alla metoder i human-och djurstudier utfördes i enlighet med relevanta institutionella riktlinjer och föreskrifter.

isolering och odling av plast vidhäftande MSC och CD271 immunopositiva MSc från fettvävnad

Efter etiskt godkännande från National Health Service (NHS) Health Research Authority (LREC nummer 12/EE/0136) och informerat samtycke från alla givare isolerades PA MSC och CD271+ MSc från AT som hade skördats som kirurgiska avfallsprodukter. AT maldes och behandlades med 0.3 U/ml kollagenas (Sigma, Dorset UK) i två timmar vid 37 CCG, varefter Dulbeccos modifierade Örnmedium (DMEM) kompletterades med 20% (v/v) fetalt kalvserum (FCS) och 1% (v/V) penicillin och streptomycin (allt från PAA, Yeovil, Somerset, UK) tillsattes och den digererade beredningen centrifugerades vid 600 g i 10 minuter. Den resulterande pelleten suspenderades på nytt i DMEM kompletterat med 10% (v/v) FCS och 1% (v/v) penicillin och streptomycin, dvs. standardodlingsmedium och passerade genom en 100 kg cellsil (BD Biosciences, Berkshire, UK). Filtratet centrifugerades på nytt vid 600 g i 10 minuter och pelleterade celler suspenderades på nytt i 5 ml standardodlingsmedium och passerade genom en cellsil på 40 kg. Den resulterande cellsuspensionen behandlades sedan med Erytrocytlysbuffert (Miltenyi Biotech, Surrey, UK) i 10 minuter vid rumstemperatur. För varje vid beredning isolerades MSc från de mononukleerade cellerna som var närvarande efter erytrocytlys genom deras ökade vidhäftning till vävnadskulturplast8 eller genom magnetisk associerad cellsortering (MACS) för CD271 immunopositivity14. Dessa celler odlades expanderat i standardodlingsmedium i en fuktad atmosfär vid 37 kcal C med rutinmässig passage genom trypsinisering vid 80% sammanflöde. PA MSC och CD271 + MSC vid passager II-III användes för alla efterföljande experiment. Flödescytometri användes för att bedöma anrikningen för CD271 + – celler (med hjälp av MACS-teknik), där de nyligen isolerade cellerna lagrades vid -80 CCG över natten efter isolering och sedan tinades och omedelbart immunostained för CD271; för alla prover var >90% av cellerna CD271 immunopositiva vid denna tidpunkt (data visas inte).

in vitro differentieringsprotokoll

differentieringskapaciteten hos PA och CD271 + MSC för att bilda osteocyter,kondrocyter och adipocyter bedömdes som beskrivet tidigare8, 45. Kort sagt, för osteogenes behandlades monoskiktskulturer av MSC med 10 nM dexametason, 50 ng/ml askorbinsyra och 1 mM beta-glycerofosfat (kontra bärarkontroller) var 2-3: e dag under en period av 4 veckor, varefter kulturerna skördades genom fixering och färgades för alkalisk fosfatasaktivitet enligt följande: celler fixerades med 10% neutral buffertformalin i 10 minuter. Under tiden framställdes färgningslösningen genom att placera 25 mg naftolfosfat (Naftol AS-MX fosfat: Sigma) i 0,5 ml dimetylformamid. Denna lösning blandades med 50 ml 0,2 m Tris-HCl-buffert innehållande 50 mg snabb röd TR (Sigma). Efter blandning väl filtrerades den slutliga lösningen med användning av Whatman nr 1 filterpapper (Whatman). Den fixativa lösningen avlägsnades sedan och celler tvättades med PBS, därefter tillsattes 1 ml av färgningslösningen till varje brunn under 1 timme. slutligen avlägsnades fläcken och digitaliserade bilder fångades med ett inverterat mikroskop. Differentiering längs den osteogena linjen utvärderades ytterligare genom ökad mängd alkalisk fosfatasaktivitet i differentierade celler jämfört med odifferentierade celler med användning av ett kommersiellt tillgängligt kit (Biovision, USA) och genom att följa tillverkarens protokoll; i korthet homogeniserades celler i analysbufferten. De homogeniserade cellerna centrifugerades sedan för att avlägsna olösligt material vid 13 000 g i 3 minuter. Sedan laddades 80 occyl av var och en av proverna i separata brunnar på en 96 brunnsplatta. Sedan tillsattes 50 oc 5 mM pnpp-lösning till varje provbrunn. Efter ett blandningssteg genom pipettering upp och ner, brunnarna inkuberades vid 25 C i 60 minuter. En standardkurva genererades genom utspädning av 40 oc h 5 mM pNPP till 160 oc h analysbuffert för att generera 1 mM pnpp-standard. Sedan laddades 0, 4, 6, 12, 16 och 20 oC av denna standardlösning i en 96 brunnsplatta för att generera 0-20 nmol/ml pNPP-standarder som kunde mätas med spektrofotometri. För kondrogenes bereddes cellpellets i DMEM/high glucose (Sigma) kompletterat med 100 nM dexametason (DEX), 37.5 oc/ml askorbat-2-fosfat, 1% (vol/vol) insulin, transferrin och selen (ITS-X100; Sigma) och 10 ng/ml transformerande tillväxtfaktor-oc-11 (TGF-oc-1) (PeproTech, London, Storbritannien), och penicillin och streptomycin. Kontrollkulturer behandlades med DMEM/hög glukosmedia med bärare ensamma, dvs metanol, sterilt vatten och BSA vid lämpliga utspädningar. Vid dag 28 undersöktes kondrogen differentiering histologiskt genom att fixera pelletsna i 10% neutralt buffrat formalin och sedan bädda in i paraffin-och skärvävnadssektioner, som färgades med toluidinblått (Sigma) som en markör för proteoglykansyntes8. Dessutom mättes nivån av glykosaminoglykan som utsöndrades i det differentierande mediet under de senaste 24 timmarna av odling före skörd vid dag 28 Med användning av DMMB-analysen. DMMB-analysprotokollet anpassades från metoden för Farndale et al., 1986 enligt följande46: (i) dmmb-färglösningen framställdes genom tillsats av 3.04 g glycin, 2,37 g NaCl och 16 mg 1,9 DMMB till 1 liter avjoniserat vatten; ii) pH-värdet justerades till 3,0 med saltsyra och färgämneslösningen lagrades i en brun flaska; iii) 50 occyl alikvoter av odlingsmedium som skördats från de cellfröna ställningarna vid dag 28 tillsattes i tre exemplar till en 96 brunnsplatta; iv) 200 occol av dmmb-färgämneslösningen tillsattes till odlingsmediet och absorbanceffekten bedömdes omedelbart vid 540 nm. Chondroitinsulfat (CS) från hajbrosk (Sigma) användes för att tillhandahålla en standardkurva för absorbance (0-40 kg/ml, CS) från vilken GAG-innehållet i proverna av odlingsmedium beräknades. Nivåerna av absorbans för GAG-innehåll i proverna av odlingsmedium normaliserades för att redogöra för bakgrundsabsorbanseresultatet från närvaron av fenolröd i mediet genom att lösa upp standarderna i DMEM-medium. För adipogenes bibehölls MSC-kulturer i odlingsmedier innehållande 1 GHz DEX, 0.5 mM 3-isobutyl-metylxantin (Sigma), 1% insulin, transferrin och selen (ITS-X 100 förblandning, PAA) och 100 oc-m indometacin (Sigma), i 28 dagar vid 37 C-C och 5% CO2, som tidigare beskrivts47. Kontrollceller bibehölls i komplett media med bärare. Differentiering undersöktes med användning av Oljeröd o-färgning av lipiddroppar. Celler fixerades i 10% neutral buffertformalin i 1 timme varefter färgningslösningen tillsattes. Relativ oljeröd o-ackumulering mättes efter behandling med 100% isopropanol i 15 minuter och avläsning av supernatantens absorbans vid 540 nm med användning av en spektrofotometer.

MSC transplantation i en femoral osteokondral defekt modell

efter institutionell etisk granskning och godkännande (Institutional Animal Care and Use Committees of Fukui University, Institutionen för ortopedi och rehabiliteringsmedicin: godkännandenummer 25-053), kvinnliga athymic nakna råttor (F344/n Jcl rnu/rnu, CLEA Japan, Inc. Tokyo, Japan) i åldern 6-10 veckor och väger 150-170 gram fördelades slumpmässigt i följande grupper: (i) PA MSC (n = 6 djur); (ii) CD271+ MSC (n = 6 djur); (iii) en kontrollgrupp av Alfa Chondro Shield scaffold ensam (inga celler, n = 3 djur). Dessa antal djur per grupp har tidigare använts vid samma institut för att visa signifikanta skillnader mellan behandlingsgrupper på 5% – nivå48. Råttorna bedövades genom exponering för 3% isofluran i O2-gas och bibehölls vid 1,5% isofluran i O2-gas under operationen. Efter sterilisering av knäna med 70% etanol gjordes ett medialt parapatellärt hudinsnitt följt av dissekering genom muskeln och sedan exponering av knäleden genom lateral dislokation av patella. Bilaterala osteokondrala defekter med 2 mm diameter och 1 mm Djup skapades i patellarspåret i lårbenet hos varje djur med hjälp av en kirurgisk borr med 2 mm diameter. Alpha Chondro Shield användes som cellbäraren / byggnadsställning för att leverera 5 msk 104 pa MSC eller CD271+ MSC kontra inga celler (som kontroller). Före transplantationen skördades celler genom trypsinisering och såddes i en volym av 10 oc l av standardodlingsmedium på skivor med 2 mm diameter av Alfa Chondro Shield, inkuberades sedan i en fuktad atmosfär vid 37 oc C och 5% CO2 i 30 minuter för att främja cellhäftning och införlivande i ställningen. De cellfröna och kontrollställena transplanterades i defekterna och fixerades på plats med fibrinlim, vilket fick sätta i ca 10-20 sekunder (Fig. 6). Patella flyttades och bindväv och hud suturerades med nylon suturer. Djur fick röra sig fritt efter återhämtning och matade en standardunderhållsdiet och vatten ad libinum. Vid 3 veckor efter transplantation offrades djur genom överdosering av 3% isofluran för att undersöka omfattningen av sårreparation makroskopiskt och histologiskt.

makroskopisk poängering av brosksårläkning

efter exponering av knäleden hos offrade djur, fick defekten makroskopiskt poäng av två kirurger som var blinda för behandlingsarmen med hjälp av ett etablerat system för bedömning av brosksårläkning i mindre djurmodeller49. Graden av vävnadsreparation fick poäng från 0 poäng (bästa resultat) till 4 poäng (värsta resultat) vardera för: (1) färgen på reparationsvävnaden; (2) omfattningen av blodkärl som ses i reparationsvävnaden; (3) jämnheten på reparationsvävnadens yta; (4) i vilken utsträckning sårdefekten fylldes med reparationsvävnad; (5) omfattningen av degenerering av intilliggande ledbrosk. Poängen för varje kriterium lades till och graden av bästa reparation representerades med den lägsta poängen från en totalpoäng på 20.

histologisk poängsättning av brosksårläkning

efter kirurgisk excision fixerades djurknän i 10% neutralt buffrat formalin (Sigma) i 48 timmar och placerades i k-CX avkalkningslösning (FALMA, Tokyo, Japan) i 24-48 timmar vid 4 kg C. Efter detta tvättades råttknänna över natten i rinnande kranvatten, bearbetades och inbäddades i paraffinvaxblock redo för snittning. Vävnadssektioner skars med 5 mikron tjocklek i en Standard Roterande mikrotom och dessa färgades med hematoxylin och eosin (H&E) och toluidinblått före montering i DPX och histologisk undersökning. Omfattningen och kvaliteten på broskreparationen bedömdes histologiskt och oberoende av två examinatorer som använde Wakitani-poängsystemet36, modifierat för att inkludera ytterligare två parametrar, dvs. att undersöka förekomsten av blodkärl och främmande kroppsjätteceller (FBGCs). Följaktligen bestod poängsystemet av sju olika parametrar: (1) cellmorfologi; (2) matrisfärgning; (3) ytregularitet; (4) brosktjocklek; (5) integration av reparationsvävnaden med värdbrosk; (6) omfattningen av vaskularisering inom defekten; (7) omfattningen av FBGC-reaktion. För var och en av dessa parametrar representerade den lägsta poängen (0) den bästa reparationen och en högsta poäng (4) den värsta reparationen. De totala poängen tillsattes och jämfördes sedan mellan grupper av en totalpoäng på 21.

immunohistokemi för humant mitokondriellt antigen

vävnadssektioner färgades med en anti-human mitokondriell antigen (HMA) antikropp (klon 113-1: Abcam, Cambridge, Storbritannien) för att bedöma närvaron av humana MSC. Efter antigenhämtning nedsänktes sektionerna i tre förändringar av PBS och blockerades i 20 minuter med 2,5% hästserum (Vector Labs Ltd) vid rumstemperatur för att förhindra icke-specifik bindning. Sektionerna inkuberades sedan med musen anti-HMA-antikropp (1:400 utspädning i PBS) i 1 timme vid rumstemperatur i en fuktad kammare. Efter detta tvättades någon obunden antikropp i tre förändringar av PBS försiktigt och sektionerna inkuberades med biotinylerad anti-mus IgG i 30 minuter vid rumstemperatur. Sektionerna tvättades tre gånger i PBS och endogen peroxidiseringsaktivitet blockerades med användning av 0,3% väteperoxid i metanol i 30 minuter vid rumstemperatur. Under detta inkubationssteg bereddes Vecta ABC regent (Vector Labs Ltd, Peterborough, Storbritannien) och fick stå i 30 minuter före användning enligt tillverkarens instruktioner. Efter blockering av den endogena peroxidiseringsaktiviteten tvättades sektionerna i tre gånger PBS och inkuberades med ABC-reagenset i 30 minuter vid rumstemperatur. Efter detta tillsattes en DAB-kromogen (Vector labs) i 6-8 minuter beroende på önskad färgintensitet. Sektioner tvättades sedan och dehydratiserades genom serie etanol (70-100%), rensades med xylen och monterades i Pertex. Kondrogen pellet av humana MSC användes som en positiv kontroll. Negativ kontroll inkluderade kondrogen pellet där den primära antikroppen utelämnades.

Scanningelektronmikroskopi

vidhäftningen av MSCs sådd in i Alfa Chondro Shield scaffold före implantation undersöktes genom scanningelektronmikroskopi (SEM) enligt följande: efter att de cellfröna ställningarna hade inkuberats i en fuktad atmosfär vid 37 C och 5% CO2 i 30 minuter tvättades de i PBS och fixerades sedan i 2% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4) i 2 timmar och tvättades sedan i 0.1 M fosfatbuffert före behandling med 1% osmiumtetraoxid i 1 timme. Proverna dehydratiserades sedan genom en graderad serie etanollösning, behandlades med övergångslösningsmedel, t-butylalkohol i 30 minuter, frystorkades, belades med guld palladium och slutligen avbildades med hjälp av ett JSM-6390 (JEOL, Tokyo, Japan) eller Zeiss EVO10 scanningelektronmikroskop (Carl Zeiss, Cambridge, Storbritannien).

levande / död färgning för att analysera cellviabilitet i cellsådda ställningar

MSC-seedade ställningar färgades med levande/död färgningslösning enligt tillverkarens protokoll, som beskrivits tidigare 8. I korthet nedsänktes de cellfröna ställningarna i den levande / döda färgningslösningen i 30 minuter i mörkret vid 37 C. ställningarna avlägsnades sedan från färgningslösningen, tvättades i PBS och avbildades omedelbart med hjälp av ett konfokalt mikroskop (Leica Microsystems DM6000B – SP57CS).

in vitro-angiogenesanalyser

den mänskliga EA.hy926 endotelcellinjen användes som en modell för att undersöka någon angiogen aktivitet av odlingskonditionerat medium från PA MSC och CD271+ MSC CM. EA.hy926 endotelcellsproliferation / migration och bildning av endotelrör undersöktes enligt följande: (i) EA.hy926-celler odlades i standardodlingsmedium (DMEM/ F-12 kompletterat med 10% FBS, 1% penicillin och streptomycin) i 24 brunnsplattor i 2 dagar tills 100% sammanflytande monolager bildades. En steril pipettspets användes för att göra en repa i monoskiktet. Därefter tvättades brunnarna med sterila PBS och sedan tillsattes 1 ml konditionerat media från PA MSC-kulturer eller CD271+ MSC-kulturer i var och en av tredubbla brunnar per testat tillstånd. Serumfritt DMEM-odlingsmedium användes som kontroll. Plattan inkuberades i Cell IQ-plattformen för levande celldigitaliserad avbildning under en 2-dagarsperiod, varefter repsårstängning, livskraftiga cellnummer och omfattningen av migration av enskilda celler kvantifierades med hjälp av Cell IQ-bildanalysprogramvaran. Det proliferativa svaret från EA.hy926 endotelceller till PA MSC och CD271+ MSC konditionerat media (kontra serumfritt kontrollmedium) undersöktes också med användning av MTT-analysen; (ii) EA.hy926 endotel tubuli bildning testades med användning av tillväxtfaktorreducerad Matrigel (BD Bioscience), som alikvoterades i 96-brunnsplattor (50 oc Matrigel/brunn) och inkuberades sedan i 30 min vid 37 oc C. EA.hy926 endotelceller såddes på Matrigel vid 2 104-celler i 200-celler i 200-celler av PA MSC och CD271+ MSC-konditionerat medium eller serumfritt kontrollodlingsmedium. Plattorna inkuberades vid 37 kcal C i 1 dag, varefter de avbildades med hjälp av Cell IQ-bildplattform (3 bilder per brunn). Den totala endotel tubuli längd/bild och totalt antal endotel tubuli förgreningspunkter / bild mättes med hjälp av Cell IQ bild analysator programvara.

statistisk analys

statistisk analys utfördes med hjälp av GraphPad Prism6 programvara (GraphPad Software, Inc. CA, USA). För in vivo-experiment testades minst n = 3 djur per tillstånd. För in vitro-experiment utfördes n = 3-4 oberoende experiment för alla analyser, där data analyserades med envägs ANOVA när det fanns en variabel faktor och tvåvägs ANOVA när det fanns två variabla faktorer. För makroskopiska och histologiska poäng av broskreparation undersöktes skillnader mellan grupper med Dunns multipla jämförelsetester. Ett p-värde på mindre än 0,05 ansågs signifikant. Alla uppgifter har presenterats som medel för sms eller medel för SDS för SDS (såsom anges i figurlegenderna).