toate metodele din studiile umane și animale au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările instituționale relevante.

izolarea și cultura MSC-urilor aderente din plastic și a MSc-urilor IMUNOPOZITIVE CD271 din țesutul adipos

În urma aprobării etice din partea Autorității Naționale de cercetare a sănătății (NHS) (lrec numărul 12/EE / 0136) și a consimțământului informat al tuturor donatorilor, MSC-urile PA și MSC-urile CD271+ au fost izolate de AT care au fost recoltate ca deșeuri chirurgicale. AT a fost tocat și tratat cu 0.3 U/ml de colagenază (Sigma, Dorset UK) timp de două ore la 37 CTC, după care s-a adăugat mediul vultur modificat Dulbecco (DMEM) suplimentat cu 20% (v/v) ser fetal de vițel (FCS) și 1% (v/v) penicilină și streptomicină (toate din PAA, Yeovil, Somerset, UK) și preparatul digerat centrifugat la 600 g timp de 10 minute. Peletul rezultat a fost Re-suspendat în DMEM suplimentat cu 10% (v/v) FCS și 1% (v/v) penicilină și streptomicină, adică mediu de cultură standard și trecut printr-un filtru de celule de 100 de metri cubi (bd Biosciences, Berkshire, MAREA BRITANIE). Filtratul a fost Re-centrifugat la 600 g timp de 10 minute și celulele granulate au fost Re-suspendate în mediu de cultură standard de 5 ml și trecute printr-o strecurătoare de celule de 40 mm. Suspensia celulară rezultată a fost apoi tratată cu tampon de liză eritrocitară (Miltenyi Biotech, Surrey, UK) timp de 10 minute la temperatura camerei. Pentru fiecare preparat AT, MSC-urile au fost izolate din celulele mononucleate prezente după Liza eritrocitelor prin aderența lor crescută la cultura tisulară plastic8 sau prin sortarea celulelor asociate magnetic (Mac) pentru IMUNOPOZITIVITATEA CD27114. Aceste celule au fost cultivate în mediu de cultură standard, într-o atmosferă umidificată la 37 C, cu trecerea de rutină prin tripsinizare la confluență de 80%. MSC-urile PA și CD271+ MSC-urile la pasajele II-III au fost utilizate pentru toate experimentările ulterioare. Citometria în flux a fost utilizată pentru a evalua îmbogățirea pentru celulele CD271+ (folosind tehnologia MACS), unde celulele proaspăt izolate au fost stocate la -80 CTC peste noapte după izolare, apoi dezghețate și imediat imunosteinizate pentru CD271; pentru toate probele, >90% din celule au fost IMUNOPOZITIVE CD271 în acest moment (datele nu sunt prezentate).

protocoale de diferențiere in vitro

capacitatea de diferențiere a PA și CD271+ MSc de a forma osteocite, condrocite și adipocite a fost evaluată conform descrierii anterioare8,45. Pe scurt, pentru osteogeneză, culturile monostrat de MSC au fost tratate cu dexametazonă de 10 nM, acid ascorbic de 50 ng/ml și beta glicerofosfat de 1 mM (față de controalele purtătoare) la fiecare 2-3 zile pentru o perioadă de 4 săptămâni, după care culturile au fost recoltate prin fixare și colorate pentru activitatea fosfatazei alcaline după cum urmează: celulele au fost fixate cu formalină tampon neutră 10% Timp de 10 minute. Între timp, soluția de colorare a fost preparată prin plasarea a 25 mg de naftol-fosfat (naftol as-MX fosfat: Sigma) în 0,5 ml de dimetil formamidă. Această soluție a fost amestecată cu 50 ml tampon Tris-HCl de 0,2 m conținând 50 mg TR roșu rapid (Sigma). După amestecarea bine, soluția finală a fost filtrată folosind hârtie de filtru Whatman No. 1 (Whatman). Soluția fixativă a fost apoi îndepărtată și celulele au fost spălate cu PBS, apoi 1 ml de soluție de colorare a fost adăugată la fiecare godeu timp de 1 oră. în cele din urmă, pata a fost îndepărtată și imaginile digitalizate au fost capturate cu un microscop inversat. Diferențierea de-a lungul liniei osteogene a fost evaluată în continuare prin creșterea cantității de activitate a fosfatazei alcaline în celulele diferențiate comparativ cu celulele nediferențiate folosind un kit disponibil în comerț (Biovision, SUA) și urmând protocolul producătorului; pe scurt, celulele au fost omogenizate în tamponul de testare. Celulele omogenizate au fost apoi centrifugate pentru a îndepărta materialul insolubil la 13.000 g timp de 3 minute. Apoi, 80 de centicli din fiecare probă au fost încărcați în puțuri separate ale unei plăci de 96 de puțuri. Apoi s-au adăugat 50 unqql de 5 mM de soluție pNPP la fiecare sondă de probă. În urma unei etape de amestecare prin pipetare în sus și în jos, puțurile au fost incubate la 25 centi C timp de 60 de minute. S-a generat o curbă standard prin diluarea a 40 oktil de 5 mM pNPP în 160 oktil de tampon de testare pentru a genera un standard pNPP de 1 mM. Apoi, 0, 4, 6, 12, 16 și 20 unqtl din această soluție standard a fost încărcată într-o placă de 96 de puțuri pentru a genera standarde pNPP de 0-20 nmol/ml care ar putea fi măsurate prin spectrofotometrie. Pentru condrogeneză, s-au preparat pelete celulare în DMEM/glucoză ridicată (Sigma) suplimentată cu 100 nM dexametazonă (DEX), 37.5 hectolitri / ml ascorbat-2-fosfat, 1% (vol/vol) insulină, transferină și seleniu (ITS-X100; Sigma) și 10 ng/ml factor de creștere transformant-inkts1 (TGF-inkts1) (PeproTech, Londra, Marea Britanie) și penicilină și streptomicină. Culturile martor au fost tratate cu DMEM / medii cu conținut ridicat de glucoză numai cu purtători, adică metanol, apă sterilă și BSA la diluții adecvate. În ziua 28, diferențierea condrogenică a fost examinată histologic prin fixarea peletelor în formalină tamponată neutră 10%, apoi încorporarea în parafină și tăierea secțiunilor de țesut, care au fost colorate cu albastru de toluidină (Sigma) ca marker al sintezei proteoglicanului8. În plus, nivelul glicozaminoglicanului secretat în mediul de diferențiere în ultimele 24 de ore de cultură înainte de recoltare în ziua 28 a fost măsurat folosind testul DMMB. Protocolul de testare DMMB a fost adaptat din metoda Farndale și colab., 1986 după cum urmează46: (i) soluția de colorant DMMB a fost preparată prin adăugarea 3.04 g de glicină, 2,37 g de NaCl și 16 mg de 1,9 DMMB la 1 litru de apă deionizată; (ii) pH-ul a fost ajustat la 3,0 cu acid clorhidric și soluția de colorant a fost depozitată într-o sticlă brună; (iii) 50 de alicote de mediu de cultură de pe schelele însămânțate cu celule în ziua 28 au fost adăugate în trei exemplare pe o placă de 96 de a fost evaluat imediat la 540 nm. Sulfatul de condroitină (CS) din cartilajul de rechin (Sigma) a fost utilizat pentru a asigura o curbă standard de absorbanță (0-40%/ml, CS) din care s-a calculat conținutul de GAG în probele de mediu de cultură. Nivelurile de absorbanță pentru conținutul de GAG în probele de mediu de cultură au fost normalizate pentru a ține cont de absorbanța de fond rezultată din prezența roșu fenol în mediu prin dizolvarea standardelor în mediu DMEM. Pentru adipogeneză, culturile MSC au fost menținute în medii de cultură conținând 1 DEX, 0.5 mM 3-izobutil-metilxantină (Sigma), 1% insulină, transferină și seleniu (preamestecul ITS-X 100; PAA) și 100 indometacin (Sigma), timp de 28 de zile la 37 C și 5% CO2, așa cum s-a descris anterior47. Celulele de Control au fost menținute în medii complete cu purtători. Diferențierea a fost examinată folosind ulei roșu o colorarea picăturilor lipidice. Celulele au fost fixate în formalină tampon neutră 10% timp de 1 oră după care s-a adăugat soluția de colorare. Acumularea relativă de ulei roșu O a fost măsurată după tratamentul cu 100% izopropanol timp de 15 minute și citirea absorbanței supernatantului la 540 nm folosind un spectrofotometru.

transplantul MSC într-un model de defect osteochondral femural

În urma revizuirii și aprobării etice instituționale (comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Fukui, Departamentul de Ortopedie și Medicină de reabilitare: Numărul de aprobare 25-053), femele atimice nud șobolani (F344/N Jcl rnu / rnu, CLEA Japan, Inc. Tokyo, Japonia) în vârstă de 6-10 săptămâni și cântărind 150-170 grame au fost repartizate aleatoriu în următoarele grupuri: (i) MSC PA (n = 6 animale); (ii) CD271+ MSC (n = 6 animale); (iii) un grup de control al schelei Alpha Chondro Shield singur (fără celule, n = 3 animale). Aceste numere de animale pe grup au fost utilizate anterior la același institut pentru a demonstra diferențe semnificative între grupurile de tratament la nivelul de 5% 48. Șobolanii au fost anesteziați prin expunerea la 3% izofluran în gazul O2 și menținuți la 1,5% izofluran în gazul O2 în timpul intervenției chirurgicale. După sterilizarea genunchilor folosind 70% etanol, s-a făcut o incizie parapatelară mediană a pielii urmată de disecția prin mușchi și apoi expunerea articulației genunchiului prin dislocarea laterală a rotulei. Defectele osteochondrale bilaterale cu diametrul de 2 mm și adâncimea de 1 mm au fost create în canelura patelară a femurului fiecărui animal folosind un burghiu chirurgical cu diametrul de 2 mm. Alpha Chondro Shield a fost folosit ca purtător de celule/schelă pentru a livra 5 MSC-uri de 104 pa sau MSC-uri CD271+ față de celule no (ca controale). Înainte de transplant, celulele au fost recoltate prin tripsinizare și însămânțate într-un volum de mediu de cultură standard de 10 ilqtl pe discuri cu diametrul de 2 mm ale scutului Alpha Chondro, apoi incubate într-o atmosferă umidificată la 37 ilct C și 5% CO2 timp de 30 minute pentru a promova aderența celulară și încorporarea în schelă. Schelele însămânțate cu celule și de control au fost transplantate în defecte și fixate în poziție cu adeziv de fibrină, care a fost lăsat să se fixeze timp de aproximativ 10-20 de secunde (Fig. 6). Patella a fost relocată, iar țesutul conjunctiv și pielea au fost suturate cu suturi de nailon. Animalelor li s-a permis să se miște liber după recuperare și au hrănit o dietă standard de întreținere și apă ad libinum. La 3 săptămâni post-transplant, animalele au fost sacrificate prin supradozaj de izofluran 3% pentru a examina gradul de reparare a plăgii macroscopic și histologic.

scor Macroscopic al vindecării rănilor cartilaginoase

după expunerea articulației genunchiului la animalele sacrificate, defectul a fost marcat macroscopic de doi chirurgi care au fost orbiți la brațul de tratament folosind un sistem stabilit pentru evaluarea vindecării rănilor cartilaginoase la modelele animale mai mici49. Gradul de reparare a țesuturilor a fost marcat de la 0 Puncte (cel mai bun rezultat) la 4 puncte (cel mai rău rezultat) fiecare pentru: (1) culoarea țesutului reparator; (2) întinderea vaselor de sânge observate în țesutul reparator; (3) netezimea suprafeței țesutului reparator; (4) măsura în care defectul plăgii a fost umplut cu țesut reparator; (5) Gradul de degenerare a cartilajului articular adiacent. Au fost adăugate punctele obținute pentru fiecare criteriu, iar gradul de cea mai bună reparație a fost reprezentat cu cel mai mic scor dintr-un scor total de 20.

punctajul histologic al vindecării plăgilor cartilaginoase

în urma exciziei chirurgicale, genunchii animalelor au fost fixați în formalină tamponată neutră 10% (Sigma) timp de 48 de ore și plasați în soluție de decalcifiere K-CX (FALMA, Tokyo, Japonia) timp de 24-48 ore la 4 ct. După aceasta, genunchii șobolanului au fost spălați peste noapte în apă curentă de la robinet, prelucrați și încorporați în blocuri de ceară de parafină gata de secționare. Secțiunile de țesut au fost tăiate la o grosime de 5 microni într-un Microtom Rotativ standard și acestea au fost colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) și albastru de toluidină înainte de montarea în DPX și examenul histologic. Amploarea și calitatea reparației cartilajului au fost evaluate histologic și independent de către doi examinatori utilizând sistemul de notare Wakitani36, modificat pentru a include doi parametri suplimentari, adică. pentru a examina prezența vaselor de sânge și a celulelor gigantice ale corpului străin (FBGCs). Prin urmare, sistemul de notare cuprindea șapte parametri diferiți: (1) morfologia celulară; (2) colorarea matricei; (3) regularitatea suprafeței; (4) grosimea cartilajului; (5) integrarea țesutului reparator cu cartilajul gazdă; (6) gradul de vascularizare în defect; (7) gradul de reacție FBGC. Pentru fiecare dintre acești parametri, cel mai mic scor (0) a reprezentat cea mai bună reparație, iar cel mai mare scor (4) a reprezentat cea mai proastă reparație. Scorurile generale au fost adăugate și apoi comparate între grupuri dintr-un scor total de 21.

imunohistochimie pentru antigenul mitocondrial uman

secțiunile de țesut au fost colorate cu un anticorp antigen mitocondrial anti-uman (HMA) (clona 113-1: Abcam, Cambridge, Marea Britanie) pentru a evalua prezența MSC-urilor umane. După recuperarea antigenului, secțiunile au fost scufundate în trei modificări ale PBS și blocate timp de 20 de minute cu 2,5% ser de cal (Vector Labs Ltd) la temperatura camerei pentru a preveni legarea nespecifică. Secțiunile au fost apoi incubate cu anticorpul anti-HMA de șoarece (1:400 diluție în PBS) timp de 1 oră la temperatura camerei într-o cameră umidificată. După aceasta, orice anticorp nelegat a fost spălat ușor în trei modificări ale PBS și secțiunile au fost incubate cu IgG anti-șoarece biotinilat timp de 30 de minute la temperatura camerei. Secțiunile au fost spălate de trei ori în PBS și activitatea endogenă de peroxidare a fost blocată folosind 0,3% peroxid de hidrogen în metanol timp de 30 de minute la temperatura camerei. În timpul acestei etape de incubare, Vecta ABC regent (Vector Labs Ltd, Peterborough, Marea Britanie) a fost pregătit și a fost lăsat să stea timp de 30 de minute înainte de utilizare, conform instrucțiunilor producătorului. După blocarea activității endogene de peroxidare, secțiunile au fost spălate de trei ori PBS și incubate cu reactivul ABC timp de 30 de minute la temperatura camerei. După aceasta, a fost adăugat un cromogen DAB (Vector labs) timp de 6-8 minute, în funcție de intensitatea culorii dorite. Secțiunile au fost apoi spălate și deshidratate prin serii de etanol (70-100%), curățate cu xilen și montate în Pertex. Peleta condrogenică a MSc-urilor umane a fost utilizată ca un control pozitiv. Controlul negativ a inclus pelete condrogenice în care anticorpul primar a fost omis.

microscopie electronică de scanare

aderența MSC-urilor însămânțate în Schela scutului Alfa Chondro înainte de implantare a fost examinată prin microscopie electronică de scanare (sem) după cum urmează: după ce schelele însămânțate cu celule au fost incubate într-o atmosferă umidificată la 37 C și 5% CO2 timp de 30 de minute, acestea au fost spălate în PBS și apoi fixate în 2% glutaraldehidă în tampon fosfat de 0,1 M (pH 7,4) timp de 2 ore, apoi spălate în 0.Tampon fosfat de 1 M înainte de tratamentul cu tetraoxid de osmiu 1% timp de 1 oră. Probele au fost apoi deshidratate printr-o serie gradată de soluție de etanol, tratate cu solvent de tranziție, alcool t-butilic timp de 30 de minute, liofilizate, acoperite cu paladiu auriu și în cele din urmă imaginate folosind un microscop electronic de scanare JSM-6390 (JEOL, Tokyo, Japonia) sau Zeiss EVO10 (Carl Zeiss, Cambridge, Marea Britanie).

colorare viu/mort pentru a testa viabilitatea celulară în schele însămânțate cu celule

schelele însămânțate cu MSC au fost colorate cu soluție de colorare viu / mort conform protocolului producătorului, așa cum s-a descris anterior8. Pe scurt, schelele însămânțate cu celule au fost scufundate în soluția de colorare vie/moartă timp de 30 de minute în întuneric la 37 de centi C. schelele au fost apoi îndepărtate din soluția de colorare, spălate în PBS și imediat imaginate folosind un microscop confocal (Leica Microsystems DM6000B – SP57CS).

teste de angiogeneză in vitro

EA umană.linia celulară endotelială hy926 a fost utilizată ca model pentru examinarea oricărei activități angiogene a mediului condiționat de cultură din PA MSC și CD271 + MSC CM. EA.proliferarea/migrarea celulelor endoteliale hy926 și formarea tubulilor endoteliali au fost examinate după cum urmează: (i) EA.celulele hy926 au fost cultivate în mediu de cultură standard (DMEM/ F-12 suplimentat cu 10% FBS, 1% penicilină și streptomicină) în 24 de plăci de sondă timp de 2 zile până la formarea monostraturilor confluente 100%. Un vârf steril de pipetă a fost folosit pentru a face o zgârietură în monostrat. Ulterior, puțurile au fost spălate cu PBS sterile și apoi 1 ml de mediu condiționat din culturi PA MSC sau culturi CD271 + MSC a fost adăugat în fiecare dintre puțurile triplicate pentru fiecare condiție testată. Mediul de cultură DMEM fără ser a fost utilizat ca martor. Placa a fost incubată în platforma cell IQ pentru imagistica digitalizată cu celule vii pe o perioadă de 2 zile, după care închiderea plăgii zgâriate, numerele de celule viabile și gradul de migrare a celulelor individuale au fost cuantificate folosind software-ul de analiză a imaginii cell IQ. Răspunsul proliferativ al EA.celulele endoteliale hy926 la mediile condiționate PA MSC și CD271+ MSC (comparativ cu mediul de control fără ser) au fost, de asemenea, examinate folosind testul MTT; (ii) EA.formarea tubulilor endoteliali hy926 a fost testată folosind Matrigel redus cu factor de creștere (bd Bioscience), care a fost alicotat în plăci cu 96 de godeuri (50 ilct/godeu) și apoi incubat timp de 30 min la 37 ilct C. EA.celulele endoteliale hy926 au fost însămânțate pe Matrigel la 2 0,104 celule/sondă în 200 unqq de mediu condiționat PA MSC și CD271+ MSC sau mediu de cultură martor fără ser. Plăcile au fost incubate la 37 CTC timp de 1 zi, după care au fost imaginate folosind platforma de imagistică cell IQ (3 imagini pe godeu). Lungimea/imaginea totală a tubului endotelial și numărul total de puncte/imagine de ramificare a tubului endotelial au fost măsurate cu ajutorul software-ului Cell IQ image analyser.

analiza statistică

analiza statistică a fost realizată cu ajutorul software-ului GraphPad Prism6 (GraphPad Software, Inc. CA, STATELE UNITE ALE AMERICII). Pentru experimentele in vivo, au fost testate minimum n = 3 animale per condiție. Pentru experimentele in vitro, s-au efectuat n = 3-4 experimente independente pentru toate analizele, în care datele au fost analizate cu Anova unidirecțională când a existat un factor variabil și ANOVA bidirecțională când au existat doi factori variabili. Pentru scorurile macroscopice și histologice ale reparației cartilajului, diferențele dintre grupuri au fost examinate folosind testele de comparație multiple ale Dunn. O valoare p mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă. Toate datele au fost prezentate sub formă de mijloace SEMs sau SEMS (conform indicațiilor din figura legends).