seriell passage av lungmetastaser in vivo berikar för metastatisk potential
PDX-linjen WU-BC3 genererades genom engrafting av brösttumörceller från en patient med metastatisk TNBC i de humaniserade bröstfettkuddarna (MFP) av NOD/NPJ SCID möss möss.26,27 vi konstruerade dessa tumörceller för att stabilt uttrycka Click Beetle Red luciferas (CBR-Luc), mCherry och en shRNA specifik för p53 (shA2) för att skapa PDX-linjen BC3_A2 (tidigare känd som BC3-p53KD28) (kompletterande Fig. 1a). Vi visade att tumörceller metastasiserades från MFP till fysiologiskt relevanta platser inklusive lung -, lever -, ben -, hjärn-och lymfkörtlar.28 lungmetastaser (P0) isolerades från replikerade möss, poolade och engraftade i MFP: erna hos mottagarmöss. De resulterande lungmetastaserna (P1) isolerades, poolades och ingraverades i MFP: erna hos ytterligare möss. Lungmetastaserna från dessa möss (P2) samlades också in och poolades (kompletterande Fig. 1b). Vi utförde bioluminescensavbildning (BLI) av lungor, ben och lever vid nekropsi för att kvantifiera den relativa storleken på metastaser vid varje passage (kompletterande Fig. 1c). Seriell Passage berikad för tumörceller med ökad kapacitet att metastasera till alla platser (kompletterande Fig. 1D-f, h) och krävde att möss skulle avlivas tidigare (kompletterande Fig. 1i). Däremot resulterade seriella passagerande tumörer mellan MFP: er inte i ökad lungmetastas (kompletterande Fig. 1g), vilket indikerar att förvärv av förbättrad metastatisk kapacitet inte bara var en följd av seriellt passagerande tumörer in vivo. Vidare uppvisade tumörceller med förbättrad metastatisk kapacitet inte en signifikant ökning av tillväxtegenskaper när de isolerades från MFP: er och placerades tillbaka i MFP: erna hos mottagarmöss (kompletterande Fig. 1j). Sammantaget visar dessa resultat att seriell passage av tumörceller från lungor till MFP i denna modell berikar för metastatisk potential men inte organspecifik homing.
Mesenkymalt genuttryck reduceras i lungmetastaser i förhållande till MFP-tumörer
för att identifiera förändringar i genuttrycksmönster som åtföljer metastasering utförde vi RNA-sekvensering (RNAseq) på lungmetastaser (P0 och P2) och MFP (P0 och P2) tumörer (Fig. 1a och kompletterande Tabell 1). Efter att ha subtraherat RNAseq läser kartläggning till mustranscriptome användes endast mänskliga transkriptläsningar för nedströmsanalyser. Huvudkomponentanalys (PCA) avslöjade minskad diskordance bland biologiska replikat med upprepad passage in vivo, eftersom biologiska replikat av P2-tumörprover grupperade närmare varandra än med andra delpopulationer analyserade (Fig. 1b). Genuppsättningsanrikningsanalys (GSEA) avslöjade att EMT var den mest signifikant nedreglerade vägen i både P0-och P2-lungmetastaser i förhållande till MFP-tumörer (Fig. 1c). TGF-oc-signalering, som reglerar EMT, var också signifikant nedreglerad i både P0-och P2-lungmetastaser (Fig. 1c).
PDX lungmetastas signaturer identifierar gener som inte regleras i metastaser. en schematisk representation av MPF-tumörer och lungmetastaser isolerade för RNAseq. B Huvudkomponentanalyser (PCA) från RNAseq-data genererade från MFP-tumörer och lungmetastaser som används i denna studie. Varje datapunkt representerar ett prov från en enskild mus. C GSEA-väganalys på den berikade lungmetastassignaturen (P2); topp 5 ned (blå)- och upp (röd)reglerade processer visas. NES, normaliserad anrikningspoäng. Rutor anger FDR <0.1 för statistisk signifikans. Anrikningsdiagram för epitelial mesenkymalövergång (EMT) och TGF-Bisexuell signalering för P0 och P2 visas i den högra panelen. p < 0,001 för EMT-och TGF-säkerhetssignalering vid P0 och P2. d qRT-PCR-analys av vimentinuttryck i bc3_a2 MFP-tumörer och metastatiska subpopulationer isolerade från lungan. Parade t-test, p = 0,02 för P0 lunga, p < 0,001 för P2 lunga. Varje datapunkt representerar en mus. Felfält representerar sem av biologiska replikat. Se även kompletterande Fig. 2. e IHC-färgning utfördes på de angivna vävnadssektionerna med användning av en antikropp som känner igen den humana specifika formen av vimentin. Skala staplar indikerar 100 oc. m. f vattenfall plot visar uttryck av EMT gener i P0 och P2 lungmetastaser jämfört med motsvarande MFP tumörer. p-värden anges i Tilläggstabell 1. Prover från minst tre oberoende möss inkluderades för RNAseq-analyser
kvantitativ realtid (qRT-PCR) utfördes för att övervaka expression av vimentin, en mesenkymmarkör, i MFP-tumörer och lungmetastaser genom seriell Passage. Vimentinuttryck uppvisade ett dynamiskt mönster med högre uttryck i MFP-tumörer relativt motsvarande lungmetastaser vid varje passage (Fig. 1D) och till levermetastaser vid P0 (kompletterande Fig. 2a). Vimentinproteinnivåer rekapitulerade detta dynamiska mönster (Fig. 1e). Ytterligare EMT-gener nedreglerades också i lungmetastaser i förhållande till motsvarande MFP-tumörer (Fig. 1f). Uttryck av den mesenkymala markören CDH2 (genen som kodar för N-cadherin) följde samma mönster som vimentin (kompletterande Fig. 2B), medan uttryck av epitelmarkören CDH1 (genen som kodar för E-cadherin) uppvisade en invers trend (kompletterande Fig. 2c). Co-engrafted mänskliga stromala fibroblaster rensades vid tiden för tumörskörd (kompletterande Fig. 3a-f), utesluter möjligheten att de bidrog till uttrycket av mesenkymala markörer i MFP-tumörer. Sammantaget visar dessa resultat att tumörer nedreglerar uttryck av mesenkymala gener som en gång etablerats på metastatiska platser.
bestämning av bibliotekets komplexitet för hög genomströmningsförstärkning av funktionsskärmen
en hög genomströmningsförstärkningsfunktion (GOF)-skärm utformades för att identifiera funktionella drivrutiner för metastaser från vår P2-lungmetastaser signatur. HOXA1,en känd förare av metastaser, 29 fungerade som en positiv kontroll för skärmoptimering, och GFP användes som en negativ kontroll. Bc3_a2-celler omvandlades med lentivirus-kodning antingen HOXA1 eller GFP, och infekterade tumörceller blandades i olika förhållanden (kompletterande Fig. 4a). Blandade populationer av tumörceller ingraverades sedan i MFP: erna hos mottagarmöss, och BLI användes för att göra lungmetastaser vid tidpunkten för nekropsi (kompletterande Fig. 4b). I en andra uppsättning experiment användes den metastatiska föraren ID19 i kombination med GFP, men i detta fall injicerades blandade populationer av tumörceller i mottagarmössens svansven för att modellera de sista stadierna av metastaser (kompletterande Fig. 4c). En signifikant ökning av fotonflödet observerades från tumörer med ett HOXA1: GFP eller ID1:GFP-förhållande på 1: 10. Dessa komplexitetstester visade att en bona fide metastasisdrivrutin kunde detekteras på vår skärm om den poolades med 9 Icke-förare öppna läsramar (ORFs), men en pool av en förare med 19 icke-förare maskerade vår förmåga att upptäcka föraren. Baserat på dessa resultat begränsade vi vår poolstorlek till 12 ORFs.
high throughput gain-of-function screening in vivo identifierar kandidatfunktionella drivrutiner för TNBC-metastas
för att bestämma vilka av de uppreglerade generna från P2-lungmetastassignaturen som kunde driva lungmetastaser, designade vi anpassade streckkodade lentivirala bibliotek som kodar för ORF: erna för de 230 gener som mest uppreglerades i lungmetastaser. ORF: er uttrycktes individuellt i bc3_a2-celler så att varje cellinje uttryckte en enda ORF, celler poolades sedan i grupper om 12 och pooler implanterades i MFP: erna hos mottagarmöss (n = 10 möss per pool, Fig. 2a). En kontrollplasmid som uttrycker GFP inkluderades i varje pool för att mäta inneboende metastas i denna TNBC-modell. Varje ORF var associerad med en unik DNA-streckkod. En referenspellet av poolade celler var snäppfryst för att bekräfta lika representation av varje ORF vid tidpunkten för tumörimplantation. Tretton veckor valdes som studiens slutpunkt eftersom HOXA1, men inte GFP-Uttryckande tumörer, metastaserade till lunga vid denna tidpunkt (kompletterande Fig. 5a). Tretton veckor efter engraftment utsattes lungorna för BLI ex vivo (kompletterande Fig. 5A) isolerades metastatiska lesioner och genomiskt DNA (gDNA) extraherades och användes som en mall för qPCR för att förstärka unika streckkodsregioner associerade med varje ORF (kompletterande Fig. 5b). MFP-tumörer isolerades också och utsattes för dessa analyser (Fig. 2a). Representationen av varje streckkodad ORF i MFP i förhållande till referensprovet bestämdes för varje pool (Fig. 2b; kompletterande fikon. 5c, d). Representation i lungan normaliserades sedan till anrikning i MFP vs. referensen (Fig. 2b, c). Metastasförare segregerade i tre grupper, inklusive de berikade i både lungor och MFP (Fig. 2b, övre högra kvadranten och kompletterande Fig. 5c), de berikade uteslutande i MFP (Fig. 2B, nedre högra kvadranten) och de berikade uteslutande i lungor (Fig. 2b, övre vänstra kvadranten och Fig. 2c). Celler som uttryckte GFP berikades i lungmetastaser i några av poolerna och den genomsnittliga anrikningspoängen för GFP i lungan var ungefär 5 (kompletterande Fig. 5e). Därför använde vi detta som en anrikningspoäng cutoff för att definiera en sann träff i vår skärm och identifierade 44 gener som selektivt berikades i lungmetastaser i förhållande till primära tumörer. Dessa träffar rankades efter anrikningspoäng (Fig. 2c och kompletterande Tabell 2). Bland de fem bästa träffarna var CEACAM5 den enda vars uttryck i primära tumörer visade sig förutsäga dålig överlevnad hos bröstcancerpatienter (kompletterande Fig. 6a). Därför undersökte vi vidare ceacam5: s funktionella roll vid metastasering av bröstcancer.
high throughput gain-of-function screening in vivo identifierar funktionella drivrutiner för metastaser. en schematisk föreställande format som används för gain-of-function (GOF) skärm. Se även kompletterande Fig. 5. ORF, öppna läsramen. Tio möss implanterades i varje kohort. B Scatter-plot som visar relativ representation av varje ORF i MFP-tumörer efter normalisering till referensen (x-axeln) och i lungor i förhållande till MFP-tumörer (y-axeln). Metoden användes för kvantifiering av qPCR-data. CEACAM5 visas i rött. C-gener berikade i lungmetastaser men inte MFP-tumörer rankades i fallande ordning för anrikning i lunga. Prickad linje indikerar anrikning poäng cutoff. Se även kompletterande Fig. 5 och kompletterande Tabell 2
bekräftelse av förbättrat CEACAM5-uttryck i ytterligare metastatiska PDX-modeller
Vi fann att CEACAM5-uttryck reglerades dynamiskt eftersom metastatiska subpopulationer serievis passerades mellan lungor och MFP in vivo (Fig. 3a), bekräftar resultaten från RNAseq (kompletterande Tabell 1 och kompletterande Fig. 6b). På samma sätt var ceacam5-uttrycket högre i levern (kompletterande Fig. 7a) och hjärna (kompletterande Fig. 7B) metastaser i förhållande till motsvarande MFP-tumörer. CEACAM5 – proteinnivåerna var också högre i lungmetastaser i förhållande till MFP-tumörer (Fig. 3b). Ökningen i CEACAM5-uttryck i metastatiska lesioner var inte beroende av p53-tystnad i denna PDX-linje, eftersom lungmetastaser från den isogena PDX-linjen som uttryckte vildtyp p5326,30 visade också högre uttrycksnivåer av CEACAM5 (kompletterande Fig. 7c).
CEACAM5 är uppreglerad i metastaser, och dess uttryck är omvänt korrelerat med vimentin i PDX-modeller av TNBC. ett uttryck av CEACAM5 i MFP-tumörer och metastatiska lesioner av möss engraftade med bc3_a2-tumörer bestämdes av qRT-PCR. Parade t-test, p < 0,001 för P0 lunga, P2 MFP-tumör och P2 lunga. Varje punkt representerar en enskild mus. Felfält representerar sem av biologiska replikat. Se även kompletterande Fig. 7. B MFP-tumörer och motsvarande metastaser från möss engraftade med bc3_a2-tumörer analyserades av IHC med användning av en ceacam5-antikropp. Skala staplar indikerar 100 oc. m. C-uttryck av CEACAM5 i MFP-tumörer och metastatiska lesioner av möss engraftade med PIM001-P-tumörer bestämdes av qRT-PCR. Data presenteras på en loggskala. Parat t-test, p < 0,001. Varje punkt representerar en enskild mus. Felfält representerar sem av biologiska replikat. d MFP-tumörer och motsvarande lungmetastaser från möss engraftade med PIM001-P-tumörer analyserades av IHC med användning av en ceacam5-antikropp. Skala staplar indikerar 100 oc. m. E, F IHC av seriella tumörvävnadssektioner från möss engraftade med BC3_A2 (e) eller PIM001-P (f) färgade med antikroppar specifika för CEACAM5 (övre panelen) eller vimentin. Skala staplar indikerar 100 oc. m. g-uttryck av CEACAM5 (övre panelen) eller vimentin (nedre panelen) bestämdes i en panel av bröstcancercellinjer. Felfält representerar sem av tekniska triplikat. h IHC utfördes för att övervaka fosforylerad p38 i MFP-tumörer och lungmetastaser av bc3_a2-möss. Skala staplar indikerar 100 occurm
en andra uppsättning PDX-modeller av TNBC (PIM001) utvärderades för att bestämma om ökningen av CEACAM5 i metastatiska lesioner var en allmän egenskap av metastasering. PIM001-P etablerades från primärtumören treatment-na, en patient med metastatisk TNBC, medan PIM001-M etablerades från dermal metastas från samma patient. Pim001-p tumörceller konstruerades för att uttrycka både CBR-Luc och mCherry och sedan engrafted i MFP: erna hos mottagarmöss. Vid tidpunkten för nekropsi isolerades MFP-tumörer och lungmetastaser. CEACAM5-uttrycket ökades vid båda mRNA-nivåerna (Fig. 3C) och proteinnivåer (Fig. 3D) i PIM001-P lungmetastaser jämfört med motsvarande MFP-tumörer. Intressant nog var ceacam5-proteinnivåerna högre i PDX MFP-tumörer etablerade från patientens dermala metastas (PIM001-M) jämfört med PDX MFP-tumörer etablerade från hennes primära brösttumör (PIM001-P) (kompletterande Fig. 7d). Sammantaget visar dessa resultat att höjning av CEACAM5 är en vanlig egenskap hos metastaser i PDX-modeller av TNBC.
ceacam5-uttrycket är omvänt korrelerat med vimentinuttryck och fosforylering av p38
eftersom uttrycket av CEACAM5 i PDX-modeller var omvänt korrelerat med uttrycket av vimentin (Fig. 1d, 3a; kompletterande fikon. 2A och 7a, b), immunohistokemi (IHC) användes för att övervaka lungmetastaser och MFP-tumörer för relativa nivåer av vimentin och CEACAM5. Proteinnivåer korrelerade med mRNA-nivåer i båda PDX-modellerna (Fig. 3e, f). Vimentinuttryck var också omvänt korrelerat med CEACAM5-uttryck i en panel av bröstcancercellinjer (Fig. 3g). Det serin / treoninspecifika proteinkinas p38alpha (även känt som MAPK14, nedan kallat p38) fosforyleras under EMT.31 intressant, fosforylerad (aktiv) p38 korrelerade med höga expressionsnivåer av vimentin i MFP-tumörer, och P38 fosforylering minskade i lungmetastaser där vimentinnivåerna var låga (Fig. 3h). Sammantaget visar dessa data att CEACAM5-uttryck är omvänt korrelerat med uttryck av EMT-markörer i lungmetastaser.
ektopisk överproduktion av CEACAM5 inhiberar TGF-Nigerias signalering och uttryck av EMT-markörer
Med tanke på att CEACAM5-uttrycket omvänt korrelerat med mesenkymalstatus utvärderade vi om CEACAM5 hade en direkt roll för att reglera uttrycket av mesenkymala markörer. Bc3_a2-celler konstruerade för att överproducera mänsklig CEACAM5 eller GFP som en negativ kontroll (kompletterande Fig. 8A, b) undersöktes för uttryck av VIMENTIN och CDH2/n-cadherin (mesenkymala markörer) och CDH1/E-cadherin (epitelmarkör). Överuttryck av CEACAM5 ledde till ökat uttryck av CDH1 (kompletterande Fig. 8c) och minskat uttryck av CDH2 (kompletterande Fig. 8d) och vimentin (kompletterande Fig. 8e). Dessutom minskade och fördröjde överproduktion av CEACAM5 TGF-oc-medierad fosforylering av SMAD i bc3_a2-celler (Fig. 4a, c, kompletterande Fig. 9A) och P38 fosforylering i båda bc3_a2-cellerna (Fig. 4a, b, kompletterande Fig. 9A) och MDA-MB-231 celler (kompletterande Fig. 8F, kompletterande Fig. 9b). Slutligen försenade överproduktionen av CEACAM5 TGF-tuberkulininducerad EMT som bedömts med E-cadherin och vimentinuttryck (Fig. 4D, kompletterande Fig. 9c). Dessa resultat tyder på att CEACAM5 reglerar EMT negativt och identifierar en funktion för CEACAM5 vid metastasering av bröstcancer.
CEACAM5 överproduktion nedreglerar expression av mesenkymala markörer och försämrar TGF-säkerhetssignalering och försämrar TGF-säkerhetssignalering. a bc3_a2-celler konstruerade för att överproducera CEACAM5 eller GFP odlades i närvaro eller frånvaro av 1 ng/ml TGF-GHz under de angivna tidsperioderna. Cellulära lysater utsattes för Western blotting för de angivna proteinerna. B, C Histogram visar vikförändringen (loggskalan) i fosforyleringsstatus för p38 (b) eller Smad2/3 (c) jämfört med den vid tidpunkt 0 för celler som uttrycker GFP. Felfält representerar SEM av minst tre oberoende experiment. d bc3_a2-celler som uttrycker GFP eller CEACAM5 odlades i närvaro eller frånvaro av 1 ng/ml TGF-GHz under de angivna tidsperioderna. Cellulära lysater utsattes för Western blotting för de angivna proteinerna. Alla resultat är representativa för minst tre oberoende experiment. Se även kompletterande fikon. 8 och 9
överproduktion av CEACAM5 främjar metastatisk utväxt och minskar EMT in vivo
EMT är associerad med minskad cellulär proliferation.19 således föreslog ceacam5s förmåga att hämma EMT att det kan fungera för att främja tumörutväxt vid metastatiska ställen. För att testa denna hypotes injicerades bc3_a2-celler konstruerade för att överproducera CEACAM5 eller GFP (kontroll) i mottagarmössens svans för att övervaka effekterna av CEACAM5-överproduktion på tumörtillväxt i lungan. Överuttryck av CEACAM5 ledde till ökad tumörtillväxt i lungorna (Fig. 5a och kompletterande Fig. 10a), minskat uttryck av vimentin vid proteinnivån (kompletterande Fig. 10B) och minskad fosforylering av p38 (Fig. 5d, e). Minska CEACAM5-nivåerna i BC3_A2 med två olika shRNAs (Fig. 5b) hade motsatt effekt genom att transducerade celler växte långsammare i lungorna än kontrollceller efter svansveninjektion (Fig. 5c och kompletterande Fig. 10c). Dessutom resulterade ceacam5 knockdown i ökat lesionsnummer men minskad lesionsstorlek (kompletterande Fig. 10d, e). Dessa resultat tyder på att ceacam5-tystnad främjar EMT och tumörcellsextravasation samtidigt som den hämmar metastatisk utväxt.
uttryck av CEACAM5 främjar tillväxt av lungmetastaser. a bc3_a2-celler som överproducerade CEACAM5 eller GFP injicerades i svansvenerna hos möss. BLI användes för att kvantifiera fotonflöde i lungorna hos möss vid de angivna tidpunkterna. Parat t-test, p = 0,03. Felstänger representerar sem av biologiska replikat (n = 5 möss per grupp). B BC3_A2-celler som uttrycker kontroll shRNA (shLuc) eller två olika shRNAs (#3 och #5) specifika för CEACAM5 utsattes för qRT-PCR för att övervaka CEACAM5-uttryck. Felfält representerar sem av tekniska triplikat. Se även kompletterande Fig. 10. C bc3_a2-celler som uttrycker shLuc eller två olika CEACAM5 shRNAs injicerades i svansvenerna hos möss. BLI användes för att kvantifiera fotonflöde i lungorna hos möss vid de angivna tidpunkterna. Parade t-tester, p = 0,01 för sh#3 och p < 0,001 för sh#5. Data normaliserades till den ursprungliga tidpunkten och presenteras på en loggskala. Felstänger representerar sem av biologiska replikat (n = 5 möss per grupp). d bc3_a2-celler som överproducerade CEACAM5 injicerades i mössens svansvener och lungorna isolerades och utsattes för IHC med de angivna antikropparna. Skala staplar indikerar 100 oc. m. e-celler som färgas positivt för CEACAM5, vimentin eller p-p38 i vävnadssektionerna representerade i panel d kvantifierades med hjälp av Vectra 3.0 automatiserat bildsystem. Parade t-test, p = 0,0008 för CEACAM5, p = 0,03 för vimentin och p = 0,03 för p-p38. Felfält representerar SEM av minst tre oberoende biologiska replikat. f RNA isolerat från bc3_a2-celler som överproducerar CEACAM5 eller GFP och odlades antingen in vitro eller isolerades från lungan efter svansveninjektion (in vivo, a, d) utsattes för gsea-väganalys (vänster två kolumner). Topp 5 nedreglerade (blå) och topp 5 uppreglerade (röda) processer visas. Rutor anger FDR <0.1 för statistisk signifikans. NES (normaliserad anrikningspoäng). Betydelsen av dessa vägar i P0 och P2 MFP tumörer vs. motsvarande lungmetastaser visas för jämförelse (höger två kolumner). Data representeras av biologiska triplikat. Se även kompletterande Fig. 11
för att övervaka hur överproduktion av CEACAM5 påverkade genuttryck odlades bc3_a2-celler konstruerade för att överproducera CEACAM5 eller GFP in vitro eller isolerades från lungan efter injektion av svansvenen (in vivo). RNA isolerades och utsattes för RNAseq. Differentiell genuttrycksanalys utfördes och GSEA identifierade EMT som den enda cancermärkevägen som signifikant nedreglerades både in vitro och in vivo av CEACAM5 överproduktion (Fig. 5f, kompletterande Fig. 11). Detta resultat liknar det som observerats i P0-och P2-lungmetastaser (Fig. 1c, 5f). Sammantaget indikerade dessa data att uppreglering av CEACAM5-uttryck i metastatiska lesioner inducerar MET och förbättrar utväxten av metastatiska tumörceller på sekundära platser.
ceacam5-uttrycket uppregleras i metastatiska lesioner från bröstcancerpatienter
därefter bedömdes CEACAM5-uttrycket i metastatiska lesioner och brösttumörvävnad erhållen från patienter med bröstcancer. IHC-färgning på en matchad vävnadssats bestående av en primär tumör och en lungmetastas från en patient med bröstcancer (kompletterande tabell 3) avslöjade högre CEACAM5-nivåer i lungmetastasen i förhållande till den primära brösttumören (Fig. 6a och kompletterande Fig. 12a). För att utöka dessa analyser, en vävnadsmikroarray (TMA) bestående av lungmetastaser från 25 bröstcancerpatienter (kompletterande fikon. 12b, c och kompletterande tabell 3) färgades för CEACAM5 (kompletterande Fig. 12B), och färgningsintensitet tilldelades en poäng (Fig. 6b). Denna poängmetod applicerades också på en TMA från Human Protein Atlas bestående av humana brösttumörer färgade för CEACAM5.32 majoriteten av lungmetastaser uttryckte höga nivåer av CEACAM5 (Fig. 6c) jämfört med brösttumörer (Fig. 6d), vilket visar att CEACAM5 var högre i metastatiska lesioner jämfört med primära brösttumörer.
ceacam5-proteinnivåerna är förhöjda i metastatiska lesioner hos bröstcancerpatienter och är omvänt korrelerade med uttryck av vimentin. A den primära tumören och motsvarande lungmetastas från en patient med bröstcancer utsattes för IHC för att övervaka CEACAM5-nivåer. Skala staplar indikerar 100 oc. m. b en tumörvävnadsmikroarray (TMA) bestående av lungmetastaser från 25 bröstcancerpatienter utsattes för IHC med en CEACAM5-specifik antikropp och färgningsintensitet fick poäng. Representativa bilder visas. Skala staplar indikerar 100 oc. m. C poängsystemet i b applicerades på TMA bestående av lungmetastaser från 25 bröstcancerpatienter för att bedöma relativa CEACAM5-nivåer. d poängsystemet i b applicerades på en TMA från humant Proteinatlas bestående av 25 primära brösttumörer för att bedöma relativa CEACAM5-nivåer. e den primära tumören och motsvarande lungmetastas från en patient med bröstcancer (från a) samfärgades för CEACAM5 och vimentin och analyserades med immunofluorescensmikroskopi. Skala staplar indikerar 100 oc. m. f-celler som färgas positivt för CEACAM5, vimentin eller båda i vävnadssektionerna representerade i e kvantifierades med hjälp av Vectra 3.0 automatiserat bildsystem. g TMA bestående av lungmetastaser från 25 bröstcancerpatienter samfärgades för CEACAM5 och vimentin och analyserades med immunofluorescensmikroskopi. Representativa bilder visas. Skala staplar indikerar 100 oc. m. h-celler som färgas positivt för CEACAM5, vimentin eller båda i vävnadssektionerna som visas i g kvantifierades med hjälp av Vectra 3.0 automatiserat bildsystem. Se även kompletterande Fig. 12
vi bedömde därefter den matchade vävnadssatsen för samuttryck av CEACAM5 och vimentin. Samfärgning för CEACAM5 och vimentin avslöjade högre nivåer av CEACAM5 i lungmetastasen i förhållande till matchad brösttumör, och det omvända färgningsmönstret observerades för vimentin (Fig. 6e, f). Dessutom uppvisade en mindre population av tumörceller samfärgning för både CEACAM5 och vimentin (Fig. 6f). De celler som färgas positivt för båda proteinerna kan representera celler i ett hybrid EMT/MET-tillstånd.33 TMA bestående av lungmetastaser från 25 bröstcancerpatienter visade också en omvänd korrelation mellan ceacam5 och vimentinfärgning (Fig. 6g, h; kompletterande fikon. 12a-e). Dessa resultat bekräftade slutsatser gjorda med våra PDX-modeller av TNBC och visade att CEACAM5-uttryck är omvänt korrelerat med vimentinuttryck i primära brösttumörer och metastatiska lesioner. Sammantaget tyder dessa resultat på att CEACAM5 främjar MET för att underlätta tumörutväxt vid metastatiska ställen (kompletterande figur 12a, b).
