadura pGBKT7 utilizando las enzimas de restricción BamHI/SalI para RGL1, SalI/PstI para RGL3 y BamHI / PstI para RGA1 y GAI.

Ensayos desplegables

Se obtuvo un fragmento de ADN que codifica la proteína de longitud completa Arabidopsis RGA mediante amplificación por PCR con cebadores RGAgst-f y RGAgst-r y se clonó en el sitio BamHI del vector pZEX, para obtener una fusión en el marco con la región codificante de GST. El vector RGA-pZEX y el vector pzex vacío se transformaron en la cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS (Estratageno) y cultivos de estas células cultivadas a 37 °C a un D600 = 0,8. La expresión de las proteínas GST se indujo con 1 mM IPTG, durante 3 horas adicionales a 30 ° C, y la extracción y unión de proteínas a perlas de glutatión-Sefarosa (Clontech) se realizó de acuerdo con el protocolo suministrado por el fabricante.

Los constructos PIF4, PIF3 y phyA carboxi-terminal en el vector pGBKT7 se utilizaron como plantillas para la transcripción/traducción in vitro, en presencia de 35S-metionina, utilizando el sistema TnT (Promega). En cada reacción se utilizó ADN plásmido (1 µg). Para la extracción, se incubaron 10 µl de las reacciones de traslación durante 30 minutos con las perlas RGA–GST y GST (1 µg de proteína unida a las perlas) en PBS, 0,05% de tergitol, 10% de glicerol. Las perlas se lavaron a fondo, se resuspendieron en un tampón de carga de 2× y se analizaron por SDS–PAGE para la unión a proteínas.

Ensayos de expresión transitoria

Los fragmentos de ADN que codifican las proteínas PIF4 y RGA de longitud completa de Arabidopsis, y las deleciones ΔRGA y del1RGA se obtuvieron mediante amplificación por PCR con pares de cebadores PIF4yf y PIF4yr, RGAgst-f y RGAgst-r, ΔRGA-f y RGAgast-r y del1RGA-f y RGAgst-r, e insertados en el polinizador EcoRI o BamHI sitios del vector pJIT60, bajo el control del promotor 2×35S. Un fragmento de motivo de caja G reportado por ensayos de desplazamiento de gel como un elemento objetivo para reconocimiento de PIF434 se fusionó con el gen reportero GUS y se usó como construcción de reportero. No pudimos detectar la estimulación mediada por PIF4 de este constructo reportero, lo que indica que podrían requerirse secuencias de nucleótidos adicionales que rodean el motivo CACGTG para una activación eficiente. Para buscar un elemento promotor adecuado para ser utilizado en estos ensayos, se realizaron experimentos preliminares de perfilado de ARN de mutantes 35S-PIF4 y pif4, por lo que se identificó LTP3 (At5g59320) como una transcripción fuerte regulada al alza en plántulas 35S-PIF4. La región promotora de este gen se amplificó utilizando cebadores LT3p-f y LTP3p-r y se insertó en los sitios EcoRI y BamHI del vector de UGP para obtener la construcción del reportero LTP3-GUS. La fusión de 2×35S-luciferasa se utilizó como control interno. Las células de arabidopsis se esparcieron en papel de filtro y se incubaron durante la noche en medio LT87 (4,4 g l-1 Murashige y sales de Skoog + vitaminas, 0,5 g l-1 MES, 0,5 g l-1 NAA, 30 g l-1 sacarosa, 8 g l-1 agar). Dos horas antes del bombardeo, los filtros se transfirieron al medio LT87 con manitol de 200 mm para inducir la retracción de la vacuola. La precipitación de ADN y el bombardeo de partículas se realizaron utilizando un acelerador de partículas impulsado por helio (PDS-1000; Bio-Rad), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se transformaron con 0,5 µg del plásmido reportero LTP3-GUS + 0,5 µg del patrón interno 2×35S-LUC, y 2 µg del vector vacío pJIT60 (LTP3), 1 µg del constructo efector 2×35S-PIF4 + 1 µg pJIT60 (PIF4), o 1 µg de cada 2×35S-PIF4 y 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA o 2×35S-RGA, Construcciones efectoras del1RGA (PIF4 + RGA, PIF4 + ΔRGA, PIF4 + del1RGA). Los filtros se transfirieron a placas LT87 frescas (- GA) o a placas LT87 + 50 µM GA3 (+GA) y se incubaron durante 16 h. Las células se extrajeron en el tampón de lisis celular proporcionado en el kit del Sistema de Ensayo de Luciferasa (Promega) y se eliminaron mediante centrifugación a 12.000 g durante 5 min. La actividad de LUC se determinó de acuerdo con la actividad de kit y GUS determinada por ensayo fluorométrico35. La actividad promotora de LTP3 se calculó como la relación de actividad de GUS a LUC en cada muestra. Se utilizaron cuatro placas de réplica para cada tratamiento.

Extracciones de ARN y transcriptasa inversa (RT)–PCR

Para los análisis de expresión génica, el ARN total se extrajo de plántulas de 4 días de edad utilizando el método de guanidina-hcl36 y posteriormente se trató con DNaseI (Roche) antes de limpiarse a través de Qiagen RNeasy Mini columns (Qiagen). Se utilizó ARN (1 µg) para la síntesis de ADNc de primera hebra utilizando el Kit de Archivo de ADNc de Alta Capacidad (Applied Biosystems) y 1,0 µl de esta reacción se utilizó como plantilla para la amplificación de PCR. Para la amplificación de las transcripciones de LTP3 (At5g59320), β-expansina (At2g20750) y actina-8 (At1g49240) se utilizaron juegos de cebadores AtLTP3-f/AtLTP3-r, Atexpan-f/Atexpan-r y Atactin8-f/Atactin8-r.

Los ensayos de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC)

Las secuencias de marco de lectura abierto de longitud completa para las proteínas Arabidopsis PIF4 y RGA se amplificaron con cebadores PIF4YFP-f/ PIF4YFP-r y RGAYFP-f/ RGAYFP-r, respectivamente. Los productos de PCR se clonaron en el vector pENTR / D-TOPO (Invitrogen) y se insertaron por reacción LR (Invitrogen) en los vectores binarios pBiFC (F. Parcy) que contiene los fragmentos amino-o C-terminales de la proteína fluorescente eYFP (eYFPN y eYFPC). Las ocho combinaciones posibles de pares de estos constructos se transformaron en Agrobacterium tumefaciens y se infiltraron en la superficie abaxial de plantas Nicothiana benthamiana de 2-3 semanas de edad, tal como se describieron37. La proteína p19 de tomato bushy stunt virus se utilizó para suprimir el silenciamiento de genes. Las cepas de Agrobacterium que contenían los constructos pBiFC y el plásmido silenciador p19 tenían una relación D600 de 0,7:0,7:1 para infiltración. La fluorescencia se visualizó en capas de células epidérmicas de las hojas después de 2 días de infiltración, utilizando un microscopio fluorescente Leica DMR. Las hojas se incubaron con 1 µg ml-1 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción de núcleos.

Co–inmunoprecipitaciones de PIF4/RGA-GFP

Los estudios de co-inmunoprecipitación de las proteínas RGA y PIF4 se realizaron en semillas transgénicas RGA-GFP-RGA de 7 días de edad cultivadas bajo luz blanca. Las plántulas se incubaron en la oscuridad o se transfirieron a un medio que contenía PAC o GA y se incubaron durante 12 horas adicionales antes de la extracción. La inmunoprecipitación de la proteína GFP–RGA se realizó a 4 °C durante 6 h, utilizando un anticuerpo anti-GFP (Biotecnología de Santa Cruz) en un tampón que contenía Tris-HCl de 50 mM, pH 7,5, NaCl de 150 mM, Tritón X-100 al 0,5%, PMSF (1 mM) e inhibidores de proteasa (Sigma). Se utilizó agarosa de proteína G (Sigma) para precipitar los complejos de inmunoproteínas. La detección de PIF4 se realizó con un anticuerpo anti-PIF4.

Se realizaron inmunoprecipitaciones de cromatina y amplificaciones de PCR

Los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina se realizaron como se describió previamente29. Las semillas de PIF4-ha20 se cultivaron en medio GM durante 6 días bajo luz roja continua y luego se transfirieron a placas que contenían GA o PAC y se mantuvieron durante la noche en la oscuridad. Se utilizaron plántulas (1,5–2 g) y 40 µl de la Matriz de Afinidad anti-HA (Roche) para inmunoprecipitación con cromatina. El ADN precipitado se disolvió en 50 µl de TE, y se utilizó 0,5 µl para amplificación de PCR utilizando los cebadores enumerados en la Tabla Suplementaria 1. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 94 ° C durante 2 min, 35 ciclos de 94 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, seguidos de 72 °C durante 7 min. Se utilizó ADN de entrada sonicado (0,3%) para un control cuantitativo. Se realizaron análisis de Western blot para cuantificar la cantidad de proteína PIF4 recuperada después de la inmunoprecipitación con cromatina. Los blots se inmunodetectaron con un anticuerpo de Alta afinidad de la peroxidasa anti-HA (Roche).

Microscopía

Los ensayos de estabilidad de proteínas se realizaron utilizando el Sistema de Escaneo Láser Radiance 2100 (Bio-Rad) acoplado a un microscopio Zeiss Axiovert 200. Para la excitación de GFP y clorofila, se empleó un láser de iones de argón a una longitud de onda de 488 nm y un diodo rojo a 637 nm, respectivamente. La combinación de filtros utilizados fue: divisor de haz 560 DCLPXR y filtro de emisión HQ 515/30 para GFP, y HQ 660LP para detección de clorofila. Las imágenes se tomaron secuencialmente utilizando el software LaserSharp v5.0 (Bio-Rad) y se fusionaron utilizando el software de imágenes LaserPix v.4 (Bio-Rad).

Ensayo de cambio de gel

Los oligonucleótidos pLTP-WTf / r y pLTP-MUTf / r se utilizaron para generar las sondas LTP3 y competidores específicos utilizados en ensayos EMSA. Los oligonucleótidos se recocieron en un tampón enzimático de restricción de 5× M y se marcaron los extremos mediante relleno con Klenow. Para los extractos proteicos, N. las hojas de benthamiana se infiltraron con las cepas de Agrobacterium para los constructos 35S-PIF4–HA (PIF4) y 35S-RGA–GFP (RGA) o con una mezcla 1:1 (PIF4 + RGA) de estas cepas y con la construcción p19 como se describió anteriormente. Los extractos de hojas se obtuvieron por homogeneización en tampón alto en sal (HEPES de 20 mM, pH 7,9, 0,5 M KCl, EDTA de 1 mM, MgCl2 de 1 mM, 0,5% nonidet P-40, TDT de 1 mM, + inhibidor de proteasa), limpieza por centrifugación y diálisis posterior contra 1× BB (HEPES de 20 mM, pH 7,9, 0,1 M KCl, EDTA de 1 mM, 0,05% nonidet P-40, TDT de 0,5 mM, 10% glicerol). La presencia de cantidades equivalentes de proteínas PIF4 y RGA en los extractos se evaluó mediante la detección de western blot con anticuerpos anti-HA (Roche) y anti-GFP (Santa Cruz). Se utilizaron cantidades crecientes de estos extractos (5,0, 10,0, 15,0 µl) para la reacción a la EMSA. Los extractos se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con la sonda etiquetada y 100 ng de poli (dI-dIC) en 20 µl 1× BB y se separaron en 6% de PÁGINA en 0,5× TBE. Se utilizó un exceso de 100 veces de oligonucleótidos recocidos de tipo salvaje (WT) y mutantes (MUT) para una competencia específica.