La Unidad 731 fue creada específicamente por el ejército japonés en Harbin, China (entonces parte de Manchukuo ocupado por los japoneses) para investigar la guerra biológica y química mediante la experimentación humana en personas de todas las edades. Durante la Segunda Guerra Sino-Japonesa y más tarde la Segunda Guerra Mundial, los japoneses habían encerrado la peste bubónica, el cólera, la viruela, el botulismo, el ántrax y otras enfermedades en bombas, que se lanzaban rutinariamente sobre combatientes chinos y no combatientes. Según el Simposio Internacional sobre los Crímenes de Guerra Bacteriológica de 2002, el número de personas muertas por la guerra bacteriológica del Ejército Imperial Japonés y los experimentos con seres humanos fue de alrededor de 580.000.

Durante los primeros meses de la guerra contra los Estados Unidos tras el ataque a Pearl Harbor, Japón planeó usar armas biológicas contra los estadounidenses. Durante la campaña de Filipinas en marzo de 1942, los japoneses consideraron liberar 90 kg (200 libras) de pulgas portadoras de peste (alrededor de 150 millones de insectos) en cada uno de los diez ataques separados, pero los estadounidenses se rindieron en Bataan antes de que se implementara el plan. Alrededor de noviembre de 1944, Japón lanzó un total de 9.300 bombas incendiarias y antipersonales transportadas por globos que fueron diseñados para elevarse a 10.000 m (30.000 pies), y luego ser barridos hacia el este por la corriente en chorro a los Estados Unidos continentales. Mataron a seis civiles estadounidenses cerca de Bly, Oregón; se estrellaron contra una granja en Medford, Oregón; y causó un cortocircuito en las líneas eléctricas que suministran electricidad para las bombas de enfriamiento del reactor nuclear en la planta de producción del Proyecto Manhattan en el Sitio de Hanford en Washington. Un sistema de respaldo restableció la energía. Durante la Batalla de Iwo Jima, se consideró otro ataque biológico contra los invasores estadounidenses. El piloto Shoichi Matsumoto relató más tarde cómo se suponía que dos planeadores que transportaban patógenos debían ser remolcados sobre la batalla y liberados, pero los planeadores que se suponía que despegarían de Japón continental al aeródromo de Matsumoto en el distrito de Pingfang en preparación para el ataque nunca llegaron a su destino.