Rostlinné materiály a růstové podmínky

Wild-type a mutantních rostlin použitých v této studii byli všichni v Col-0 ekotypy s výjimkou RGA-GFP–RGA lines10, které byly v ekotypu Ler. semena phyB-931 byla získána z centra biologických zdrojů Arabidopsis. Pif4 overexpresser lines a pif4 knockout mutace (mutant slr2) byly ty, které jsou popsány v ref. 3. Dvojité pif4 pif5 mutanty byly získány křížením alely vložení T-DNA pif4-101 a mutantu SALK-087012 s vložením do genu PIF5. 20ox linií nesoucích knockoutovou vložení T-DNA do genu AtGA20ox1 (At4g25420) poskytl P.Hedden. Ga-necitlivé linie Gai exprimovaly stabilní protein GAI pod kontrolou promotoru 35S. Dvojité a trojité mutanty byly generovány křížením těchto linií a genotypizací potomstva pomocí PCR amplifikace nebo analýz Severní skvrny.

semena byla povrchově sterilizována a zaseta na GM agarové desky bez sacharózy32. Desky byly studené léčených pro 2 d při 4 °C a klíčení byl synchronizován do 3 h ozáření bílým světlem a následná inkubace ve tmě po dobu 22 h, před převodem do různých růstových podmínek. Sazenice pěstované v bílém světle byly pěstovány při 20 °C za fluorescenčního bílého světla (fluence 40-60 µmol m-2 s-1)s fotoperiodou 16 h světla/ 8 h tmavé. Pro ošetření červeným světlem byly sazenice pěstovány za nepřetržitého červeného světla (rychlost fluence 35 µmol m-2 s-1 poskytovaná LED diodami). U tmavých sazenic byly desky zabaleny do několika vrstev hliníkové fólie. Desky byly umístěny ve svislé orientaci a skenovány na hypocotylovou délku pomocí softwaru ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). Pro ošetření PAC byla semena přenesena na destičky s inhibitorem po indukci klíčení. Pro každou sadu experimentů bylo měřeno nejméně 20 sazenic.

Rostlinné transformace

komplementární DNA fragmentu včetně full-délka ORF z PIF4 byla amplifikována s primery PIF4-GFPf a PIF4-GFPr, klonovaných do pENTR/D-TOPO vektor (Invitrogen) a vložen do pK7FWG2 binární vektor (http://www.psb.ugent.be/gateway/) s LR clonase (Invitrogen). Tento binární konstrukt byl zaveden do pGV3101 kmene Agrobacterium a transformován do divokého typu Col-0 a phyB Arabidopsis rostlin, pomocí květinové dip transformace method33. Transformanty byly vybrány na médiu obsahujícím kanamycin a analyzovány na jadernou fluorescenci PIF4-GFP. Homozygotní linie byly vybrány pro silné expresory.

ošetření GA, PAC a MG132

zásoby GA3 (GA) a paklobutrazolu (PAC) byly čerstvě připraveny v ethanolu. Inhibitor proteazomu MG132 byl rozpuštěn v DMSO. Pro ošetření MG132 byly sazenice předinkubovány po dobu 2 hodin ve 100 µM roztoku inhibitoru. Ošetření PAC a GA bylo provedeno při 0,1 µM a 50 µM, pokud není uvedeno. Citlivost na inhibitor byla vypočtena jako obrácený poměr snížení délky hypokotylu pozorované u sazenic pěstovaných v Pac 0,1 µM vzhledem ke snížení pozorovanému u rostlin Col-0 (100%). Hodnoty jsou průměrem tří nezávislých experimentů. Citlivost GA byla vypočtena jako poměr zvýšení hypocotylové délky sazenic v 5,0 µM GA3 a vztaženo na sazenice divokého typu Col-0, jako dříve.

Kvasnice dva-hybridní testy

DELLA repressors jsou kódovány v bramborovém nejméně dva geny, přepis zastoupená vyjádřené sekvence tag TC113247 je nejvíce hojně vyjádřil ve vegetativních tkáních. Full-délka otevřený čtecí rámec pro tento DELLA protein byl amplifikován pomocí primerů FPG1 a FPG2 a vložen do rámu s GAL4-BD do pBridge vektor (Clontech). Aby se zabránilo auto-aktivace činnosti spojené s full-délka postavit, N-konci (zbytky 1 až 188), F1 (zbytky 1 362), M5 (zbytky 188 588) a Cter (zbytky 362 588) konstrukty splynula s GAL4-BD byly získány na trávení unikátní systém spei a EcoRI restrikční místa. Plasmidy obsahující tyto konstrukty, prázdné pBridge vektor (pGB) nebo p53–GAL4BD fusion v pGBKT7 vektor (kontrolní) byly transformovány do AH109 kvasinkových buněk a chromované na SD -Trp a SD -Trp -Ade -Jeho desky, test pro bazální aktivace (Doplňkový Obr. 1). Kvasinkové kmeny obsahující konstrukty F1, M5 nebo Cter dávaly nejnižší aktivitu pozadí a byly použity jako návnada. Kvasinkové buňky obsahující tyto konstrukty byly transformovány s list, brambory komplementární DNA knihovna splynula s GAL4-AD v pAD-GAL4 vektor (Stratagene) a 1-3 × 106 nezávislé transformanty vybrané na SD -Leu -Trp -Ade -Jeho pozitivní interakce.

fragment DNA odpovídající Arabidopsis PIF4 full-délka proteinu byla generována pomocí PCR amplifikace s primery PIF4yf a PIF4yr a vložen do EcoRI místě droždí pGBKT7 a vektorů pGADT7. Konstrukce pro fúze Arabidopsis PIF3-GAL4BD a PIF3-GAL4AD zajišťoval P. křepelka.

deleční konstrukty pro proteiny DELLA a PIF4 byly získány inverzní PCR reakcí na konstrukty RGA-BD a PIF4-AD ve vektorech pBridge a pAD-GAL4. Konstrukce del1RGA a del2RGA byly generovány pomocí primerů RGAdel1 nebo RGAdel2 a pBridBam, které zavedou BamHI restrikční místo na každém konci. Pro generování konstrukcí del1PIF4, del2PIF4 a del3PIF4 byl jedinečný web XbaI v pad-GAL4 polylinker odstraněn vyplněním. Tento plasmid byl poté použit jako templát pro inverzní PCR reakce s primery PIF4del1, PIF4del2 nebo PIF4del3 a pGADXba, zavedení XbaI omezení místě na každém konci. Produkty PCR byly tráveny buď BamHI nebo XbaI, religated a transformovány do Escherichia coli, aby se získaly různé konstrukce. Tyto plazmidy byly přeměněny na kmen kvasinek AH109 a naneseny na destičky SD-4 pro stanovení interakce. aktivita β-galaktosidázy byla stanovena na kapalných kulturách těchto transformantů za použití substrátu ONPG a standardních podmínek protokolu.

Konstrukce ekvivalentní brambor RGA M5 fragment pro Arabidopsis DELLA geny RGA1 (At2g01570), GAI (At1g14920), RGL1 (At1g66350) a RGL3 (At5g17490) byly generovány pomocí PCR amplifikace s primer nastaví RGL1pGB-f/RGL1pGB-r, RGL3pGB-f/RGL3pGB-r, RGApGB-f/RGApGB-r a RGApGB-f/GAIpGB – r (Doplňující Tabulka 1). Tyto fragmenty byly vloženy do kvasnice vektor pGBKT7 pomocí restrikční enzymy BamHI/SalI pro RGL1, SalI/PstI pro RGL3 a BamHI/PstI pro RGA1 a GAI.

Pull-down testy

fragment DNA kódující Arabidopsis RGA full-délka protein byl získán pomocí PCR amplifikace s primery RGAgst-f a RGAgst-r a klonován do BamHI místa pZEX vektor, získat in-frame fúzi s GST kódování regionu. RGA-pZEX a prázdné pZEX vektor byl transformován do kmene E. coli BL21(DE3)pLysS (Stratagene) a kultury se tyto buňky pěstovány při 37 °C na D600 = 0.8. Exprese GST proteinů byla indukována 1 mM IPTG, za další 3 hodiny při 30 °C, a na extrakci proteinu a vazba na gluthathione-Sepharose korálky (Clontech) byla provedena podle protokolu dodaného výrobcem.

PIF4, PIF3 a karboxy-terminální phyA konstrukty v pGBKT7 vektoru byly použity jako šablony pro in vitro transkripce/translace, v přítomnosti 35S-methioninu, pomocí TnT system (Promega). Při každé reakci byla použita plazmidová DNA (1 µg). Pro pull-down, 10 µl překladu reakce byly inkubovány 30 min s RGA–GST a DPH korálky (1 µg proteinu vázán na korálky) v PBS, 0.05% tergitol, 10% glycerol. Kuličky byly důkladně promyty, resuspendovány do 2× zátěžového pufru a analyzovány SDS-PAGE pro vazbu na proteiny.

Přechodné výraz testy

fragmenty DNA kódující Arabidopsis full-délka PIF4 a RGA proteiny, a ΔRGA a del1RGA delece byly získány pomocí PCR amplifikace s páry primerů PIF4yf a PIF4yr, RGAgst-f a RGAgst-r, ΔRGA-f a RGAgast-r a del1RGA-f a RGAgst-r, a vložen do polilynker EcoRI nebo BamHI místa pJIT60 vektor, pod kontrolou 2×35S promotor. Fragment motivu g-box hlášený pomocí testů gel-shift jako cílový prvek pro rozpoznávání PIF434 byl fúzován s genem reportéra GUS a použit jako reportérský konstrukt. Nebyli jsme schopni detekovat PIF4-zprostředkované stimulace tohoto reportér se postavit, což naznačuje, že další nukleotidové sekvence obklopující CACGTG motivem může být požadována pro efektivní aktivaci. Hledat pořadatel prvek vhodný k použití v těchto testech, předběžné RNA profilování experimenty 35S-PIF4 a pif4 mutanti byly provedeny, proto identifikace LTP3 (At5g59320) jako silný upregulated přepis v 35S-PIF4 sazenice. Pořadatel regionu pro tento gen byl amplifikován pomocí primerů LT3p-f a LTP3p-r a vložen do EcoRI a BamHI místa pGUS vektor získat LTP3-GUS reportér postavit. Fúze 2×35S-luciferázy byla použita jako vnitřní kontrola. Arabidopsis buněk byla nanesena na filtrační papír a inkubovány přes noc na LT87 střední (4.4 g l-1 Murashige a Skoog soli + vitamíny, 0,5 g l-1 MES, 0,5 g l-1 NAA, 30 g l-1 sacharózy a 8 g. l-1 agaru). Dvě hodiny před bombardováním byly filtry přeneseny na médium LT87 s 200 mM mannitolem, aby se vyvolalo zatažení vakuoly. Srážení DNA a bombardování částic bylo provedeno pomocí urychlovače částic poháněného heliem (PDS-1000; Bio-Rad) podle pokynů výrobce. Buňky byly transformovány s 0,5 µg LTP3-GUS reportér plasmidu + 0,5 µg 2×35S-LUC vnitřního standardu, a to buď 2 µg pJIT60 prázdný vektor (LTP3), 1 µg 2×35S-PIF4 efektorové construct + 1 µg pJIT60 (PIF4), nebo 1 µg 2×35S-PIF4 a 2×35S-RGA, 2×35S-ΔRGA nebo 2×35S-del1RGA efektorové konstrukty (PIF4 + RGA, PIF4 + ΔRGA, PIF4 + del1RGA). Filtry byly převedeny na čerstvé LT87 desky (-GA) nebo k LT87 desky + 50 µM GA3 (+GA) a inkubovány po dobu 16 h. Buňky byly extrahovány v cell lysis buffer uvedené v Luciferase Assay System kit (Promega) a vyčistil centrifugací při 12000 g po dobu 5 min. Aktivita LUC byla stanovena podle kit a aktivity GUS stanovené fluorometrickým testem35. Aktivita promotoru LTP3 byla vypočtena jako poměr aktivity Gus k LUC v každém vzorku. Pro každé ošetření byly použity čtyři repliky.

RNA extrakce a reverzní transkriptázy (RT)–PCR

Pro genové exprese analýzy, celková RNA byla extrahována z 4-den-staré semenáčky pomocí guanidine HCl method36 a následně léčeni DNaseI (Roche), než čištění pomocí Qiagen RNeasy Mini kolony (Qiagen). RNA (1 µg) byl použit pro first-strand cDNA syntézu pomocí High Capacity cDNA Archivu Kit (Applied Biosystems) a 1,0 µl této reakce byl použit jako templát pro PCR amplifikaci. Primer nastaví AtLTP3-f/AtLTP3-r, Atexpan-f/Atexpan-r a Atactin8-f/Atactin8-r byly použity pro amplifikaci LTP3 (At5g59320), beta-expansin (At2g20750) a aktin-8 (At1g49240) přepisy.

Bimolecular fluorescenční komplementace (BiFC) testy

Full-délka otevřený čtecí rámec sekvence pro Arabidopsis PIF4 a RGA proteiny byly amplifikovány pomocí primerů PIF4YFP-f/ PIF4YFP-r a RGAYFP-f/ RGAYFP-r, resp. Produkty PCR byly klonovány do vektoru pENTR/D-TOPO (Invitrogen) a vloženy LR-reakcí (Invitrogen) do binárních vektorů pBiFC (F. Parcy) obsahující amino-nebo C-koncové fragmenty fluorescenčního proteinu eYFP (eYFPN a eYFPC). Všech osm možných párových kombinací tyto konstrukty byly transformovány do bakterie Agrobacterium tumefaciens a co-proniká do abaxial povrchu 2-3-týdenní-starý Nicothiana benthamiana rostliny jako described37. Protein p19 z rajčatového huňatého senzačního viru byl použit k potlačení umlčování genů. Kmeny agrobakterií obsahující konstrukce pBiFC a umlčující plazmid p19 byly pro infiltraci v poměru D600 0,7: 0,7: 1. Fluorescence byla vizualizována v epidermálních buněčných vrstvách listů po 2 dnech infiltrace pomocí fluorescenčního mikroskopu Leica DMR. Listy byly inkubovány s 1 µg ml-1 4′, 6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI) pro barvení jader.

PIF4/RGA–GFP co-immunoprecipitations

Co-immunoprecipitation studie RGA a PIF4 proteiny byly provedeny na 7-den-stará RGA-GFP–RGA transgenní seedlings10 pěstované pod bílé světlo. Sazenice byly buď inkubovány ve tmě nebo přeneseny do média obsahujícího PAC nebo GA a inkubovány po dobu 12 dalších hodin před extrakcí. Immunoprecipitation z ONZP–RGA bílkovin byla provedena při 4 °C po 6 h, pomocí anti-GFP protilátkou (Santa Cruz Biotechnology) v pufru obsahujícím 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl A 0,5% Triton X-100, PMSF (1 mM) a inhibitory proteáz (Sigma). Protein g agarosa (Sigma) byl použit k vysrážení imunoproteinových komplexů. Detekce PIF4 byla provedena protilátkou proti PIF4.

Chromatin immunoprecipitations a PCR amplifikace

Chromatin immunoprecipitation testy byly provedeny, jak je popsáno previously29. Sazenice PIF4-HA20 byly pěstovány na GM médiu po dobu 6 dnů za nepřetržitého červeného světla a poté byly přeneseny na desky obsahující buď GA nebo PAC a udržovány přes noc ve tmě. Pro imunoprecipitaci chromatinu byly použity sazenice (1,5–2 g) a 40 µl afinitní matrice anti-HA (Roche). Vysrážená DNA byla rozpuštěna v 50 µl TE a 0,5 µl bylo použito pro amplifikaci PCR pomocí primerů uvedených v doplňkové tabulce 1. PCR podmínky byly následující: 94 °C po dobu 2 min, 35 cyklů 94 °C 15 s, 55 °C po dobu 30 s a 72 °C po dobu 30 s, následuje 72 °C 7 min. Sonikovaná vstupní DNA (0,3%) byla použita pro kvantitativní kontrolu. Byly provedeny analýzy Western blot pro kvantifikaci množství získaného proteinu PIF4 po imunoprecipitaci chromatinu. Bloty byly imunodetekovány anti-HA peroxidázovou protilátkou s vysokou afinitou (Roche).

mikroskopie

testy stability proteinů byly provedeny pomocí laserového skenovacího systému Radiance 2100 (Bio-Rad) připojeného k mikroskopu Zeiss Axiovert 200. Pro excitaci GFP a chlorofylu byl použit argonový iontový laser při vlnové délce 488 nm a červená dioda při 637 nm. Kombinace použitých filtrů byla: rozdělovač paprsků 560 DCLPXR a emisní filtr HQ 515/30 pro GFP a HQ 660LP pro detekci chlorofylu. Snímky byly postupně pořízeny pomocí softwaru LaserSharp v5. 0 (Bio-Rad) a sloučeny pomocí obrazového softwaru LaserPix v.4 (Bio-Rad).

Gel shift assay

oligonukleotidy pLTP-WTf/r a pLTP-MUTf/r byly použity pro generování LTP3 sondy a specifické konkurentů používá v EMSA testy. Oligonukleotidy byly žíhané v 5× M omezení enzym pufr a na konci označeny pomocí fill-in s Klenowův. Pro bílkovinné extrakty, N. benthamiana listy byly infiltroval s kmeny Agrobacterium za 35S-PIF4–HA (PIF4) a 35S-RGA–GFP (RGA) konstrukce nebo s 1:1 směs (PIF4 + RGA) z těchto kmenů a s p19 postavit, jak je popsáno výše. List extrakty byly získány homogenizace v pufru s vysokým obsahem solí (20 mM HEPES, pH 7.9, 0,5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, o 0,5% nonidet P-40, 1 mM DTT, + inhibitor proteázy), zúčtování centrifugací a následnou dialýzou proti 1× BB (20 mM HEPES, pH 7.9, 0,1 M KCl, 1 mM EDTA, 0.05% nonidet P-40, 0,5 mM DTT, 10% glycerol). Přítomnost ekvivalentních množství proteinů PIF4 a RGA v extraktech byla hodnocena detekcí western blot s protilátkami anti-HA (Roche) a anti-GFP (Santa Cruz). Pro reakci EMSA bylo použito zvyšující se množství těchto extraktů (5,0, 10,0, 15,0 µl). Extrakty byly inkubovány po dobu 15 minut při pokojové teplotě s označenou sondou a 100 ng poly (dI-dIC) ve 20 µl 1× BB a odděleny 6% stránkou v 0,5× TBE. Pro specifickou soutěž byl použit 100násobný přebytek žíhaných oligonukleotidů divokého typu (WT) a mutantů (MUT).