trecerea în serie a metastazelor pulmonare in vivo îmbogățește potențialul metastatic
linia PDX WU-BC3 a fost generată prin grefarea celulelor tumorale mamare de la un pacient cu TNBC metastatic în tampoanele de grăsime mamară umanizate (MFP) ale NOD/SCID șoareci șoareci.26,27 am proiectat aceste celule tumorale pentru a exprima în mod stabil Luciferaza Roșie a gândacului de clic (CBR-Luc), mCherry și un shRNA specific pentru p53 (shA2) pentru a crea linia PDX BC3_A2 (cunoscută anterior ca BC3-p53KD28) (Fig suplimentar. 1a). Am demonstrat că celulele tumorale au metastazat de la MFP la site-uri relevante fiziologic, inclusiv plămâni, ficat, os, creier și ganglioni limfatici.28 de metastaze pulmonare (P0) au fost izolate de la șoareci replicați, grupați și grefați în MFP-urile șoarecilor primitori. Metastazele pulmonare rezultate (P1) au fost izolate, grupate și grefate în MFP-urile șoarecilor suplimentari. Metastazele pulmonare de la acești șoareci (P2) au fost, de asemenea, colectate și grupate (suplimentar Fig. 1b). Am efectuat imagistica bioluminescenței (BLI) a plămânilor, oaselor și ficatului la necropsie pentru a cuantifica magnitudinea relativă a metastazelor la fiecare pasaj (Fig suplimentar. 1c). Passaging Serial îmbogățit pentru celulele tumorale cu capacitate crescută de a metastaza la toate site-urile (suplimentar Fig. 1d-f, h) și a cerut ca șoarecii să fie eutanasiați mai devreme (Fig. 1i). În schimb, tumorile de trecere în serie între MFP nu au dus la creșterea metastazelor pulmonare (Fig suplimentar. 1g), indicând faptul că dobândirea capacității metastatice îmbunătățite nu a fost pur și simplu o consecință a tumorilor care trec în serie in vivo. Mai mult, celulele tumorale cu capacitate metastatică îmbunătățită nu au prezentat o creștere semnificativă a proprietăților de creștere atunci când au fost izolate de MFP și plasate înapoi în MFP-urile șoarecilor primitori (Fig suplimentar. 1j). Luate împreună, aceste rezultate demonstrează că trecerea în serie a celulelor tumorale de la plămâni la MFP în acest model îmbogățește potențialul metastatic, dar nu și homing-ul specific organelor.
expresia genei mezenchimale este redusă în metastazele pulmonare în raport cu tumorile MFP
pentru a identifica modificările modelelor de expresie a genelor care însoțesc metastazele, am efectuat secvențierea ARN (RNAseq) pe metastazele pulmonare (P0 și P2) și tumorile MFP (P0 și P2) (Fig. 1a și tabelul suplimentar 1). După scăderea rnaseq citește maparea la transcriptomul mouse-ului, au fost utilizate doar citirile transcrierii umane pentru analizele din aval. Analiza componentelor principale (PCA) a evidențiat scăderea discordanței între replicile biologice cu treceri repetate in vivo, deoarece replicile biologice ale probelor tumorale P2 s-au grupat mai strâns între ele decât cu alte subpopulații analizate (Fig. 1b). Analiza de îmbogățire a setului de Gene (GSEA) a arătat că EMT a fost calea cea mai semnificativ reglată în jos atât în metastazele pulmonare P0, cât și în P2 în raport cu tumorile MFP (Fig. 1c). Semnalizarea TGF-XV, care reglează EMT, a fost, de asemenea, reglată semnificativ în jos atât în metastazele pulmonare P0, cât și în P2 (Fig. 1c).
semnăturile metastazelor pulmonare PDX identifică genele nereglementate în metastaze. o reprezentare schematică a tumorilor MPF și a metastazelor pulmonare izolate pentru RNAseq. B analiza componentelor principale (APC) din datele RNAseq generate de tumorile MFP și metastazele pulmonare utilizate în acest studiu. Fiecare punct de date reprezintă un eșantion de la un mouse individual. analiza căii c GSEA asupra semnăturii metastazelor pulmonare îmbogățite (P2); top 5 jos (albastru)- și în sus (roșu)procesele reglementate sunt afișate. NES, scor de îmbogățire normalizat. Casetele indică FDR <0.1 pentru semnificație statistică. Comploturile de îmbogățire pentru tranziția mezenchimală epitelială (EMT) și semnalizarea TGF-XV pentru p0 și P2 sunt prezentate în panoul din dreapta. p < 0.001 pentru EMT și TGF-semnalizare la p0 și P2. d analiza qRT-PCR a expresiei vimentinei în tumorile BC3_A2 MFP și subpopulațiile metastatice izolate din plămâni. Teste t asociate, p = 0,02 pentru plămânul P0, p < 0,001 pentru plămânul P2. Fiecare punct de date reprezintă un mouse. Bare de eroare reprezintă SEM de replicate biologice. A se vedea, de asemenea, Fig. 2. colorarea IHC a fost efectuată pe secțiunile de țesut indicate folosind un anticorp care recunoaște forma specifică umană a vimentinei. Barele de scară indică 100 de metri cubi. F parcelă cascadă care arată expresia genelor EMT în metastazele pulmonare P0 și P2 comparativ cu tumorile MFP corespunzătoare. valorile p sunt prezentate în tabelul suplimentar 1. Au fost incluse probe de la cel puțin trei șoareci independenți pentru analizele RNAseq
în timp real cantitativ (qRT-PCR) a fost efectuat pentru a monitoriza expresia vimentinei, un marker mezenchimal, în tumorile MFP și metastazele pulmonare pe parcursul trecerii în serie. Expresia vimentinei a prezentat un model dinamic cu expresie mai mare în tumorile MFP în raport cu metastazele pulmonare corespunzătoare la fiecare pasaj (Fig. 1D) și metastazelor hepatice la P0 (suplimentar Fig. 2a). Nivelurile de proteine Vimentin au recapitulat acest model dinamic (Fig. 1e). Genele EMT suplimentare au fost, de asemenea, reglate în jos în metastazele pulmonare în raport cu tumorile MFP corespunzătoare (Fig. 1f). Expresia markerului mezenchimal CDH2 (gena care codifică n-cadherina) a urmat același model ca vimentina (suplimentar Fig. 2b), în timp ce expresia markerului epitelial CDH1 (gena care codifică e-cadherina) a prezentat o tendință inversă (suplimentar Fig. 2c). Fibroblastele stromale umane Co-grefate au fost eliminate până la momentul recoltării tumorii (Fig suplimentar. 3a-f), excluzând posibilitatea ca acestea să contribuie la exprimarea markerilor mezenchimali în tumorile MFP. Luate împreună, aceste rezultate demonstrează că tumorile reglează expresia genelor mezenchimale odată stabilite în locurile metastatice.
determinarea complexității bibliotecii pentru câștigul mare de transfer al ecranului de funcții
un ecran de câștig de mare viteză (GOF) a fost conceput pentru a identifica driverele funcționale ale metastazelor din semnătura noastră de metastaze pulmonare P2. HOXA1, un driver cunoscut al metastazelor, 29 a servit ca un control pozitiv pentru optimizarea ecranului, iar GFP a fost folosit ca un control negativ. Celulele BC3_A2 au fost transduse cu lentivirus care codifică fie HOXA1, fie GFP, iar celulele tumorale infectate au fost amestecate în raporturi diferite (Fig suplimentar. 4a). Populațiile mixte de celule tumorale au fost apoi grefate în MFP-urile șoarecilor primitori, iar BLI a fost utilizat pentru a înscrie metastazele pulmonare la momentul necropsiei (Fig suplimentar. 4b). Într-un al doilea set de experimente, driverul metastatic ID19 a fost utilizat în combinație cu GFP, dar în acest caz populațiile mixte de celule tumorale au fost injectate în vena cozii șoarecilor primitori pentru a modela etapele finale ale metastazelor (Fig suplimentar. 4c). O creștere semnificativă a fluxului de fotoni a fost observată din tumorile cu un raport HOXA1: GFP sau ID1: GFP de 1:10. Aceste teste de complexitate au demonstrat că un driver de metastază de bună credință ar putea fi detectat pe ecranul nostru dacă ar fi combinat cu 9 cadre de citire deschise non-driver (ORFs), dar un grup de un șofer cu 19 non-șoferi ne-a mascat capacitatea de a detecta șoferul. Pe baza acestor rezultate, am limitat dimensiunea piscinei la 12 ORFs.
high throughput gain-of-function screening in vivo identifică driverele funcționale candidate ale metastazelor TNBC
pentru a determina care dintre genele reglate în sus din semnătura metastazelor pulmonare P2 au fost capabile să conducă metastazele pulmonare, am proiectat biblioteci lentivirale codificate cu bare personalizate care codifică ORFs din cele 230 de gene care au fost cele mai reglate în sus în metastazele pulmonare. ORF-urile au fost exprimate individual în celule BC3_A2, astfel încât fiecare linie celulară a exprimat un singur ORF, celulele au fost apoi grupate în grupuri de 12, iar bazinele au fost implantate în MFP-urile șoarecilor primitori (N = 10 șoareci pe bazin, Fig. 2a). O plasmidă de control care exprimă GFP a fost inclusă în fiecare grup pentru a măsura metastazele intrinseci în acest model TNBC. Fiecare ORF a fost asociat cu un cod de bare ADN unic. O peletă de referință a celulelor grupate a fost înghețată pentru a confirma reprezentarea egală a fiecărui ORF în momentul implantării tumorii. Treisprezece săptămâni au fost alese ca punct final al studiului, deoarece hoxa1, dar nu tumorile care exprimă GFP, metastazate la plămâni până la acest punct de timp (Fig suplimentar. 5a). Treisprezece săptămâni după grefare, plămânii au fost supuși BLI ex vivo (suplimentar Fig. 5a), leziunile metastatice au fost izolate, iar ADN-ul genomic (gDNA) a fost extras și utilizat ca șablon pentru qPCR pentru a amplifica regiunile unice de coduri de bare asociate cu fiecare ORF (Fig suplimentar. 5b). Tumorile MFP au fost, de asemenea, izolate și supuse acestor analize (Fig. 2a). Reprezentarea fiecărui ORF codificat în MFP în raport cu eșantionul de referință a fost determinată pentru fiecare grup (Fig. 2b; smochine suplimentare. 5c, d). Reprezentarea în plămân a fost apoi normalizată la îmbogățire în MFP vs. referința (Fig. 2b, c). Conducătorii metastazelor s-au separat în trei grupe, inclusiv cele îmbogățite atât în plămâni, cât și în MFP (Fig. 2B, cadranul din dreapta sus și suplimentar Fig. 5c), cele îmbogățite exclusiv în MFP (Fig. 2B, cadranul din dreapta jos) și cele îmbogățite exclusiv în plămâni (Fig. 2B, cadranul din stânga sus și Fig. 2c). Celulele care exprimă GFP au fost îmbogățite în metastaze pulmonare în unele bazine, iar scorul mediu de îmbogățire pentru GFP în plămâni a fost de aproximativ 5 (Fig suplimentar. 5e). Prin urmare, am folosit acest lucru ca o limită a scorului de îmbogățire pentru a defini un adevărat hit în ecranul nostru și am identificat 44 de gene care au fost îmbogățite selectiv în metastaze pulmonare în raport cu tumorile primare. Aceste hituri au fost clasate după scorul de îmbogățire (Fig. 2c și tabelul suplimentar 2). Printre primele cinci hituri, CEACAM5 a fost singurul a cărui expresie în tumorile primare a fost găsită pentru a prezice supraviețuirea slabă la pacienții cu cancer de sân (Fig suplimentar. 6a). Prin urmare, am investigat în continuare rolul funcțional al CEACAM5 în metastazele cancerului de sân.
screening-ul câștigului funcției de mare viteză in vivo identifică driverele funcționale ale metastazelor. un format schematică reprezentând utilizat pentru câștig-de-funcție (GOF) ecran. A se vedea, de asemenea, Fig. 5. ORF, deschideți cadrul de citire. Zece șoareci au fost implantați în fiecare cohortă. B grafic de dispersie care arată reprezentarea relativă a fiecărui ORF în tumorile MFP după normalizarea la referință (axa x) și în plămâni în raport cu tumorile MFP (axa y). Pentru cuantificarea datelor qPCR s-a utilizat metoda de calculare a numărului de QPCR. CEACAM5 este afișat în roșu. genele c îmbogățite în metastaze pulmonare, dar nu și tumorile MFP, au fost clasate în ordinea descrescătoare a îmbogățirii în plămâni. Linia punctată indică scorul de îmbogățire cutoff. A se vedea, de asemenea, Fig. 5 și tabelul suplimentar 2
confirmarea expresiei CEACAM5 îmbunătățite în modelele Pdx metastatice suplimentare
am constatat că expresia CEACAM5 a fost reglată dinamic, deoarece subpopulațiile metastatice au fost transmise în serie între plămâni și MFP in vivo (Fig. 3a), confirmând constatările din RNAseq (tabelul suplimentar 1 și Fig suplimentar. 6b). În mod similar, expresia CEACAM5 a fost mai mare în ficat (suplimentar Fig. 7a) și creier (suplimentar Fig. 7B) metastaze în raport cu tumorile MFP corespunzătoare. Nivelurile de proteine CEACAM5 au fost, de asemenea, mai mari în metastazele pulmonare comparativ cu tumorile MFP (Fig. 3b). Creșterea expresiei CEACAM5 în leziunile metastatice nu a fost dependentă de reducerea tăcerii p53 în această linie PDX, deoarece metastazele pulmonare din linia izogenă Pdx care exprimă tipul sălbatic p5326,30 au prezentat, de asemenea, niveluri mai ridicate de Expresie ale CEACAM5 (Fig suplimentar. 7c).
CEACAM5 este reglat în metastaze, iar expresia sa este invers corelată cu cea a vimentinei în modelele PDX ale TNBC. o expresie a CEACAM5 în tumorile MFP și leziunile metastatice ale șoarecilor grefați cu tumori BC3_A2 a fost determinată prin qRT-PCR. Teste t asociate, p < 0,001 pentru plămânul P0, tumora MFP P2 și plămânul P2. Fiecare punct reprezintă un mouse individual. Bare de eroare reprezintă SEM de replicate biologice. A se vedea, de asemenea, Fig. 7. tumorile MFP B și metastazele corespunzătoare de la șoareci grefați cu tumori BC3_A2 au fost analizate prin IHC folosind un anticorp CEACAM5. Barele de scară indică 100 de metri cubi. expresia C A CEACAM5 în tumorile MFP și leziunile metastatice ale șoarecilor grefați cu tumori PIM001-P a fost determinată prin qRT-PCR. Datele sunt prezentate pe o scară de jurnal. Pereche t-test, p < 0.001. Fiecare punct reprezintă un mouse individual. Bare de eroare reprezintă SEM de replicate biologice. tumorile MFP D și metastazele pulmonare corespunzătoare de la șoareci grefați cu tumori PIM001-P au fost analizate prin IHC folosind un anticorp CEACAM5. Barele de scară indică 100 de metri cubi. e, f IHC a secțiunilor de țesut tumoral serial de la șoareci grefați cu BC3_A2 (e) sau PIM001-P (f) colorate cu anticorpi specifici pentru CEACAM5 (panoul superior) sau vimentin. Barele de scară indică 100 de metri cubi. expresia G A CEACAM5 (panoul superior) sau vimentin (panoul inferior) a fost determinată într-un panou de linii celulare de cancer mamar. Bare de eroare reprezintă SEM de triplicate tehnice. h IHC a fost efectuat pentru a monitoriza P38 fosforilat în tumorile MFP și metastazele pulmonare ale șoarecilor BC3_A2. Barele de scală indică 100 mm
Un al doilea set de modele PDX de TNBC (PIM001) au fost evaluate pentru a determina dacă creșterea CEACAM5 în leziunile metastatice a fost o proprietate generală a metastazelor. Pim001-P a fost stabilit din tumora primară de tratament na la un pacient cu TNBC metastatic, în timp ce PIM001-M a fost stabilit din metastaza dermică de la același pacient. Celulele tumorale PIM001-P au fost proiectate pentru a exprima atât CBR-Luc, cât și mCherry și apoi au fost grefate în MFP-urile șoarecilor primitori. La momentul necropsiei, tumorile MFP și metastazele pulmonare au fost izolate. Expresia CEACAM5 a fost crescută la ambele niveluri de ARNm (Fig. 3c) și nivelurile de proteine (Fig. 3D) în metastazele pulmonare PIM001-P comparativ cu tumorile MFP corespunzătoare. Interesant este că nivelurile de proteine CEACAM5 au fost mai mari în tumorile PDX MFP stabilite din metastaza dermică a pacientului (PIM001-M) comparativ cu tumorile PDX MFP stabilite din tumora primară de sân (PIM001-P) (suplimentar Fig. 7d). În mod colectiv, aceste rezultate demonstrează că creșterea CEACAM5 este o proprietate comună a metastazelor în modelele PDX ale TNBC.
expresia CEACAM5 este invers corelată cu expresia vimentinei și fosforilarea p38
deoarece expresia CEACAM5 în modelele PDX a fost invers corelată cu expresia vimentinei (Fig. 1D, 3a; smochine suplimentare. 2a și 7a, b), imunohistochimia (IHC) a fost utilizată pentru a monitoriza metastazele pulmonare și tumorile MFP pentru niveluri relative de vimentin și CEACAM5. Nivelurile de proteine corelate cu nivelurile de ARNm în ambele modele PDX (Fig. 3e, f). Expresia vimentinei a fost, de asemenea, invers corelată cu expresia CEACAM5 într-un panou de linii celulare de cancer mamar (Fig. 3g). Proteina kinază specifică serinei/treoninei p38alpha (cunoscută și sub numele de MAPK14, denumită în continuare p38) este fosforilată în timpul EMT.31 interesant, P38 fosforilat (activ) s-a corelat cu niveluri ridicate de Expresie ale vimentinei în tumorile MFP, iar fosforilarea p38 a scăzut în metastazele pulmonare, unde nivelurile de vimentină au fost scăzute (Fig. 3h). În mod colectiv, aceste date demonstrează că expresia CEACAM5 este invers corelată cu expresia markerilor EMT în metastazele pulmonare.
supraproducția ectopică a CEACAM5 inhibă semnalizarea și exprimarea TGF-XV a markerilor EMT
având în vedere că expresia CEACAM5 corelată invers cu statusul mezenchimal, am evaluat dacă CEACAM5 a avut un rol direct în reglarea expresiei markerilor mezenchimali. BC3_A2 celule proiectate pentru a supraproduce CEACAM5 uman sau GFP ca un control negativ (Fig suplimentar. 8a, b) au fost examinate pentru exprimarea vimentinei și CDH2/n-cadherinei (markeri mezenchimali) și CDH1/e-cadherinei (marker epitelial). Supraexprimarea CEACAM5 a dus la creșterea expresiei CDH1 (suplimentar Fig. 8c) și scăderea expresiei CDH2 (suplimentar Fig. 8d) și vimentin (suplimentar Fig. 8e). În plus, supraproducția de CEACAM5 a redus și a întârziat fosforilarea mediată de TGF-XV a Smad – urilor în celulele BC3_A2 (Fig. 4A, c, suplimentar Fig. 9a) și fosforilarea p38 în ambele celule BC3_A2 (Fig. 4a, b, suplimentar Fig. 9a) și celulele MDA-MB-231 (suplimentar Fig. 8f, suplimentar Fig. 9b). În cele din urmă, supraproducția de CEACAM5 a întârziat EMT indusă de TGF-XV, evaluată prin expresia e-cadherin și vimentin (Fig. 4D, suplimentar Fig. 9c). Aceste rezultate sugerează că CEACAM5 reglează negativ EMT și identifică o funcție pentru CEACAM5 în metastazele cancerului de sân.
CEACAM5 supraproducția reglează în jos expresia markerilor mezenchimali și afectează semnalizarea TGF-colosal și afectează semnalizarea TGF-colosal. a BC3_A2 celulele proiectate pentru a supraproduce CEACAM5 sau GFP au fost cultivate în prezența sau absența a 1 ng/ml TGF-TGF-uri pentru perioadele de timp indicate. Lizații celulari au fost supuși la Western blotting pentru proteinele indicate. histograma B, C arată modificarea pliului (scara log) în starea de fosforilare a p38 (b) sau Smad2/3 (c) comparativ cu cea de la punctul de timp 0 pentru celulele care exprimă GFP. Bare de eroare reprezintă SEM de cel puțin trei experimente independente. D BC3_A2 celulele care exprimă GFP sau CEACAM5 au fost cultivate în prezența sau absența a 1 ng/ml TGF-TGF pentru perioadele de timp indicate. Lizații celulari au fost supuși la Western blotting pentru proteinele indicate. Toate rezultatele sunt reprezentative pentru cel puțin trei experimente independente. A se vedea, de asemenea, smochine suplimentare. 8 și 9
supraproducția CEACAM5 promovează creșterea metastatică și reduce EMT in vivo
EMT este asociată cu proliferarea celulară redusă.19 astfel, capacitatea CEACAM5 de a inhiba EMT a sugerat că poate funcționa pentru a promova creșterea tumorii în locurile metastatice. Pentru a testa această ipoteză, celulele BC3_A2 proiectate pentru a supraproduce CEACAM5 sau GFP (control) au fost injectate în venele cozii șoarecilor primitori pentru a monitoriza efectele supraproducției CEACAM5 asupra creșterii tumorii în plămâni. Supraexprimarea CEACAM5 a dus la creșterea creșterii tumorale în plămâni (Fig. 5a și suplimentare Fig. 10A), scăderea expresiei vimentinei la nivel proteic (suplimentar Fig. 10b) și scăderea fosforilării p38 (Fig. 5d, e). Reducerea nivelurilor CEACAM5 în BC3_A2 cu două shRNA-uri diferite (Fig. 5b) a avut efectul opus prin faptul că celulele transduse au crescut mai lent în plămâni decât celulele de control după injectarea venei cozii (Fig. 5c și suplimentar Fig. 10c). În plus, eliminarea CEACAM5 a dus la creșterea numărului de leziuni, dar la scăderea dimensiunii leziunii (Fig suplimentar. 10d, e). Aceste rezultate sugerează că tăcerea CEACAM5 promovează EMT și extravazarea celulelor tumorale, inhibând în același timp creșterea metastatică.
expresia CEACAM5 promovează creșterea metastazelor pulmonare. a BC3_A2 celulele care produc CEACAM5 sau GFP au fost injectate în venele cozii șoarecilor. BLI a fost utilizat pentru a cuantifica fluxul de fotoni în plămânii șoarecilor la punctele de timp indicate. Pereche t-test, p = 0,03. Barele de eroare reprezintă SEM de replici biologice (n = 5 șoareci pe grup). B BC3_A2 celulele care exprimă shRNA de control (shLuc) sau două shRNA diferite (#3 și #5) specifice pentru CEACAM5 au fost supuse qRT-PCR pentru a monitoriza expresia CEACAM5. Bare de eroare reprezintă SEM de triplicate tehnice. A se vedea, de asemenea, Fig. 10. celulele C BC3_A2 care exprimă shLuc sau două shrn-uri diferite CEACAM5 au fost injectate în venele cozii șoarecilor. BLI a fost utilizat pentru a cuantifica fluxul de fotoni în plămânii șoarecilor la punctele de timp indicate. Teste t asociate, p = 0,01 pentru sh # 3 și p < 0,001 pentru SH#5. Datele au fost normalizate la punctul de timp inițial și sunt prezentate pe o scară de jurnal. Barele de eroare reprezintă SEM de replici biologice (n = 5 șoareci pe grup). D BC3_A2 celulele care produc CEACAM5 în exces au fost injectate în venele cozii șoarecilor, iar plămânii au fost izolați și supuși IHC cu anticorpii indicați. Barele de scară indică 100 de metri cubi. celulele e colorante pozitive pentru CEACAM5, vimentin sau p-p38 în secțiunile de țesut reprezentate în panoul d au fost cuantificate utilizând sistemul automat de imagistică Vectra 3.0. Teste t asociate, p = 0,0008 pentru CEACAM5, p = 0,03 pentru vimentin și p = 0,03 pentru p-p38. Barele de eroare reprezintă SEM a cel puțin trei replici biologice independente. F ARN izolat din celulele BC3_A2 care produc în exces CEACAM5 sau GFP și cultivat fie in vitro, fie izolat din plămâni după injectarea venei cozii (in vivo, a, d) a fost supus analizei căii GSEA (stânga două coloane). Sunt afișate procesele top 5 reglate în jos (albastru) și top 5 reglate în sus (roșu). Casetele indică FDR <0.1 pentru semnificație statistică. NES (scor de îmbogățire normalizat). Semnificația acestor căi în tumorile P0 și P2 MFP vs. metastazele pulmonare corespunzătoare sunt prezentate pentru comparație (dreapta două coloane). Datele sunt reprezentate de triplicate biologice. A se vedea, de asemenea, Fig. 11
pentru a monitoriza modul în care supraproducția CEACAM5 a afectat expresia genei, celulele BC3_A2 proiectate pentru a supraproduce CEACAM5 sau GFP au fost cultivate in vitro sau izolate din plămâni după injectarea venei cozii (in vivo). ARN a fost izolat și supus RNAseq. S-a efectuat analiza expresiei genice diferențiale, iar GSEA a identificat EMT ca fiind singura cale caracteristică cancerului care a fost reglată semnificativ atât in vitro, cât și in vivo prin supraproducția CEACAM5 (Fig. 5f, suplimentar Fig. 11). Acest rezultat este similar cu cel observat în metastazele pulmonare P0 și P2 (Fig. 1c, 5f). În mod colectiv, aceste date au indicat faptul că reglarea în sus a expresiei CEACAM5 în leziunile metastatice induce MET și îmbunătățește creșterea celulelor tumorale metastatice în locurile secundare.
expresia CEACAM5 este reglată în sus în leziunile metastatice de la pacienții cu cancer de sân
în continuare, expresia CEACAM5 a fost evaluată în leziunile metastatice și țesutul tumoral mamar obținut de la pacienții cu cancer de sân. Colorația IHC pe un set de țesuturi potrivite constând dintr-o tumoare primară și o metastază pulmonară de la un pacient cu cancer de sân (tabelul suplimentar 3) a evidențiat niveluri mai mari de CEACAM5 în metastaza pulmonară în raport cu tumora primară de sân (Fig. 6a și suplimentare Fig. 12a). Pentru a extinde aceste analize, a microarray tisular (TMA) constând din metastaze pulmonare de la 25 de pacienți cu cancer de sân (smochine suplimentare. 12b, c și tabelul suplimentar 3) a fost colorat pentru CEACAM5 (suplimentar Fig. 12B), iar intensității colorației i s-a atribuit un scor (Fig. 6b). Această metodă de notare a fost aplicată și unui TMA din Atlasul proteic uman format din tumori de sân uman colorate pentru CEACAM5.32 majoritatea metastazelor pulmonare au exprimat niveluri ridicate de CEACAM5 (Fig. 6c) comparativ cu tumorile mamare (Fig. 6d), demonstrând că CEACAM5 a fost mai mare în leziunile metastatice comparativ cu tumorile mamare primare.
nivelurile de proteine CEACAM5 sunt crescute în leziunile metastatice ale pacienților cu cancer de sân și sunt invers corelate cu expresia vimentinei. a tumora primară și metastazele pulmonare corespunzătoare de la un pacient cu cancer de sân au fost supuse IHC pentru a monitoriza nivelurile CEACAM5. Barele de scară indică 100 de metri cubi. b un microarray de țesut tumoral (TMA) format din metastaze pulmonare de la 25 de pacienți cu cancer de sân a fost supus IHC cu un anticorp specific CEACAM5 și a fost marcată intensitatea colorării. Sunt afișate imagini reprezentative. Barele de scară indică 100 de metri cubi. c Sistemul de notare în b a fost aplicat la TMA constând din metastaze pulmonare de la 25 de pacienți cu cancer de sân pentru a evalua nivelurile relative de CEACAM5. d sistemul de notare în b a fost aplicat la un TMA din Atlasul proteic uman format din 25 de tumori mamare primare pentru a evalua nivelurile relative CEACAM5. e tumora primară și metastazele pulmonare corespunzătoare de la un pacient cu cancer de sân (de la a) au fost co-colorate pentru CEACAM5 și vimentin și analizate prin microscopie de imunofluorescență. Barele de scară indică 100 de metri cubi. celulele f colorante pozitive pentru CEACAM5, vimentin sau ambele în secțiunile de țesut reprezentate în e au fost cuantificate utilizând sistemul automat de imagistică Vectra 3.0. TMA constând din metastaze pulmonare de la 25 de pacienți cu cancer de sân a fost co-colorată pentru CEACAM5 și vimentin și analizată prin microscopie de imunofluorescență. Sunt afișate imagini reprezentative. Barele de scară indică 100 de metri cubi. celulele h colorante pozitive pentru CEACAM5, vimentin sau ambele în secțiunile de țesut prezentate în g au fost cuantificate utilizând sistemul automat de imagistică Vectra 3.0. A se vedea, de asemenea, Fig. 12
am evaluat apoi setul de țesut potrivit pentru coexprimarea CEACAM5 și vimentin. Co-colorarea pentru CEACAM5 și vimentin a evidențiat niveluri mai ridicate de CEACAM5 în metastaza pulmonară în raport cu tumora de sân potrivită, iar modelul de colorare inversă a fost observat pentru vimentin (Fig. 6e, f). În plus, o populație minoră de celule tumorale a prezentat co-colorare atât pentru CEACAM5, cât și pentru vimentin (Fig. 6f). Acele celule care colorează pozitiv pentru ambele proteine pot reprezenta celule într-o stare hibridă EMT/MET.33 TMA constând în metastaze pulmonare de la 25 de pacienți cu cancer de sân a demonstrat, de asemenea, o corelație inversă între ceacam5 și colorarea vimentinei (Fig. 6g, h; smochine suplimentare. 12a-e). Aceste rezultate au confirmat concluziile realizate cu modelele noastre PDX de TNBC și au demonstrat că expresia CEACAM5 este invers corelată cu expresia vimentinei în tumorile mamare primare și leziunile metastatice. Luate împreună, aceste rezultate sugerează că CEACAM5 promovează MET pentru a facilita creșterea tumorii la locurile metastatice (figura suplimentară 12a, b).
