Alle Methoden in Human- und Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen institutionellen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Isolierung und Kultivierung von plastisch adhärenten MSCs und CD271-immunpositiven MSCs aus Fettgewebe

Nach ethischer Genehmigung durch die National Health Service (NHS) Health Research Authority (LREC-Nummer 12 / EE/0136) und Einverständniserklärung aller Spender wurden PA-MSCs und CD271 + -MSCs aus AT isoliert, die als chirurgische Abfallprodukte geerntet worden waren. Das AT wurde zerkleinert und mit 0 behandelt.3 U/ml Kollagenase (Sigma, Dorset UK) für zwei Stunden bei 37°C, wonach Dulbecco’s Modifiziertes Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 20% (v/v) fetalem Kälberserum (FCS) und 1% (v/v) Penicillin und Streptomycin (Alle fa. PAA, Yeovil, Somerset, UK) zugegeben und das aufgeschlossene Präparat 10 Minuten bei 600 g zentrifugiert wurde. Das resultierende Pellet wurde in DMEM, ergänzt mit 10% (v/v) FCS und 1% (v/v) Penicillin und Streptomycin, d.h. Standardkulturmedium, resuspendiert und durch ein 100 µm Zellsieb (BD Biosciences, Berkshire, UK) geleitet. Das Filtrat wurde 10 Minuten bei 600 g nachzentrifugiert und pelletierte Zellen in 5 ml Standardkulturmedium nachsuspendiert und durch ein 40 µm Zellsieb geleitet. Die resultierende Zellsuspension wurde anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Erythrozytenlysepuffer (Miltenyi Biotech, Surrey, UK) behandelt. Für jede AT-Präparation wurden MSCs aus den nach Erythrozytenlyse vorliegenden mononukleären Zellen durch ihre erhöhte Adhäsion an Gewebekulturplastik8 oder durch Magnetic Associated Cell Sorting (MACS) für CD271-Immunopositivität14 isoliert. Diese Zellen wurden in Standardkulturmedium in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 °C mit routinemäßiger Passage durch Trypsinisierung bei 80% iger Konfluenz kultiviert. PA MSCs und CD271 + MSCs an den Passagen II-III wurden für alle nachfolgenden Experimente verwendet. Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Anreicherung für CD271 + -Zellen (unter Verwendung der MACS-Technologie) zu bewerten, wobei die frisch isolierten Zellen nach der Isolierung über Nacht bei -80 ° C gelagert und dann aufgetaut und sofort für CD271 immunisiert wurden; für alle Proben waren >90% der Zellen zu diesem Zeitpunkt CD271-immunopositiv (Daten nicht gezeigt).

In vitro Differenzierungsprotokolle

Die Differenzierungskapazität von PA und CD271+ MSCs zur Bildung von Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten wurde wie zuvor beschrieben bewertet8,45. Kurz gesagt, für die Osteogenese wurden Monolayer-Kulturen von MSCs mit 10 nM Dexamethason, 50 ng / ml Ascorbinsäure und 1 mM Beta-Glycerophosphat (versus Trägerkontrollen) alle 2-3 Tage für einen Zeitraum von 4 Wochen behandelt, wonach die Kulturen durch Fixierung geerntet und für alkalische Phosphatase-Aktivität wie folgt gefärbt wurden: Zellen wurden mit 10% neutralem Pufferformalin für 10 Minuten fixiert. Währenddessen wurde eine Lösung hergestellt, indem 25 mg Naphthol-phosphat (Naphthol AS-MX phosphat: Sigma) in 0,5 ml Dimethylformamid gegeben wurden. Diese Lösung wurde mit 50 ml 0,2 M Tris-HCl-Puffer, enthaltend 50 mg fast red TR (Sigma), versetzt. Nach gutem Mischen wurde die endgültige Lösung mit Whatman No. 1 Filterpapier (Whatman) filtriert. Die Fixierlösung wurde dann entfernt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen, dann wurde 1 ml der Färbelösung für 1 Stunde in jede Vertiefung gegeben. Schließlich wurde die Färbung entfernt und digitalisierte Bilder wurden mit einem invertierten Mikroskop aufgenommen. Die Differenzierung entlang der osteogenen Linie wurde weiter durch erhöhte alkalische Phosphataseaktivität in differenzierten Zellen im Vergleich zu undifferenzierten Zellen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Biovision, USA) und nach dem Herstellerprotokoll bewertet; kurz gesagt, die Zellen wurden im Assaypuffer homogenisiert. Die homogenisierten Zellen wurden dann zentrifugiert, um unlösliches Material bei 13.000 g für 3 Minuten zu entfernen. Dann wurden jeweils 80 µl der Proben in separate Vertiefungen einer 96-Well-Platte geladen. Dann wurden 50 µl 5 mm pNPP-Lösung zu jeder Probennaht gegeben. Nach einem Mischschritt durch Auf- und Abpipettieren wurden die Vertiefungen 60 Minuten bei 25°C inkubiert. Eine Standardkurve wurde durch Verdünnen von 40 µl 5 mM pNPP in 160 µl Assaypuffer erzeugt, um 1 mM pNPP-Standard zu erzeugen. Dann wurden 0, 4, 6, 12, 16 und 20 µl dieser Standardlösung in eine 96-Well-Platte geladen, um 0-20 nmol / ml pNPP-Standards zu erzeugen, die spektralphotometrisch gemessen werden konnten. Für die Chondrogenese wurden Zellpellets in DMEM/High Glucose (Sigma), ergänzt mit 100 nM Dexamethason (DEX), hergestellt, 37.5 µg / ml Ascorbat-2-phosphat, 1% (vol/ vol) Insulin, Transferrin und Selen (ITS-X100; Sigma) und 10 ng / ml transformierender Wachstumsfaktor-β1 (TGF-β1) (PeproTech, London, UK) und Penicillin und Streptomycin. Kontrollkulturen wurden mit DMEM/ High Glucose-Medien mit Trägern allein, d.h. Methanol, sterilem Wasser und BSA in geeigneten Verdünnungen, behandelt. Am Tag 28 wurde die chondrogene Differenzierung histologisch untersucht, indem die Pellets in 10% neutralem gepuffertem Formalin fixiert, dann in Paraffin eingebettet und Gewebeschnitte geschnitten wurden, die mit Toluidinblau (Sigma) als Marker für die Proteoglycansynthese angefärbt wurden8. Zusätzlich wurde der Gehalt an Glycosaminoglycan, der in den letzten 24 Stunden der Kultur vor der Ernte am Tag 28 in das Differenzierungsmedium sezerniert wurde, unter Verwendung des DMMB-Assays gemessen. Das DMMB-Assayprotokoll wurde von der Methode von Farndale et al., 1986 wie folgt46: (i) Die DMMB-Farbstofflösung wurde durch Zugabe von 3 hergestellt.04 g Glycin, 2,37 g NaCl und 16 mg 1,9 DMMB auf 1 Liter entionisiertes Wasser; (ii) der pH-Wert wurde mit Salzsäure auf 3,0 eingestellt und die Farbstofflösung in einer braunen Flasche aufbewahrt; (iii) 50 µl Aliquots Kulturmedium, das am Tag 28 aus den zellgesäten Gerüsten geerntet wurde, wurden in dreifacher Ausfertigung auf eine 96-Well-Platte gegeben; (iv) 200 µl der DMMB-Farbstofflösung wurden dem Kulturmedium zugesetzt und die Extinktion wurde bei 540 nm sofort. Chondroitinsulfat (CS) aus Haifischknorpel (Sigma) wurde verwendet, um eine Standard-Absorptionskurve (0-40 µg / ml, CS) bereitzustellen, aus der der GAG-Gehalt in den Proben des Kulturmediums berechnet wurde. Die Absorptionsniveaus für den GAG-Gehalt in den Proben des Kulturmediums wurden normalisiert, um die Hintergrundabsorption zu berücksichtigen, die sich aus der Anwesenheit von Phenolrot im Medium ergibt, indem die Standards in DMEM-Medium gelöst wurden. Zur Adipogenese wurden MSC-Kulturen in Kulturmedien mit 1 µM DEX, 0 gehalten.5 mM 3-isobutyl-methylxanthin (Sigma), 1% Insulin, Transferrin und Selen (ITS-X 100 Pre-mix; PAA) und 100 µM Indomethacin (Sigma) 28 Tage bei 37°C und 5% CO2, wie zuvor beschrieben47. Kontrollzellen wurden in vollständigen Medien mit Trägern gehalten. Die Differenzierung wurde mittels Ölrot O-Färbung von Lipidtröpfchen untersucht. Die Zellen wurden in 10% neutralem Pufferformalin für 1 Stunde fixiert, wonach die Färbelösung zugegeben wurde. Die relative Ölrot-O-Akkumulation wurde nach 15-minütiger Behandlung mit 100% igem Isopropanol gemessen und die Extinktion des Überstandes bei 540 nm mit einem Spektralphotometer abgelesen.

MSC-Transplantation in ein femorales osteochondrales Defektmodell

Nach institutioneller ethischer Überprüfung und Zulassung (Die Institutional Animal Care and Use Committees der Universität Fukui, Abteilung für Orthopädie und Rehabilitationsmedizin: Zulassungsnummer 25-053), weibliche athymische Nacktratten (F344/ N Jcl rnu/rnu, CLEA Japan, Inc. Tokio, Japan) im Alter von 6-10 Wochen und mit einem Gewicht von 150-170 Gramm wurden nach dem Zufallsprinzip in die folgenden Gruppen eingeteilt: (i) PA MSCs (n = 6 Tiere); (ii) CD271 + MSCs (n = 6 Tiere); (iii) eine Kontrollgruppe von Alpha-Chondro-Schild-Gerüst allein (keine Zellen, n = 3 Tiere). Diese Anzahl von Tieren pro Gruppe wurde zuvor am selben Institut verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen auf dem 5% -Niveau nachzuweisen48. Die Ratten wurden durch Einwirkung von 3% Isofluran in O2-Gas betäubt und während der Operation auf 1,5% Isofluran in O2-Gas gehalten. Nach der Sterilisation der Knie mit 70% Ethanol wurde ein medialer parapatellarer Hautschnitt vorgenommen, gefolgt von einer Präparation durch den Muskel und anschließender Freilegung des Kniegelenks durch laterale Dislokation der Patella. Bilaterale osteochondrale Defekte von 2 mm Durchmesser und 1 mm Tiefe wurden in der Patellarut des Femurs jedes Tieres unter Verwendung eines chirurgischen Bohrers mit 2 mm Durchmesser erzeugt. Alpha Chondro Shield wurde als Zellträger / Gerüst verwendet, um 5 × 104 PA MSCs oder CD271 + MSCs gegen keine Zellen (als Kontrollen) zu liefern. Vor der Transplantation wurden die Zellen durch Trypsinisierung geerntet und in einem Volumen von 10 µl Standardkulturmedium auf Alpha-Chondro-Schildscheiben mit einem Durchmesser von 2 mm ausgesät und dann in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C und 5% CO2 für 30 Minuten inkubiert, um die Zelladhäsion und den Einbau in das Gerüst zu fördern. Die Zell- und Kontrollgerüste wurden in die Defekte transplantiert und mit Fibrinkleber fixiert, der etwa 10-20 Sekunden aushärten ließ (Abb. 6). Die Patella wurde verlegt und das Bindegewebe und die Haut mit Nylonnähten vernäht. Die Tiere durften sich nach der Genesung frei bewegen und erhielten eine Standard-Erhaltungsdiät und Wasser ad libinum. 3 Wochen nach der Transplantation wurden Tiere durch Überdosierung von 3% Isofluran geopfert, um das Ausmaß der Wundreparatur makroskopisch und histologisch zu untersuchen.

Makroskopische Bewertung der Knorpelwundheilung

Nach der Freilegung des Kniegelenks bei geopferten Tieren wurde der Defekt makroskopisch von zwei Chirurgen bewertet, die mit einem etablierten System zur Beurteilung der Knorpelwundheilung in kleineren Tiermodellen für den Behandlungsarm geblendet wurden49. Der Grad der Gewebereparatur wurde jeweils von 0 Punkten (bestes Ergebnis) bis 4 Punkten (schlechtestes Ergebnis) bewertet für: (1) die Farbe des Reparaturgewebes; (2) das Ausmaß der Blutgefäße im Reparaturgewebe; (3) die Glätte der Oberfläche des Reparaturgewebes; (4) das Ausmaß, in dem der Wunddefekt mit Reparaturgewebe gefüllt war; (5) das Ausmaß der Degeneration des benachbarten Gelenkknorpels. Die erzielten Punkte für jedes Kriterium wurden addiert und der Grad der besten Reparatur wurde mit der niedrigsten Punktzahl von einer Gesamtpunktzahl von 20 dargestellt.

Histologisches Scoring der Knorpelwundheilung

Nach chirurgischer Exzision wurden die Knie der Tiere 48 Stunden in 10% neutral gepuffertem Formalin (Sigma) fixiert und 24-48 Stunden bei 4 °C in K-CX-Entkalkungslösung (FALMA, Tokio, Japan) gegeben. Anschließend wurden die Rattenknie über Nacht in fließendem Leitungswasser gewaschen, verarbeitet und in schnittfertige Paraffinwachsblöcke eingebettet. Gewebeschnitte wurden in einem Standard-Rotationsmikrotom mit einer Dicke von 5 Mikrometern geschnitten und diese wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Toluidinblau gefärbt vor der Montage in DPX und histologische Untersuchung. Das Ausmaß und die Qualität der Knorpelreparatur wurden histologisch und unabhängig von zwei Prüfern unter Verwendung des Wakitani-Scoring-Systems36 bewertet, das um zwei zusätzliche Parameter erweitert wurde, d.h. untersuchung des Vorhandenseins von Blutgefäßen und Fremdkörperriesenzellen (FBGCs). Daher umfasste das Bewertungssystem sieben verschiedene Parameter: (1) Zellmorphologie; (2) Matrixfärbung; (3) Oberflächenregularität; (4) Knorpeldicke; (5) Integration des Reparaturgewebes in den Wirtsknorpel; (6) das Ausmaß der Vaskularisierung innerhalb des Defekts; (7) das Ausmaß der FBGC-Reaktion. Für jeden dieser Parameter repräsentierte die niedrigste Punktzahl (0) die ‚beste‘ Reparatur und eine höchste Punktzahl (4) die ’schlechteste‘ Reparatur. Die Gesamtpunktzahlen wurden addiert und dann zwischen den Gruppen von insgesamt 21 verglichen.

Immunhistochemie für menschliches mitochondriales Antigen

Gewebeschnitte wurden mit einem anti-humanen mitochondrialen Antigen (HMA) Antikörper (Klon 113-1: Abcam, Cambridge, UK) angefärbt, um das Vorhandensein von humanen MSCs zu beurteilen. Nach der Antigenentnahme wurden die Schnitte in drei Schichten PBS getaucht und 20 Minuten lang mit 2,5% Pferdeserum (Vector Labs Ltd) bei Raumtemperatur blockiert, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Anschließend wurden die Schnitte mit dem Maus-Anti-HMA-Antikörper (1) inkubiert:400 Verdünnung in PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Anschließend wurde jeder ungebundene Antikörper in drei PBS-Dosen abgewaschen und die Schnitte 30 Minuten bei Raumtemperatur mit biotinyliertem Anti-Maus-IgG inkubiert. Die Schnitte wurden dreimal in PBS gewaschen und die endogene Peroxidationsaktivität mit 0,3% igem Wasserstoffperoxid in Methanol für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Während dieses Inkubationsschrittes wurde der Vecta ABC regent (Vector Labs Ltd, Peterborough, UK) präpariert und vor Gebrauch gemäß Herstellerangaben 30 Minuten stehen gelassen. Nach Blockierung der endogenen Peroxidiseaktivität wurden Schnitte in dreimal PBS gewaschen und mit dem ABC-Reagenz 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde je nach gewünschter Farbintensität ein DAB-Chromogen (Vector Labs) für 6-8 Minuten zugegeben. Die Schnitte wurden dann gewaschen und durch Ethanol (70-100%) entwässert, mit Xylol gereinigt und in Pertex montiert. Chondrogenes Pellet von humanem MSCs wurde als Positivkontrolle verwendet. Die Negativkontrolle umfasste chondrogene Pellets, bei denen der primäre Antikörper weggelassen wurde.

Rasterelektronenmikroskopie

Die Adhäsion von MSCs, die vor der Implantation in das Alpha-Chondro-Schildgerüst eingesät wurden, wurde rasterelektronenmikroskopisch (REM) wie folgt untersucht: Nachdem die zellgesäten Gerüste in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C und 5% CO2 für 30 Minuten inkubiert worden waren, wurden sie in PBS gewaschen und dann in 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) für 2 Stunden fixiert, dann in 0 gewaschen.1 M Phosphatpuffer vor der Behandlung mit 1% Osmiumtetraoxid für 1 Stunde. Die Proben wurden dann durch eine abgestufte Reihe von Ethanollösung dehydratisiert, mit Übergangslösungsmittel, T-Butylalkohol für 30 Minuten behandelt, gefriergetrocknet, mit Goldpalladium beschichtet und schließlich mit einem JSM-6390 (JEOL, Tokio, Japan) oder Zeiss EVO10 abgebildet Rasterelektronenmikroskop (Carl Zeiss, Cambridge, UK).

LEBEND- /Totfärbung zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit in zellgesäten Gerüsten

MSC-gesäte Gerüste wurden mit LEBEND- /Totfärbelösung gemäß dem zuvor beschriebenen Herstellerprotokoll angefärbt8. Kurzzeitig wurden die zellgesäten Scaffolds 30 Minuten bei 37°C im Dunkeln in die LEBEND/TOT-Färbelösung getaucht. Anschließend wurden die Scaffolds aus der Färbelösung entfernt, in PBS gewaschen und sofort mit einem konfokalen Mikroskop (Leica Microsystems DM6000B – SP57CS) abgebildet.

In-vitro-Angiogenese-Assays

Die menschliche EA.die hy926-Endothelzelllinie wurde als Modell verwendet, um die angiogene Aktivität von kulturkonditioniertem Medium aus PA MSC und CD271 + MSC CM zu untersuchen. EA.hy926 Endothelzellproliferation/-migration und Endotheltubulusbildung wurden wie folgt untersucht: (i) EA.hy926-Zellen wurden in Standardkulturmedium (DMEM /F-12 ergänzt mit 10% FBS, 1% Penicillin und Streptomycin) in 24 Well-Platten für 2 Tage kultiviert, bis 100% konfluente Monoschichten gebildet wurden. Eine sterile Pipettenspitze wurde verwendet, um einen Kratzer in der Monoschicht zu machen. Anschließend wurden die Vertiefungen mit sterilem PBS gewaschen und dann 1 ml konditionierte Medien aus PA-MSC-Kulturen oder CD271 + -MSC-Kulturen in jede der dreifachen Vertiefungen pro getesteter Bedingung gegeben. Als Kontrolle wurde serumfreies DMEM-Kulturmedium verwendet. Die Platte wurde in der Cell IQ Plattform für Live cell Digitalized Imaging über einen Zeitraum von 2 Tagen inkubiert, wonach der Wundverschluss, die Anzahl der lebensfähigen Zellen und das Ausmaß der Migration einzelner Zellen unter Verwendung der Cell IQ Bildanalysesoftware quantifiziert wurden. Die proliferative Reaktion von EA.hy926 Endothelzellen zu PA MSC Und CD271 + MSC konditionierten Medien (versus serumfreies Kontrollmedium) wurde ebenfalls unter Verwendung des MTT-Assays untersucht; (ii) EA.die hy926-Endotheltubulibildung wurde mit Wachstumsfaktor-reduziertem Matrigel (BD Bioscience) getestet, das in 96-Well-Platten (50 µl Matrigel/Well) aliquotiert und anschließend für 30 min bei 37°C EA inkubiert wurde.hy926-Endothelzellen wurden mit 2 × 104 Zellen / Well in 200 µl PA MSC- und CD271 + MSC-konditionierten Medien oder serumfreiem Kontrollkulturmedium auf das Matrigel ausgesät. Die Platten wurden 1 Tag bei 37°C inkubiert und anschließend mit der Cell IQ Imaging Platform (3 Bilder pro Well) abgebildet. Die gesamte Länge / Bild des Endotheltubulus und die Gesamtzahl der Verzweigungspunkte / Bild des Endotheltubulus wurden mit der Cell IQ Image Analyzer-Software gemessen.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit der Software GraphPad Prism6 (GraphPad Software, Inc. CA, USA). Für In-vivo-Experimente wurden mindestens n = 3 Tiere pro Zustand getestet. Für In-vitro-Experimente wurden für alle Analysen n = 3-4 unabhängige Experimente durchgeführt, bei denen die Daten mit einer Einweg-ANOVA bei einem variablen Faktor und einer Zwei-Wege-ANOVA bei zwei variablen Faktoren analysiert wurden. Für makroskopische und histologische Scores der Knorpelreparatur wurden Unterschiede zwischen den Gruppen mit Dunn’s Multiple Comparison Tests untersucht. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen. Alle Daten wurden als Mittelwert ± SEMs oder Mittelwert ± SDs dargestellt (wie in der Abbildung unten angegeben).