Die serielle Passage von Lungenmetastasen in vivo reichert das Metastasierungspotential an
Die PDX-Linie WU-BC3 wurde erzeugt, indem Brusttumorzellen von einer Patientin mit metastasiertem TNBC in die humanisierten Brustfettpolster (MFPs) einer Patientin mit metastasiertem TNBC in NICKEN / SCID Mäuse Mäuse.26,27 Diese Tumorzellen exprimierten stabil Click-Red-Luciferase (CBR-Luc), mCherry und eine für p53 (shA2) spezifische shRNA, um die PDX-Linie BC3_A2 (früher bekannt als BC3-p53KD28) zu erzeugen (Ergänzende Abb. 1a). Wir zeigten, dass Tumorzellen von MFPs zu physiologisch relevanten Stellen wie Lunge, Leber, Knochen, Gehirn und Lymphknoten metastasierten.28 Lungenmetastasen (P0) wurden aus replizierten Mäusen isoliert, gepoolt und in die MFPs von Empfängermäusen transplantiert. Die resultierenden Lungenmetastasen (P1) wurden isoliert, gepoolt und in die MFPs weiterer Mäuse transplantiert. Die Lungenmetastasen dieser Mäuse (P2) wurden ebenfalls gesammelt und gepoolt (Ergänzende Abb. 1b). Wir führten eine Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von Lungen, Knochen und Lebern bei der Nekropsie durch, um das relative Ausmaß der Metastasierung bei jeder Passage zu quantifizieren (Ergänzende Abb. 1c). Serielle Passage für Tumorzellen mit erhöhter Metastasierungsfähigkeit an alle Stellen (Ergänzende Abb. 1d-f, h) und verlangte, dass Mäuse früher eingeschläfert werden (Ergänzende Abb. 1i). Im Gegensatz dazu führten serielle passierende Tumoren zwischen MFPs nicht zu einer erhöhten Lungenmetastasierung (Ergänzende Abb. 1g), was darauf hindeutet, dass der Erwerb einer erhöhten Metastasierungskapazität nicht einfach eine Folge von seriell passierenden Tumoren in vivo war. Darüber hinaus zeigten Tumorzellen mit erhöhter metastatischer Kapazität keine signifikante Zunahme der Wachstumseigenschaften, wenn sie aus MFPs isoliert und wieder in die MFPs von Empfängermäusen platziert wurden (Ergänzende Abb. 1j). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die serielle Passage von Tumorzellen von der Lunge zu MFPs in diesem Modell das metastatische Potenzial anreichert, jedoch kein organspezifisches Homing.
Die mesenchymale Genexpression ist in Lungenmetastasen im Vergleich zu MFP-Tumoren reduziert
Um Veränderungen der Genexpressionsmuster zu identifizieren, die mit Metastasen einhergehen, führten wir eine RNA-Sequenzierung (RNAseq) an Lungenmetastasen (P0 und P2) und MFP (P0 und P2) -Tumoren durch (Abb. 1a und ergänzende Tabelle 1). Nach Subtraktion der RNAseq-Reads, die dem Maus-Transkriptom zugeordnet sind, wurden nur menschliche Transkript-Reads für Downstream-Analysen verwendet. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) ergab eine verminderte Diskordanz zwischen biologischen Replikaten mit wiederholter Passage in vivo, da biologische Replikate von P2-Tumorproben enger miteinander gruppiert waren als mit anderen analysierten Subpopulationen (Abb. 1b). Die Gensatzanreicherungsanalyse (GSEA) ergab, dass EMT sowohl bei P0- als auch bei P2-Lungenmetastasen im Vergleich zu MFP-Tumoren der am stärksten herunterregulierte Signalweg war (Abb. 1c). Die TGF-β-Signalisierung, die die EMT reguliert, wurde auch in P0- und P2-Lungenmetastasen signifikant herunterreguliert (Abb. 1c).
PDX-Lungenmetastasensignaturen identifizieren Gene, die in Metastasen dereguliert sind. eine schematische Darstellung von MPF-Tumoren und Lungenmetastasen, die für RNAseq isoliert wurden. b Hauptkomponentenanalysen (PCAs) aus RNAseq-Daten, die aus MFP-Tumoren und Lungenmetastasen generiert wurden, die in dieser Studie verwendet wurden. Jeder Datenpunkt repräsentiert eine Probe einer einzelnen Maus. c GSEA-Signalweganalyse zur angereicherten Lungenmetastasierungssignatur (P2); die Top 5 nach unten (blau)- und oben (rot)geregelten Prozesse werden angezeigt. NES, normalisierter Anreicherungswert. Felder geben FDR <0.1 für die statistische Signifikanz an. Anreicherungsdiagramme für den epithelialen mesenchymalen Übergang (EMT) und die TGF-β-Signalisierung für P0 und P2 sind im rechten Bereich dargestellt. p < 0,001 für EMT- und TGF-β-Signalisierung bei P0 und P2. d qRT-PCR-Analyse der Vimentin-Expression in BC3_A2-MFP-Tumoren und metastasierten Subpopulationen, die aus der Lunge isoliert wurden. Gepaarte t-Tests, p = 0,02 für P0-Lunge, p < 0,001 für P2-Lunge. Jeder Datenpunkt repräsentiert eine Maus. Fehlerbalken repräsentieren SEM biologischer Replikate. Siehe auch Ergänzende Fig. 2. an den angegebenen Gewebeschnitten wurde eine e-IHC-Färbung unter Verwendung eines Antikörpers durchgeführt, der die humanspezifische Form von Vimentin erkennt. Skalenbalken zeigen 100 µm an. f Wasserfalldiagramm, das die Expression von EMT-Genen in P0- und P2-Lungenmetastasen im Vergleich zu entsprechenden MFP-Tumoren zeigt. die p-Werte sind der ergänzenden Tabelle 1 zu entnehmen. Proben von mindestens drei unabhängigen Mäusen wurden für RNAseq-Analysen eingeschlossen
Quantitative Echtzeit (qRT-PCR) wurde durchgeführt, um die Expression von Vimentin, einem mesenchymalen Marker, in MFP-Tumoren und Lungenmetastasen während der seriellen Passage zu überwachen. Die Vimentin-Expression zeigte bei jeder Passage ein dynamisches Muster mit höherer Expression in MFP-Tumoren im Vergleich zu entsprechenden Lungenmetastasen (Abb. 1d) und zu Lebermetastasen bei P0 (Ergänzende Fig. 2a). Die Vimentin-Proteinspiegel rekapitulierten dieses dynamische Muster (Abb. 1e). Zusätzliche EMT-Gene wurden auch in Lungenmetastasen relativ zu entsprechenden MFP-Tumoren herunterreguliert (Abb. 1f). Die Expression des mesenchymalen Markers CDH2 (das für N-Cadherin kodierende Gen) folgte dem gleichen Muster wie Vimentin (Ergänzende Abb. 2b), während die Expression des epithelialen Markers CDH1 (das für E-Cadherin kodierende Gen) einen inversen Trend zeigte (Ergänzende Fig. 2c). Co-transplantierte humane Stromafibroblasten wurden zum Zeitpunkt der Tumorernte gelöscht (Ergänzende Abb. 3a-f), wobei ausgeschlossen wird, dass sie zur Expression mesenchymaler Marker in MFP-Tumoren beigetragen haben. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Tumore die Expression mesenchymaler Gene herunterregulieren, sobald sie in metastasierten Stellen etabliert sind.
Bestimmung der Bibliothekskomplexität für High Throughput Gain of Function Screen
Ein High Throughput Gain-of-Function (GOF) -Bildschirm wurde entwickelt, um funktionelle Treiber von Metastasen aus unserer P2-Lungenmetastasen-Signatur zu identifizieren. HOXA1, ein bekannter Treiber der Metastasierung,29 diente als Positivkontrolle für die Bildschirmoptimierung, und GFP wurde als Negativkontrolle verwendet. BC3_A2-Zellen wurden mit Lentivirus transduziert, das entweder HOXA1 oder GFP kodiert, und infizierte Tumorzellen wurden in verschiedenen Verhältnissen gemischt (Ergänzende Abb. 4a). Gemischte Populationen von Tumorzellen wurden dann in die MFPs von Empfängermäusen transplantiert, und BLI wurde verwendet, um Lungenmetastasen zum Zeitpunkt der Nekropsie zu bewerten (Ergänzende Abb. 4b). In einer zweiten Versuchsreihe wurde der metastatische Treiber ID19 in Kombination mit GFP verwendet, aber in diesem Fall wurden gemischte Populationen von Tumorzellen in die Schwanzvene von Empfängermäusen injiziert, um die Endstadien der Metastasierung zu modellieren (Ergänzende Abb. 4c). Ein signifikanter Anstieg des Photonenflusses wurde bei Tumoren mit einem HOXA1: GFP- oder ID1: GFP-Verhältnis von 1:10 beobachtet. Diese Komplexitätstests zeigten, dass ein Bona-Fide-Metastasen-Treiber in unserem Bildschirm erkannt werden konnte, wenn er mit 9 offenen Leserahmen (Non-Driver Open Reading Frames, ORFs) gepoolt wurde, aber ein Pool von einem Treiber mit 19 Nicht-Treibern maskierte unsere Fähigkeit, den Treiber zu erkennen. Basierend auf diesen Ergebnissen haben wir unsere Poolgröße auf 12 ORFs begrenzt.
High throughput Gain-of-function Screening in vivo identifies candidate functional drivers of TNBC metastasis
Um zu bestimmen, welche der hochregulierten Gene aus der P2-Lungenmetastasen-Signatur in der Lage waren, Lungenmetastasen anzutreiben, entwarfen wir benutzerdefinierte lentivirale Barcodebibliotheken, die das ORFs der 230 Gene kodieren, die bei Lungenmetastasen am stärksten hochreguliert waren. ORFs wurden einzeln in BC3_A2-Zellen exprimiert, so dass jede Zelllinie einen einzelnen ORF exprimierte, Zellen wurden dann in Gruppen von 12 gepoolt und Pools wurden in die MFPs von Empfängermäusen implantiert (n = 10 Mäuse pro Pool, Abb. 2a). Ein Kontrollplasmid, das GFP exprimiert, wurde in jeden Pool aufgenommen, um die intrinsische Metastasierung in diesem TNBC-Modell zu messen. Jeder ORF war mit einem eindeutigen DNA-Barcode verknüpft. Ein Referenzpellet aus gepoolten Zellen wurde eingefroren, um die gleiche Repräsentation jedes ORF zum Zeitpunkt der Tumorimplantation zu bestätigen. Dreizehn Wochen wurden als Studienendpunkt gewählt, da HOXA1, aber keine GFP-exprimierenden Tumoren, zu diesem Zeitpunkt in die Lunge metastasierten (Ergänzende Abb. 5a). Dreizehn Wochen nach der Transplantation wurden die Lungen ex vivo BLI unterzogen (Ergänzende Abb. 5a) wurden metastatische Läsionen isoliert und genomische DNA (gDNA) extrahiert und als Vorlage für qPCR verwendet, um eindeutige Barcode-Regionen zu amplifizieren, die mit jedem ORF assoziiert sind (Ergänzende Abb. 5b). MFP-Tumoren wurden ebenfalls isoliert und diesen Analysen unterzogen (Abb. 2a). Die Darstellung jedes barcodierten ORF im MFP relativ zur Referenzprobe wurde für jeden Pool bestimmt (Abb. 2b; ergänzend Fig. 5c, d). Die Darstellung in der Lunge wurde dann auf die Anreicherung in MFPs gegenüber der Referenz normalisiert (Abb. 2b, c). Die Metastasen wurden in drei Gruppen eingeteilt, einschließlich derjenigen, die sowohl in der Lunge als auch in MFPs angereichert waren (Abb. 2b, oberer rechter Quadrant und Ergänzende Fig. 5c), die ausschließlich in MFPs angereichert sind (Abb. 2b, unterer rechter Quadrant) und solche, die ausschließlich in Lungen angereichert sind (Abb. 2b, oberer linker Quadrant und Fig. 2c). Zellen, die GFP exprimieren, wurden in einigen der Pools an Lungenmetastasen angereichert und der durchschnittliche Anreicherungswert für GFP in der Lunge betrug ungefähr 5 (Ergänzende Abb. 5e). Daher verwendeten wir dies als Anreicherungs-Score-Cutoff, um einen echten Treffer in unserem Bildschirm zu definieren, und identifizierten 44 Gene, die selektiv in Lungenmetastasen im Vergleich zu Primärtumoren angereichert wurden. Diese Treffer wurden nach Anreicherungswerten geordnet (Abb. 2c und ergänzende Tabelle 2). Unter den ersten fünf Treffern war CEACAM5 der einzige, dessen Expression in Primärtumoren ein schlechtes Überleben bei Brustkrebspatientinnen vorhersagte (Ergänzende Abb. 6a). Daher haben wir die funktionelle Rolle von CEACAM5 bei der Metastasierung von Brustkrebs weiter untersucht.
Hochdurchsatz-Gain-of-Function-Screening in vivo identifiziert funktionelle Treiber von Metastasen. eine schematische Darstellung Format für Gain-of-Function (GOF) Bildschirm verwendet. Siehe auch Ergänzende Fig. 5. ORF, offener Leserahmen. In jede Kohorte wurden zehn Mäuse implantiert. b Streudiagramm mit relativer Darstellung jedes ORF in MFP-Tumoren nach Normalisierung zur Referenz (x-Achse) und in der Lunge relativ zu MFP-Tumoren (y-Achse). Die ΔΔCT-Methode wurde zur Quantifizierung von qPCR-Daten verwendet. CEACAM5 ist rot dargestellt. c-Gene, die in Lungenmetastasen, aber nicht in MFP-Tumoren angereichert waren, wurden in absteigender Reihenfolge der Anreicherung in der Lunge eingestuft. Gepunktete Linie zeigt Anreicherung Score Cutoff. Siehe auch Ergänzende Fig. 5 und ergänzende Tabelle 2
Bestätigung der verstärkten CEACAM5-Expression in zusätzlichen metastasierten PDX-Modellen
Wir fanden heraus, dass die CEACAM5-Expression dynamisch reguliert wurde, da metastasierte Subpopulationen in vivo seriell zwischen Lunge und MFPs passiert wurden (Abb. 3a), die Befunde aus RNAseq bestätigen (Ergänzende Tabelle 1 und ergänzende Abb. 6b). In ähnlicher Weise war die CEACAM5-Expression in der Leber höher (Ergänzende Abb. 7a) und Gehirn (Ergänzende Fig. 7b) Metastasen relativ zu entsprechenden MFP-Tumoren. Die CEACAM5-Proteinspiegel waren auch bei Lungenmetastasen im Vergleich zu MFP-Tumoren höher (Abb. 3b). Der Anstieg der CEACAM5-Expression in metastasierten Läsionen war nicht abhängig von der p53-Stummschaltung in dieser PDX-Linie, da Lungenmetastasen aus der isogenen PDX-Linie, die den Wildtyp p5326,30 exprimierten, ebenfalls höhere Expressionsniveaus von CEACAM5 aufwiesen (Ergänzende Abb. 7c).
CEACAM5 ist in Metastasen hochreguliert und seine Expression korreliert umgekehrt mit der von Vimentin in PDX-Modellen von TNBC. die Expression von CEACAM5 in MFP-Tumoren und metastasierten Läsionen von Mäusen, die mit BC3_A2-Tumoren transplantiert wurden, wurde durch qRT-PCR bestimmt. Gepaarte t-Tests, p < 0,001 für P0-Lunge, P2-MFP-Tumor und P2-Lunge. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne Maus. Fehlerbalken repräsentieren SEM biologischer Replikate. Siehe auch Ergänzende Fig. 7. b-MFP-Tumoren und entsprechende Metastasen von Mäusen, die mit BC3_A2-Tumoren transplantiert wurden, wurden von IHC unter Verwendung eines CEACAM5-Antikörpers analysiert. Skalenbalken zeigen 100 µm an. die Expression von CEACAM5 in MFP-Tumoren und metastasierten Läsionen von Mäusen, die mit PIM001-P-Tumoren transplantiert wurden, wurde durch qRT-PCR bestimmt. Die Daten werden auf einer Log-Skala dargestellt. Gepaart t-Test, p < 0.001. Jeder Punkt repräsentiert eine einzelne Maus. Fehlerbalken repräsentieren SEM biologischer Replikate. d MFP-Tumoren und entsprechende Lungenmetastasen von Mäusen, die mit PIM001-P-Tumoren transplantiert wurden, wurden von IHC unter Verwendung eines CEACAM5-Antikörpers analysiert. Skalenbalken zeigen 100 µm an. e, f IHC von seriellen Tumorgewebeschnitten von Mäusen, die mit BC3_A2 (e) oder PIM001-P (f) transplantiert wurden, die mit Antikörpern gefärbt waren, die spezifisch für CEACAM5 (oben) oder Vimentin waren. Skalenbalken zeigen 100 µm an. die Expression von CEACAM5 (obere Platte) oder Vimentin (untere Platte) wurde in einem Panel von Brustkrebszelllinien bestimmt. Fehlerbalken stellen SEM von technischen Triplikaten dar. h IHC wurde durchgeführt, um phosphoryliertes p38 in MFP-Tumoren und Lungenmetastasen von BC3_A2-Mäusen zu überwachen. Skalenbalken zeigen 100 µm an
Ein zweiter Satz von PDX-Modellen von TNBC (PIM001) wurde ausgewertet, um festzustellen, ob der Anstieg von CEACAM5 in metastasierten Läsionen eine allgemeine Eigenschaft der Metastasierung war. PIM001-P wurde aus dem treatment-naïven Primärtumor eines Patienten mit metastasiertem TNBC etabliert, wohingegen PIM001-M aus der dermalen Metastasierung desselben Patienten etabliert wurde. PIM001-P-Tumorzellen wurden so konstruiert, dass sie sowohl CBR-Luc als auch mCherry exprimierten, und dann in die MFPs von Empfängermäusen eingepflanzt. Zum Zeitpunkt der Nekropsie wurden MFP-Tumoren und Lungenmetastasen isoliert. Die CEACAM5-Expression war auf beiden mRNA-Ebenen erhöht (Abb. 3c) und Proteinspiegel (Abb. 3d) in PIM001-P-Lungenmetastasen im Vergleich zu entsprechenden MFP-Tumoren. Interessanterweise waren die CEACAM5-Proteinspiegel bei PDX-MFP-Tumoren, die aus der dermalen Metastasierung der Patientin (PIM001-M) hervorgingen, höher als bei den PDX-MFP-Tumoren, die aus ihrem primären Brusttumor (PIM001-P) hervorgingen (Ergänzende Abb. 7d). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Erhöhung von CEACAM5 eine gemeinsame Eigenschaft von Metastasen in PDX-Modellen von TNBC ist.
Die CEACAM5-Expression korreliert umgekehrt mit der Vimentin-Expression und der Phosphorylierung von p38
Da die Expression von CEACAM5 in PDX-Modellen umgekehrt mit der Expression von Vimentin korreliert war (Abb. 1d, 3a; ergänzend Fig. 2a und 7a, b) wurde Immunhistochemie (IHC) eingesetzt, um Lungenmetastasen und MFP-Tumoren auf relative Vimentin- und CEACAM5-Spiegel zu überwachen. Die Proteinspiegel korrelierten mit den mRNA-Spiegeln in beiden PDX-Modellen (Abb. 3e, f). Die Vimentin-Expression korrelierte auch umgekehrt mit der CEACAM5-Expression in einem Panel von Brustkrebszelllinien (Abb. 3g). Die Serin/Threonin-spezifische Proteinkinase p38alpha (auch bekannt als MAPK14, im Folgenden als p38 bezeichnet) wird während der EMT phosphoryliert.31 Interessanterweise korrelierte phosphoryliertes (aktives) p38 mit hohen Expressionsniveaus von Vimentin in MFP-Tumoren, und die p38-Phosphorylierung nahm bei Lungenmetastasen ab, bei denen die Vimentinspiegel niedrig waren (Abb. 3h). Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass die CEACAM5-Expression umgekehrt mit der Expression von EMT-Markern in Lungenmetastasen korreliert.
Die ektopische Überproduktion von CEACAM5 hemmt die TGF-β-Signalisierung und die Expression von EMT-Markern
Da die Expression von CEACAM5 umgekehrt mit dem Mesenchymstatus korrelierte, untersuchten wir, ob CEACAM5 eine direkte Rolle bei der Regulation der Expression von Mesenchymmarkern spielte. BC3_A2-Zellen, die so konstruiert sind, dass sie menschliches CEACAM5 oder GFP als Negativkontrolle überproduzieren (Ergänzende Abb. 8a, b) wurden auf Expression von Vimentin und CDH2/N-Cadherin (mesenchymale Marker) und CDH1/E-Cadherin (epithelialer Marker) untersucht. Eine Überexpression von CEACAM5 führte zu einer erhöhten Expression von CDH1 (Ergänzende Abb. 8c) und verminderte Expression von CDH2 (Ergänzende Fig. 8d) und Vimentin (Ergänzende Fig. 8e). Darüber hinaus reduzierte und verzögerte die Überproduktion von CEACAM5 die TGF-β-vermittelte Phosphorylierung von Smads in BC3_A2-Zellen (Abb. 4a, c, Ergänzend Fig. 9a) und p38-Phosphorylierung in beiden BC3_A2-Zellen (Fig. 4a, b, Ergänzend Fig. 9a) und MDA-MB-231-Zellen (ergänzende Fig. 8f, Ergänzend Fig. 9b). Schließlich verzögerte die Überproduktion von CEACAM5 die TGF-β-induzierte EMT, wie durch E-Cadherin- und Vimentin-Expression beurteilt (Abb. 4d, Ergänzend Fig. 9c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CEACAM5 die EMT negativ reguliert und eine Funktion für CEACAM5 bei Brustkrebsmetastasen identifiziert.
Die CEACAM5-Überproduktion reguliert die Expression mesenchymaler Marker herunter und beeinträchtigt die TGF-β-Signalisierung und beeinträchtigt die TGF-β-Signalisierung. BC3_A2-Zellen, die zur Überproduktion von CEACAM5 oder GFP entwickelt wurden, wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 ng/ml TGF-β für die angegebenen Zeiträume kultiviert. Zelluläre Lysate wurden für die angegebenen Proteine einem Western-Blotting unterzogen. b, c Histogramm zeigt die Faltenänderung (Log-Skala) im Phosphorylierungsstatus von p38 (b) oder Smad2 / 3 (c) im Vergleich zu dem zum Zeitpunkt 0 für Zellen, die GFP exprimieren. Fehlerbalken repräsentieren REM von mindestens drei unabhängigen Experimenten. d BC3_A2-Zellen, die GFP oder CEACAM5 exprimieren, wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 ng/ml TGF-β für die angegebenen Zeiträume kultiviert. Zelluläre Lysate wurden für die angegebenen Proteine einem Western-Blotting unterzogen. Alle Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente. Siehe auch ergänzende Fig. 8 und 9
Die Überproduktion von CEACAM5 fördert das metastatische Auswachsen und reduziert EMT in vivo
EMT ist mit einer verringerten Zellproliferation verbunden.19 Daher deutet die Fähigkeit von CEACAM5, EMT zu hemmen, darauf hin, dass es das Tumorwachstum an metastasierten Stellen fördern kann. Um diese Hypothese zu testen, wurden BC3_A2-Zellen, die zur Überproduktion von CEACAM5 oder GFP (Kontrolle) entwickelt wurden, in die Schwanzvenen von Empfängermäusen injiziert, um die Auswirkungen der CEACAM5-Überproduktion auf das Tumorwachstum in der Lunge zu überwachen. Überexpression von CEACAM5 führte zu erhöhtem Tumorwachstum in der Lunge (Abb. 5a und ergänzend Fig. 10a), verminderte Expression von Vimentin auf Proteinebene (Ergänzende Abb. 10b) und verminderte Phosphorylierung von p38 (Fig. 5d, e). Reduzierung der CEACAM5-Spiegel in BC3_A2 mit zwei verschiedenen shRNAs (Abb. 5b) hatte den gegenteiligen Effekt, dass transduzierte Zellen in der Lunge langsamer wuchsen als Kontrollzellen nach Schwanzveneninjektion (Abb. 5c und ergänzend Fig. 10c). Darüber hinaus führte der CEACAM5-Knockdown zu einer erhöhten Läsionszahl, jedoch zu einer verringerten Läsionsgröße (Ergänzende Abb. 10d, e). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CEACAM5 Stummschaltung fördert EMT und Tumorzellextravasation bei gleichzeitiger Hemmung des metastasierten Auswuchses.
Die Expression von CEACAM5 fördert das Wachstum von Lungenmetastasen. ein BC3_A2 Zellen überproduzieren CEACAM5 oder GFP wurden in die Schwanzvenen von Mäusen injiziert. BLI wurde verwendet, um den Photonenfluss in der Lunge von Mäusen zu den angegebenen Zeitpunkten zu quantifizieren. Gepaarter t-Test, p = 0,03. Fehlerbalken repräsentieren SEM biologischer Replikate (n = 5 Mäuse pro Gruppe). b BC3_A2-Zellen, die Kontroll-shRNA (shLuc) oder zwei verschiedene für CEACAM5 spezifische shRNAs (# 3 und # 5) exprimierten, wurden einer qRT-PCR unterzogen, um die CEACAM5-Expression zu überwachen. Fehlerbalken stellen SEM von technischen Triplikaten dar. Siehe auch Ergänzende Fig. 10. c BC3_A2-Zellen, die shLuc oder zwei verschiedene CEACAM5-shRNAs exprimieren, wurden in die Schwanzvenen von Mäusen injiziert. BLI wurde verwendet, um den Photonenfluss in der Lunge von Mäusen zu den angegebenen Zeitpunkten zu quantifizieren. Gepaarte t-Tests, p = 0,01 für sh # 3 und p < 0,001 für sh # 5. Die Daten wurden auf den Anfangszeitpunkt normalisiert und auf einer Protokollskala dargestellt. Fehlerbalken repräsentieren SEM biologischer Replikate (n = 5 Mäuse pro Gruppe). d BC3_A2-Zellen, die CEACAM5 überproduzieren, wurden in die Schwanzvenen von Mäusen injiziert, und Lungen wurden isoliert und IHC mit den angegebenen Antikörpern unterzogen. Skalenbalken zeigen 100 µm an. e-Zellen, die in den in Panel d dargestellten Gewebeschnitten positiv für CEACAM5, Vimentin oder p-p38 anfärbten, wurden mit dem automatisierten Bildgebungssystem Vectra 3.0 quantifiziert. Gepaarte t-Tests, p = 0,0008 für CEACAM5, p = 0,03 für Vimentin und p = 0,03 für p-p38. Fehlerbalken stellen REM von mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten dar. f-RNA, die aus BC3_A2-Zellen isoliert wurde, die CEACAM5 oder GFP überproduzieren, und entweder in vitro kultiviert oder nach Schwanzveneninjektion (in vivo, a, d) aus der Lunge isoliert wurde, wurde einer GSEA-Signalweganalyse unterzogen (linke zwei Spalten). Die Top 5 heruntergeregelten (blau) und Top 5 hochgeregelten (rot) Prozesse werden angezeigt. Felder geben FDR <0.1 für die statistische Signifikanz an. NES (normalisierter Anreicherungswert). Bedeutung dieser Signalwege in P0- und P2-MFP-Tumoren vs. entsprechende Lungenmetastasen wird zum Vergleich gezeigt (rechts zwei Spalten). Die Daten werden von biologischen Triplikaten dargestellt. Siehe auch Ergänzende Fig. 11
Um zu überwachen, wie sich die Überproduktion von CEACAM5 auf die Genexpression auswirkte, wurden BC3_A2-Zellen, die zur Überproduktion von CEACAM5 oder GFP entwickelt wurden, in vitro kultiviert oder aus der Lunge isoliert nach Schwanzveneninjektion (in vivo). RNA wurde isoliert und RNAseq unterzogen. Es wurde eine differentielle Genexpressionsanalyse durchgeführt, und GSEA identifizierte EMT als den einzigen Krebs-Signalweg, der sowohl in vitro als auch in vivo durch CEACAM5-Überproduktion signifikant herunterreguliert wurde (Abb. 5f, Ergänzend Fig. 11). Dieses Ergebnis ähnelt dem bei P0- und P2-Lungenmetastasen beobachteten (Abb. 1c, 5f). Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass eine Hochregulierung der CEACAM5-Expression in metastasierten Läsionen MET induziert und das Auswachsen metastasierter Tumorzellen an sekundären Stellen verstärkt.
Die CEACAM5-Expression ist in metastasierten Läsionen von Brustkrebspatientinnen hochreguliert
Als nächstes wurde die CEACAM5-Expression in metastasierten Läsionen und Brusttumorgewebe von Patientinnen mit Brustkrebs untersucht. Die IHC-Färbung eines abgestimmten Gewebesets bestehend aus einem Primärtumor und einer Lungenmetastase einer Patientin mit Brustkrebs (Ergänzende Tabelle 3) ergab höhere CEACAM5-Spiegel in der Lungenmetastase im Vergleich zum primären Brusttumor (Abb. 6a und ergänzend Fig. 12a). Zur Erweiterung dieser Analysen wurde ein Tissue Microarray (TMA) bestehend aus Lungenmetastasen von 25 Brustkrebspatientinnen (Ergänzende Abb. 12b, c und ergänzende Tabelle 3) wurde für CEACAM5 angefärbt (ergänzende Fig. 12b), und die Färbeintensität wurde mit einem Score (Fig. 6b). Diese Scoring-Methode wurde auch auf eine TMA aus dem Human Protein Atlas angewendet, die aus menschlichen Brusttumoren bestand, die für CEACAM5 gefärbt waren.32 Die Mehrheit der Lungenmetastasen exprimierte hohe CEACAM5-Spiegel (Abb. 6c) im Vergleich zu Brusttumoren (Abb. 6d), was zeigt, dass CEACAM5 bei metastasierten Läsionen im Vergleich zu primären Brusttumoren höher war.
Die CEACAM5-Proteinspiegel sind bei metastasierten Läsionen von Brustkrebspatientinnen erhöht und korrelieren umgekehrt mit der Expression von Vimentin. a Der Primärtumor und die entsprechende Lungenmetastase einer Patientin mit Brustkrebs wurden einer IHC unterzogen, um die CEACAM5-Spiegel zu überwachen. Skalenbalken zeigen 100 µm an. b Ein Tumorgewebe-Microarray (TMA) bestehend aus Lungenmetastasen von 25 Brustkrebspatientinnen wurde einer IHC mit einem CEACAM5-spezifischen Antikörper unterzogen und die Färbeintensität bewertet. Es werden repräsentative Bilder gezeigt. Skalenbalken zeigen 100 µm an. c Das Scoring-System in b wurde auf die TMA angewendet, die aus Lungenmetastasen von 25 Brustkrebspatientinnen bestand, um die relativen CEACAM5-Spiegel zu bewerten. d Das Scoring-System in b wurde auf eine TMA aus dem Human Protein Atlas angewendet, die aus 25 primären Brusttumoren bestand, um die relativen CEACAM5-Spiegel zu bewerten. e Der Primärtumor und die entsprechende Lungenmetastase einer Patientin mit Brustkrebs (aus a) wurden für CEACAM5 und Vimentin co-gefärbt und immunfluoreszenzmikroskopisch analysiert. Skalenbalken zeigen 100 µm an. f-Zellen, die in den in e dargestellten Gewebeschnitten positiv für CEACAM5, Vimentin oder beide färbten, wurden mit dem automatisierten Bildgebungssystem Vectra 3.0 quantifiziert. g Das TMA bestehend aus Lungenmetastasen von 25 Brustkrebspatientinnen wurde für CEACAM5 und Vimentin co-gefärbt und mittels Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert. Es werden repräsentative Bilder gezeigt. Skalenbalken zeigen 100 µm an. h-Zellen, die in den in g gezeigten Gewebeschnitten positiv für CEACAM5, Vimentin oder beide färbten, wurden mit dem automatisierten Bildgebungssystem Vectra 3.0 quantifiziert. Siehe auch Ergänzende Fig. 12
Als nächstes untersuchten wir das übereinstimmende Gewebeset auf Koexpression von CEACAM5 und Vimentin. Die Co-Färbung für CEACAM5 und Vimentin ergab höhere CEACAM5-Spiegel in der Lungenmetastase im Vergleich zum Brusttumor, und das umgekehrte Färbemuster wurde für Vimentin beobachtet (Abb. 6e, f). Darüber hinaus zeigte eine kleine Population von Tumorzellen eine Kofärbung sowohl für CEACAM5 als auch für Vimentin (Abb. 6f). Diejenigen Zellen, die für beide Proteine positiv färben, können Zellen in einem hybriden EMT / MET-Zustand darstellen.33 Die TMA bestehend aus Lungenmetastasen von 25 Brustkrebspatientinnen zeigte ebenfalls eine inverse Korrelation zwischen CEACAM5 und Vimentin-Färbung (Abb. 6g, h; Ergänzende Fig. 12a-e). Diese Ergebnisse bestätigten Schlussfolgerungen aus unseren PDX-Modellen von TNBC und zeigten, dass die CEACAM5-Expression umgekehrt mit der Vimentin-Expression in primären Brusttumoren und metastasierten Läsionen korreliert. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass CEACAM5 MET fördert, um das Tumorwachstum an metastasierten Stellen zu erleichtern (Ergänzende Abbildung 12a, b).
